Co-Fermentation von Marsdenia tenacissima mit Ganoderma lucidum und Anti-Lungenkrebs-Wirkung der Fermentationsprodukte

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Etablierung eines systematischen und umfassenden Co-Fermentationssystems zur Herstellung von Biotransformationsprodukten, die reich an scharfen Saponinen sind, unter Verwendung von Marsdenia tenacissima (Roxb). Wight et Arn. (MT) als Fermentationsmedium für Ganoderma lucidum. Dies wird als methodische Referenz für die Entwicklung anderer ethnischer Drogen dienen.

Zusammenfassung

Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT) hat als traditionelles chinesisches und Dai-Kräuterarzneimittel entzündungshemmende, antibakterielle und antitumorale Eigenschaften. Die meisten seiner Hauptwirkstoffe sind jedoch Aglykone, wie Tenacigenin A und Tenacigenin B. Da die Bioverfügbarkeit von MT gering ist und ihre medizinischen Wirkstoffe schwierig zu synthetisieren sind, wird sie hauptsächlich durch Biotransformation untersucht. Ziel dieser Studie ist es, Biotransformationsprodukte herzustellen, die reich an scharfen Saponinen sind, indem MT als Fermentationsmedium für Ganoderma lucidum (G. lucidum) verwendet wird.

Durch das vorläufige Screening von drei Heilpilzen wurde festgestellt, dass G. lucidum und Ophiocordyceps sinensis (O. sinensis) im Allgemeinen im Medium für MT wachsen können; Daher wurde die Wirksamkeit der Fermentation der beiden Pilzarten anhand eines Mausmodells für Lungenkrebs untersucht. Schließlich wurde die Co-Fermentation von G. lucidum und MT für weitere Untersuchungen ausgewählt. Eine Non-Target-Metabolomik-Analyse wurde an den Produkten von MT mit G. lucidum-Co-Fermentation durchgeführt. Wir identifizierten 12 spezifische Saponine von MT aus den Fermentationsprodukten und erhielten eine monomere Verbindung, Tenacigenin A, aus Fermentationsprodukten.

Der größte Teil des Tenacigenins zeigte einen signifikanten Aufwärtstrend durch die Tenacigenin A- und Tenacigenin B-Spiegel. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die Wirksamkeit von MT nach der Fermentation mit G. lucidum verbesserte. Darüber hinaus war die Biotransformation von C₂₁ steroidalen Glykosiden in MT die zentrale Reaktion in diesem Fermentationsprozess. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie ein systematisches und umfassendes Co-Fermentationssystem und eine pharmakodynamische Bewertungsmethode für MT etablierte, die nicht nur die volle Ausnutzung wirksamer Wirkstoffe in MT verbesserte, sondern auch eine methodische Referenz für die Entwicklung anderer ethnischer Arzneimittel lieferte.

Einleitung

Lungenkrebs gehört in der traditionellen chinesischen Medizin zur Kategorie des "Lungenkarbunkels". Die Pathogenese des Lungenkarbunkels ist eine Schwäche des gesunden "Qi" der Patienten, ein Ungleichgewicht von Yin und Yang, Toxine und Stagnation in der Lunge, was zu Lungenfunktionsstörungen, Blutblockaden und Flüssigkeitsverlust in der Lunge führt. So bilden langfristige Blutstauungen und Auswurfgifte in der Lunge eine Lungenmasse¹. Daher ist die Stärkung des Qi und die Beseitigung pathogener Faktoren das Grundprinzip der Behandlung von Lungenkrebs. Die Methoden der Yin-Ernährung, um Yin und Yang auszugleichen, der Wärmereinigung, der Entgiftung und Zerstreuung von Stagnation, der Ergänzung des Qi und des nährenden Yin sowie der Beseitigung von Schleim werden zur Behandlung und Vorbeugung der Bildung von Lungenkarbunkeln eingesetzt².

