Co-fermentazione di Marsdenia tenacissima con Ganoderma lucidum ed effetto anti-cancro ai polmoni dei prodotti di fermentazione

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per stabilire un sistema di co-fermentazione sistematico e completo per produrre prodotti di biotrasformazione ricchi di saponine pungenti utilizzando Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT) come mezzo di fermentazione per il Ganoderma lucidum. Questo servirà come riferimento metodologico per lo sviluppo di altre droghe etniche.

Abstract

Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT), come medicina erboristica tradizionale cinese e Dai, ha proprietà antinfiammatorie, antibatteriche e antitumorali. Tuttavia, la maggior parte dei suoi principali principi attivi sono agliconi, come la tenacigenina A e la tenacigenina B. Poiché la biodisponibilità della MT è bassa e i suoi componenti attivi medicinali sono difficili da sintetizzare, viene studiata principalmente mediante biotrasformazione. Questo studio mira a produrre prodotti di biotrasformazione ricchi di saponine pungenti utilizzando la MT come mezzo di fermentazione per il Ganoderma lucidum (G. lucidum).

Attraverso lo screening preliminare di tre funghi medicinali, è stato riscontrato che G. lucidum e Ophiocordyceps sinensis (O. sinensis) possono generalmente crescere nel terreno per MT; Pertanto, l'efficacia della fermentazione dei due tipi di funghi è stata esaminata utilizzando un modello murino di cancro ai polmoni. Infine, la co-fermentazione di G. lucidum e MT è stata selezionata per ulteriori indagini. L'analisi metabolomica non-target è stata eseguita sui prodotti di MT con co-fermentazione di G. lucidum . Abbiamo identificato 12 saponine specifiche di MT dai prodotti di fermentazione e abbiamo ottenuto un composto monomerico, la tenacigenina A, dai prodotti di fermentazione.

La maggior parte della tenacigenina ha mostrato una significativa tendenza all'aumento, attraverso i livelli di tenacigenina A e tenacigenina B. I risultati hanno mostrato che l'efficacia della MT è migliorata dopo la fermentazione da parte di G. lucidum. Inoltre, la biotrasformazione dei glicosidi steroidei C₂₁ in MT è stata la reazione centrale in questo processo di fermentazione. In sintesi, questo studio ha stabilito un sistema di co-fermentazione sistematico e completo e un metodo di valutazione farmacodinamica per la MT, che non solo ha migliorato il pieno utilizzo di sostanze attive efficaci nella MT, ma ha anche fornito un riferimento metodologico per lo sviluppo di altri farmaci etnici.

Introduzione

Il cancro del polmone appartiene alla categoria del "carbonchio polmonare" nella medicina tradizionale cinese. La patogenesi del carbonchio polmonare è una debolezza del "Qi" sano dei pazienti, lo squilibrio di Yin e Yang, le tossine e il ristagno nel polmone, che porta a disfunzione polmonare, blocco del sangue e perdita di liquidi nel polmone. Pertanto, la stasi del sangue a lungo termine e le tossine dell'espettorato nei polmoni formano una massa polmonare¹. Pertanto, il rafforzamento del Qi e l'eliminazione dei fattori patogeni è il principio di base del trattamento del cancro ai polmoni. I metodi di nutrire lo Yin per bilanciare lo Yin e lo Yang, eliminare il calore, disintossicare e disperdere il ristagno, integrare il Qi e nutrire lo Yin e eliminare il catarro sono usati per trattare e prevenire la formazione di carbonchi polmonari².