Marsdenia tenacissima (MT) ist eine Heilpflanze aus der Familie der Asclepiadaceae (Marsdenia ssp.), auch bekannt als Wuguteng. Es wirkt auf die Reinigung von Hitze und Entgiftung, lindert Husten und Asthma und hat antitumorale Eigenschaften³. Die Xiaoaiping-Injektion, ein Präparat, das aus einem einzigen Kraut der MT hergestellt wird, ist in Kliniken weit verbreitet und zeigt eine gute therapeutische Wirkung gegen Krebs⁴. Mit dem Bevölkerungswachstum ist die Nachfrage nach MT jedoch stark gestiegen. Dementsprechend ist das Angebot an wilden MT-Ressourcen unzureichend und die Qualität der angebauten medizinischen Materialien ist ungleichmäßig. Es gibt Probleme wie schlechte Qualität der Kräutermaterialien, instabile Inhaltsstoffe und geringe Bioverfügbarkeit, die die Entwicklung von MT ernsthaft bedrohen. Unter diesen bioaktiven Verbindungen sind die Saponine aus der MT stark untersucht. Mehr als 100 Saponine aus MT wurden identifiziert; Sie können in zwei Haupttypen unterteilt werden: (1) C₂₁ steroidale Glykoside in MT, einschließlich Tenacissosid A-P, Marsdenosid A-M, Tenacigenosid A-L und Tenacigenin A-D. (2) Pentacyclische Triterpene wie Oleanolsäure und Ursolsäure. Viele Studien haben gezeigt, dass die krebshemmende Aktivität von Erdöletherextrakten höher ist als die der hochpolaren Moleküle aus MT. Daher ist es vorteilhaft, das Hauptpolysaccharid der Saponine aus MT in ein anderes Nebenpolysaccharid von MT mit höherer Bioverfügbarkeit und Bioaktivität umzuwandeln⁵.

Die Biotransformation, auch Biokatalyse genannt, bezieht sich auf die physiologischen und biochemischen Reaktionen der Umwandlung oder strukturellen Modifikation exogener Substrate unter Verwendung verwandter Enzyme in biologischen Systemen⁶. Sie ist wirtschaftlicher, sicherer, regional selektiver und stereoselektiver als die traditionelle chemische Synthese und kann einige bioaktive Verbindungen herstellen, die mit der herkömmlichen synthetischen Chemie nur schwer herzustellen sind ^7,8. Daher ist die Entwicklung der traditionellen chinesischen Medizin und der natürlichen Arzneimittel unerlässlich, um die Modernisierung und Internationalisierung der traditionellen chinesischen Medizin zu fördern.

Das Co-Fermentationssystem der MT wurde durch Biotransformation etabliert. Die ursprünglichen medizinischen Materialien wurden durch mikrobielle Enzymsysteme transformiert. Zum einen wurde der Extrakt der MT als Substrat verwendet, um in diesem Modus die Fermentationskultur von Pilzen herzustellen. Gleichzeitig verkürzte die Pilzfermentation den Zuchtzyklus von Bakterien, senkte die Produktionskosten und verbesserte die Produktionseffizienz⁹. Vorteilhaft ist hingegen die vermehrte Ausfällung von Wirkstoffen durch Pilzfermentation, die chemische Komponenten produziert und eine verbesserte Wirksamkeit^{aufweist 10}. Die Verwendung der flüssigen Zwei-Wege-Fermentationstechnologie ist hilfreich, um die Wirkstoffe von medizinischen Materialien zu schützen, die Wirksamkeit zu verbessern, Arzneimittelquellen zu schonen und eine bessere Wirksamkeit zu erzielen, indem Techniken zur strukturellen Modifikation von Wirkstoffen von Kräutermaterialien bereitgestellt werden. Es ist von großer Bedeutung, den Modernisierungsgrad der traditionellen chinesischen Medizin zu verbessern.

In dieser Studie wurden G. lucidum, O. sinensis und Inonotus obliquus (I. obliquus) als Fermentationsmikroorganismen in einem frühen Stadium nach der Literaturrecherche ausgewählt und die Stämme vorläufig gescreent. Anschließend wurden die endgültigen Fermentationsstämme bestimmt, indem die Wirksamkeit der gescreenten Stämme durch das Tumormausmodell untersucht wurde. Schließlich wurden die Primärmetaboliten und Sekundärmetaboliten der Fermentationsprodukte systematisch mittels LC-MS analysiert und bewertet, und wir erhielten eine monomere Verbindung, Tenacigenin A, aus Fermentationsprodukten.

Protokoll

Diese Studie wurde nach den Empfehlungen des Zentrums für Versuchstiere der Universität Minzu (Nr. ECMUC2019008AA). Das Protokoll wurde von der Ethikkommission für Versuchstiere der Universität Minzu genehmigt. MT wurde in Kunming in der Provinz Yunnan gesammelt.

1. Vorbereitung auf die Studie

1. MT mit heißem Wasser (100 °C; MT/Wasser = 1/10, w/v) für 30 min und sammeln Sie den MT-Extraktionsrückstand als Testmaterial.
2. Bewahren Sie die LLC-Lungenkrebszelllinie der Maus in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) auf, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 °C unter 5 % CO₂.
3. Bewahren Sie die C57BL/6J-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht von 19 ± 2 g in einem klimatisierten Raum mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden/12 Stunden und unbegrenztem Zugang zu Futter und Wasser auf. Desinfizieren Sie sie regelmäßig.

2. Vorläufiges Screening der Stämme

1. Drei Pilzstämme werden mit sterilen Techniken in festes Medium mit Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) geimpft und im Dunkeln bei 28 °C kultiviert. Nachdem das Geschirr vollständig mit Pilzen bedeckt ist, lagern Sie es bei 4 °C.
2. Die im PDA-Festmedium konservierten Stämme werden in der Samenlösung des Schüttelkolbens der ersten Stufe geimpft und bei 28 °C und 4-5 Tage lang bei 120 U/min geschüttelt. Die Pilzflüssigkeit der ersten Stufe wird in den Schüttelkolben mit der Sekundärpilzflüssigkeit in einem Volumenverhältnis von 1:20 in einem Schüttler mit konstanter Temperatur für 4-5 Tage inokuliert.
3. Verdünnen Sie das MT mit Wasser auf 100 mg/L (MT/Wasser) und fügen Sie die Lösung zum Agar hinzu, um ein festes Medium zu bilden. Impfen Sie 1 ml der sekundären Pilzflüssigkeit jedes der drei Stämme in die Festkultur, die nur MT enthält, und teilen Sie sie dann in G . lucidum-MT-, I. obliquus-MT- und O. sinensis-MT-Kultursysteme auf. Stellen Sie diese Kultursysteme bei 28 °C auf, ohne im Dunkeln zu schütteln.
4. Beobachten Sie nach einiger Zeit das Wachstum der Stämme in den oben genannten drei Kultursystemen und wählen Sie die Stämme aus, die nur mit MT wachsen können, um sie weiter zu screenen.

3. Erneutes Screening der Stammauswahl

HINWEIS: Nach dem vorläufigen Screening konnten nur G. lucidum und O. sinensis auf festem Medium, das MT enthielt, normal wachsen. Um das System mit guter Antitumorwirkung weiter auszuwählen, wurde die Wirksamkeit des Antitumors in einem transplantierten Tumormausmodell getestet.

1. G. lucidum und O. sinensis in ein flüssiges Medium impfen, das nur MT-MT mit G. lucidum Co-Fermentation (MGF) und MT mit O. sinensis Co-Fermentation (MOF) enthält, und 10 Tage lang bei 28 °C und Schütteln bei 180 U/min fermentieren.
2. Nach der Fermentation filtrieren Sie das Myzel durch Gaze und trocknen Sie es. Extrakt mit 80% Ethanol 3 x 12 h.
3. Überprüfen Sie die Antitumoraktivität der fermentierten und unfermentierten MT in LLC-Tumorzell-tragenden C57BL/6J-Mäusen.
   1. Injizieren Sie subkutan LLC-Zellen (1,0 × 10,⁶ Zellen in 0,2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro Maus) in die rechte Flanke von männlichen C57BL/6J-Mäusen (außer in der Kontrollgruppe).
   2. Um die erfolgreiche Etablierung des Modells zu bestätigen, berühren Sie die Tumorknötchen und vergewissern Sie sich, dass sie ~5 mm groß sind. Gruppieren Sie die tumortragenden Mäuse (n = 10 pro Gruppe) nach dem Zufallsprinzip in die Modellgruppe, die MGF-Gruppe, die MOF-Gruppe, die MT-Gruppe und die Cisplatin-Gruppe (Positivkontrolle). Verabreichen Sie der Kontrollgruppe (keine Tumorzellen) und der Modellgruppe Kochsalzlösung. Opfern Sie die Mäuse nach 14 Tagen Behandlung und sammeln Sie das Tumorgewebe.