La Marsdenia tenacissima (MT) è una pianta medicinale appartenente alla famiglia delle Asclepiadaceae (Marsdenia ssp.), nota anche come Wuguteng. Ha gli effetti di eliminare il calore e disintossicare, alleviare la tosse e l'asma e ha proprietà antitumorali³. L'iniezione di Xiaoaiping, un preparato a base di una singola erba di MT, è stata ampiamente utilizzata nelle cliniche e mostra un buon effetto terapeutico antitumorale⁴. Tuttavia, con l'aumento della popolazione, la domanda di traduzione automatica è aumentata notevolmente. Di conseguenza, l'offerta di risorse di MT selvatiche è insufficiente e la qualità dei materiali medicinali coltivati non è uniforme. Ci sono problemi come la scarsa qualità delle materie erbore, il contenuto instabile degli ingredienti e la bassa biodisponibilità, che minacciano seriamente lo sviluppo della MT. Tra questi composti bioattivi, le saponine della MT sono state ampiamente studiate. Sono state identificate più di 100 saponine da MT; possono essere suddivisi in due tipi principali: (1) glicosidi steroidei C₂₁ in MT, tra cui tenacissoside A-P, marsdenoside A-M, tenacigenoside A-L e tenacigenina A-D. (2) Triterpeni pentaciclici, come l'acido oleanolico e l'acido ursolico. Molti studi hanno indicato che l'attività antitumorale degli estratti di etere di petrolio è superiore alle molecole altamente polari della MT. Quindi, è vantaggioso convertire il polisaccaride principale delle saponine della MT in un altro aglicone minore della MT con maggiore biodisponibilità e bioattività⁵.

La biotrasformazione, nota anche come biocatalisi, si riferisce alle reazioni fisiologiche e biochimiche della trasformazione o della modifica strutturale di substrati esogeni utilizzando enzimi correlati nei sistemi biologici⁶. È più economico, più sicuro, selettivo a livello regionale e stereoselettivo rispetto alla sintesi chimica tradizionale e può produrre alcuni composti bioattivi difficili da preparare con la chimica sintetica convenzionale ^7,8. Pertanto, lo sviluppo della medicina tradizionale cinese e dei farmaci naturali è essenziale per promuovere la modernizzazione e l'internazionalizzazione della medicina tradizionale cinese.

Il sistema di co-fermentazione della MT è stato stabilito utilizzando la biotrasformazione. I materiali medicinali originali sono stati trasformati da sistemi enzimatici microbici. Da un lato, l'estratto di MT è stato utilizzato come substrato per produrre la coltura di fermentazione dei funghi in questa modalità. Allo stesso tempo, la fermentazione fungina ha accorciato il ciclo di riproduzione dei batteri, ridotto i costi di produzione e migliorato l'efficienza produttiva⁹. D'altra parte, l'aumento della precipitazione di componenti attivi da parte della fermentazione fungina è benefico, producendo componenti chimici e una migliore efficacia¹⁰. L'uso della tecnologia di fermentazione liquida a due vie è utile per proteggere i principi attivi dei materiali medicinali, migliorare l'efficacia, risparmiare fonti di farmaci e può produrre una migliore efficacia fornendo tecniche per la modifica strutturale dei principi attivi dei materiali a base di erbe. È di grande importanza migliorare il livello di modernizzazione della medicina tradizionale cinese.

In questo studio, G. lucidum, O. sinensis e Inonotus obliquus (I. obliquus) sono stati selezionati come microrganismi di fermentazione nella fase iniziale dopo la revisione della letteratura e i ceppi sono stati sottoposti a screening preliminari. Quindi, i ceppi di fermentazione finali sono stati determinati esplorando l'efficacia dei ceppi sottoposti a screening attraverso il modello murino tumorale. Infine, i metaboliti primari e i metaboliti secondari dei prodotti di fermentazione sono stati sistematicamente analizzati e valutati mediante LC-MS e abbiamo ottenuto un composto monomerico, la tenacigenina A, dai prodotti di fermentazione.

Protocollo

Questo studio è stato condotto seguendo le raccomandazioni del Centro Sperimentale Animale dell'Università di Minzu (n. ECMUC2019008AA). Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico per gli Animali Sperimentali dell'Università di Minzu. MT è stato raccolto a Kunming, nella provincia dello Yunnan.