4. Analyse der chemischen Zusammensetzung von Fermentationsprodukten

HINWEIS: Nach Überprüfung der Wirksamkeit der Fermentation wurde G. lucidum als Fermentationsstamm in dieser Studie ausgewählt. Wir führten eine Metabolomik-Analyse von MGF mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)¹¹ durch.

1. 10 mg MT, G. lucidum und MT mit G . lucidum Co-Fermentation (MGF) mit 500 μl Methanol:H₂O (7:3) extrahieren, 1 min lang bei 4 °C schütteln, 30 min beschallen und 20 min bei 1.200 × g zentrifugieren. Sammeln Sie die Überstände, filtrieren Sie sie durch eine 0,22 μm Polyvinylidenfluoridmembran und injizieren Sie sie in den Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Aufbau (LC-MS/MS).
   HINWEIS: Die durch die Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (UPLC) getrennten Metaboliten und eine Probenbibliothek für die Qualitätskontrolle (QC) wurden mittels hochauflösender Massenspektrometrie erstellt (siehe Materialtabelle).
2. Verwenden Sie die folgenden UPLC-Bedingungen: eine C18-Säule (100 mm x 2,1 mm; 8 μm), mobile Phase A-0,1 % (v/v) Ameisensäure in Reinstwasser, mobile Phase B-Acetonitril. Stellen Sie das Gradienten-Elutionsprofil auf 0 min 5% B ein. 2 min 5% B; 14 min 98% B; 17 min 98% B; 17,1 min 5% B; 20 min 5% bei einer Flussrate von 0,3 mL/min.
3. Nachweis und Identifizierung der Metaboliten durch hochauflösende Massenspektrometrie. Stellen Sie die Säulentemperatur auf 40 °C, die Temperatur des automatischen Injektors auf 4 °C und das Injektionsvolumen auf 2 μl ein. Halten Sie die folgenden MS-Bedingungen ein: die Spannung der Elektrospray-Ionenquelle: +5.500/-4.500 V; der Druck des Vorhanggases, der Ionenquelle 1 und der Ionenquelle 2: 35, 60 bzw. 60 psi; die Temperatur der Ionenquelle: 600 °C; das Depolymerisationspotential: ± 100 V.
4. Bereiten Sie die Qualitätskontrollproben (QCs) vor, indem Sie gleiche Volumina von MT-, GL- und MGF-Extrakten mischen und die drei Replikate QC 1-3 nennen. Verarbeiten und erkennen Sie Qualitätskontroll- und Analyseproben, indem Sie die gleichen Schritte befolgen. Geben Sie eine QC-Probe für jeweils drei Proben ein, um die Wiederholbarkeit von Detektion und Analyse zu untersuchen.

5. Extraktion und Isolierung von Fermentationsprodukten

1. Den aus der Fermentationsbrühe gewonnenen Fermentationsextrakt in destilliertem Wasser auflösen und gründlich umrühren.
   HINWEIS: Hier wurden aus 40 L Fermentationsbrühe 2 kg Fermentationsextrakt gewonnen.
2. Aus Abschnitt 4 werden 10 %, 30 %, 50 %, 70 % und 95 % Ethanolfraktionen mit einer makroporösen Adsorptionsharzsäule eluiert und die Fraktionen gesammelt.
   HINWEIS: Hier wurden 10,72 g der 95%igen Ethanolfraktion, 34,72 g der 70%igen Ethanolfraktion, 61,57 g der 50%igen Ethanolfraktion und 79,7 g der 30%igen Ethanolfraktion erhalten.
3. Basierend auf der Polarität der Fraktionen wird die 70%ige Ethanolfraktion mittels Kieselgel-Säulenchromatographie mit Ethylacetat:Methanol-Elution eluiert und die Fraktionen gesammelt.
   HINWEIS: Hier wurden Fr. 1-Fr. 7 gesammelt.
4. Führen Sie eine Sephadex LH-20-Säulenchromatographie durch, um die Fraktionen weiter zu reinigen (hier Fr. 3 und Fr. 4), gefolgt von einer semipräparativen Flüssigphasentrennung nach der Reinigung mit 1,0 g jeder Fraktion.
   HINWEIS: Durch die Verwendung von semi-präparativer Flüssigkeitschromatographie und Kieselgel-Säulenchromatographie haben wir die 95%ige Ethanolfraktion isoliert und gereinigt.
5. Führen Sie Mikrospektroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie durch und vergleichen Sie die Struktur der Verbindung(en) mit Strukturen aus Datenbanken für 600M und 700M und bestimmen Sie die planare Struktur der Verbindung(en).
   HINWEIS: Hier wurde ein Hybrid-Massenspektrometer verwendet, um das Molekulargewicht des Gemisches zu bestimmen. Wir identifizierten die Struktur einer Verbindung (siehe Ergänzende Abbildung S1).

6. Statistische Analysen

1. Wiederholen Sie alle Fermentationsexperimente sechsmal. Bewerten Sie die statistische Signifikanz mit dem Student's t-Test. Drücken Sie alle Daten als Mittelwert ± SD aus, wiederholen Sie alle Experimente in dreifacher Ausfertigung und setzen Sie p < 0,05 für die statistische Signifikanz (*0,01 ≤ p ≤ 0,05, **0,001 ≤ p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001).
2. Verwenden Sie die SCIEX OS-Software, um Metaboliten hauptsächlich auf der Grundlage von Massenfehlern, Retentionszeit, Isotopenübereinstimmung, MS/MS-Bibliotheksreinheit und rechnerischer Summenformel zu identifizieren. Verwenden Sie die folgenden Parameter für die Bibliothekseinstellung: Massenfehler < 5 ppm, Isotopenverhältnisdifferenz < 20 und Bibliotheksbewertung > 50.

Ergebnisse

Vorläufige Screening-Ergebnisse von Stämmen
Um Pilze zu erforschen, die in der Lage sind, mit MT zu co-fermentieren, wählten wir drei Pilze aus: G. lucidum, I. obliquus und O. sinensis. Zuerst wurden die Stämme aktiviert: G. lucidum, I. obliquus und O. sinensis wurden im PDA-Medium inokuliert, wie in Abbildung 1A-C gezeigt; Abb...

Diskussion

Nach Stamm-Screening-Experimenten haben wir festgestellt, dass nicht alle Heilpilze normal auf Kräutermaterialien überleben können. Ohne zusätzliches Medium hängt das Überleben von Heilpilzen vom Abbau der Bestandteile in medizinischen Materialien durch ihre eigenen Enzyme ab, um die benötigten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zu synthetisieren. Daraus lässt sich schließen, dass I. obliquus keine Enzyme enthält, die in der Lage sind, Saponine von MT abzubauen. Bei

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20200923
Agar	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., USA	NO.20080107
Autoclave	BinJiang Medical Co., Ltd., Jiangyin, China	LS-50LD
constant shaking incubator	Zhicheng Inc. All rights reserved., Shanghai, China	ZWY-100D
Ganoderma lucidum	BeNa Culture Collection, Beijing, China	31732
Inonotus obliquus	BeNa Culture Collection, Beijing, China	117822
LLC Mouse lung cancer cell	National Infrastructure of Cell Line Resource, Beijing, China	PUMC000673
Male C57BL/6J mice	Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Beiijng, China	No.110011210107024684
Methanol	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20210723
Ophiocordyceps sinensis	BeNa Culture Collection, Beijing, China	118371
Poly tetra fluoroethylene	Jinteng Experiment Equipment Co., Ltd., Tianjing,China	No.997
QTRAP 5500 LC/MS	AB Sciex Pte. Ltd., USA	CV20231711
Rotary Evaporator	BUCHI Co., Ltd., Shanghai, China	R-300
Syringe	Zhiyu Medical Instrument Co., Ltd., Jinagsu, China	V500111
Ultra-clean bench	BOXUN Medica Bioological Instrument Co., Ltd., Shanghai, China	SW-CJ-LFD