1. Preparazione allo studio

1. Estrarre MT con acqua calda (100 °C; MT/acqua = 1/10, p/v) per 30 minuti e raccogliere il residuo di estrazione MT come materiale di prova.
2. Mantenere la linea cellulare di carcinoma polmonare di topo LLC nel terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina in un'atmosfera umidificata a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
3. Tenere i topi C57BL/6J, di età compresa tra 6 e 8 settimane e dal peso di 19 ± 2 g, in una stanza controllata dal punto di vista ambientale con un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore e con accesso illimitato a cibo e acqua. Disinfettali regolarmente.

2. Screening preliminare dei ceppi

1. Inoculare tre ceppi di funghi in un terreno solido di destrosio agar di patata (PDA) utilizzando tecniche sterili e coltivarli al buio a 28 °C. Dopo che i piatti sono completamente ricoperti di funghi, conservarli a 4 °C.
2. Inoculare i ceppi conservati nel terreno solido PDA nella soluzione di semi del pallone di agitazione di primo stadio e coltivarli a 28 °C, agitando a 120 giri/min per 4-5 giorni. Inoculare il liquido dei funghi del primo stadio nel pallone contenente il liquido secondario dei funghi con un rapporto in volume di 1:20 in un agitatore a temperatura costante per 4-5 giorni.
3. Diluire il MT con acqua a 100 mg/L (MT/acqua) e aggiungere la soluzione all'agar per formare un mezzo solido. Inoculare 1 mL del liquido fungino secondario di ciascuno dei tre ceppi nella coltura solida contenente solo MT, quindi dividere in sistemi di coltura G. lucidum-MT, I. obliquus-MT e O. sinensis-MT. Posizionare questi sistemi di coltura a 28 °C senza scuotere al buio.
4. Dopo un po' di tempo, osservare la crescita dei ceppi nei tre sistemi di coltura di cui sopra e selezionare i ceppi che possono crescere solo con MT per un ulteriore screening.

3. Riscreening della selezione del ceppo

NOTA: Dopo lo screening preliminare, solo G. lucidum e O. sinensis sono potuti crescere normalmente su terreno solido contenente MT. Per selezionare ulteriormente il sistema con un buon effetto antitumorale, l'efficacia antitumorale è stata testata in un modello murino di tumore trapiantato.

1. Inoculare G. lucidum e O. sinensis in un mezzo liquido contenente solo MT-MT con co-fermentazione di G. lucidum (MGF) e MT con co-fermentazione di O. sinensis (MOF), e fermentare per 10 giorni a 28 °C con agitazione a 180 giri/min.
2. Dopo la fermentazione, filtrare il micelio attraverso una garza e asciugarlo. Estratto con etanolo all'80% 3 x 12 h.
3. Controllare l'attività antitumorale della MT fermentata e non fermentata nei topi LLC contenenti cellule tumorali C57BL/6J.
   1. Iniettare per via sottocutanea cellule LLC (1,0 × 10⁶ cellule in 0,2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per topo) nel fianco destro di topi maschi C57BL/6J (tranne che nel gruppo di controllo).
   2. Per confermare l'avvenuta definizione del modello, toccare i noduli tumorali e verificare che abbiano una dimensione di ~5 mm. Raggruppare in modo casuale i topi portatori di tumore (n = 10 per gruppo) nel gruppo modello, nel gruppo MGF, nel gruppo MOF, nel gruppo MT e nel gruppo cisplatino (controllo positivo). Somministrare soluzione salina al gruppo di controllo (senza cellule tumorali) e al gruppo modello. Sacrificare i topi dopo 14 giorni di trattamento e raccogliere il tessuto tumorale.

4. Analisi della composizione chimica dei prodotti di fermentazione

NOTA: Dopo aver verificato l'efficacia della fermentazione, G. lucidum è stato selezionato come ceppo di fermentazione in questo studio. Abbiamo eseguito analisi metabolomiche di MGF mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS)¹¹.

1. Estrarre 10 mg di MT, G. lucidum e MT con co-fermentazione (MGF) di G. lucidum con 500 μL di metanolo:H₂O (7:3), agitare a 4 °C per 1 minuto, sonicare per 30 minuti e centrifugare per 20 minuti a 1.200 × g. Raccogliere i surnatanti, filtrarli attraverso una membrana di fluoruro di polivinilidene da 0,22 μm e iniettarli nella configurazione di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).
   NOTA: I metaboliti separati con cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC) e una libreria di campioni per il controllo di qualità (QC) sono stati costruiti mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione (vedi Tabella dei materiali).
2. Utilizzare le seguenti condizioni UPLC: una colonna C18 (100 mm x 2,1 mm; 8 μm), acido formico in fase mobile A-0,1% (v/v) in acqua ultrapura, fase mobile B-acetonitrile. Impostare il profilo di eluizione del gradiente su 0 min 5% B; 2 min 5% B; 14 min 98% B; 17 minuti 98% B; 17,1 minuti 5% B; 20 min 5% a una velocità di flusso di 0,3 mL/min.
3. Rilevare e identificare i metaboliti mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione. Impostare la temperatura della colonna a 40 °C, la temperatura dell'iniettore automatico a 4 °C e il volume di iniezione a 2 μL. Mantenere le seguenti condizioni MS: la tensione della sorgente di ioni elettrospray: +5.500/-4.500 V; la pressione del gas a tendina, della sorgente ionica 1 e della sorgente ionica 2: 35, 60 e 60 psi, rispettivamente; la temperatura della sorgente ionica: 600 °C; il potenziale di depolimerizzazione: ± 100 V.
4. Preparare i campioni di controllo qualità (QC) mescolando volumi uguali di estratti MT, GL e MGF e denominare le tre repliche QC rispettivamente 1-3. Elabora e rileva i campioni di controllo qualità e analisi seguendo gli stessi passaggi. Inserire un campione QC ogni tre campioni per verificare la ripetibilità del rilevamento e dell'analisi.

5. Estrazione e isolamento dei prodotti di fermentazione

1. Sciogliere l'estratto di fermentazione ottenuto dal brodo di fermentazione in acqua distillata e mescolare accuratamente.
   NOTA: Qui si sono ottenuti 2 kg di estratto di fermentazione da 40 L di brodo di fermentazione.
2. Dalla sezione 4, eluire le frazioni di etanolo al 10%, 30%, 50%, 70% e 95% utilizzando una colonna di resina di adsorbimento macroporosa e raccogliere le frazioni.
   NOTA: Qui sono stati ottenuti 10,72 g della frazione di etanolo al 95%, 34,72 g della frazione di etanolo al 70%, 61,57 g della frazione di etanolo al 50% e 79,7 g della frazione di etanolo al 30%.
3. In base alla polarità delle frazioni, eluire la frazione di etanolo al 70% utilizzando la cromatografia su colonna su gel di silice con eluizione di acetato di etile:metanolo e raccogliere le frazioni.
   NOTA: Qui sono stati raccolti Fr. 1-Fr. 7.
4. Eseguire la cromatografia su colonna Sephadex LH-20 per purificare ulteriormente le frazioni (in questo caso, Fr. 3 e Fr. 4) seguita dalla separazione in fase liquida semi-preparativa dopo la purificazione utilizzando 1,0 g di ciascuna frazione.
   NOTA: Utilizzando la cromatografia liquida semi-preparativa e la cromatografia su colonna su gel di silice, abbiamo isolato e purificato la frazione di etanolo al 95%.
5. Eseguire la microspettroscopia e la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare e confrontare la struttura dei composti con le strutture dei database per 600M e 700M e determinare la struttura planare dei composti.
   NOTA: In questo caso, è stato utilizzato uno spettrometro di massa ibrido per determinare il peso molecolare della miscela. Abbiamo identificato la struttura di un composto (vedi Figura supplementare S1).

6. Analisi statistiche

1. Ripeti tutti gli esperimenti di fermentazione sei volte. Valutare la significatività statistica utilizzando il t-test di Student. Esprimi tutti i dati come media ± SD, ripeti tutti gli esperimenti in triplice copia e imposta p < 0,05 per la significatività statistica (*0,01 ≤ p ≤ 0,05, **0,001 ≤ p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001).
2. Utilizza il software SCIEX OS per identificare i metaboliti principalmente in base all'errore di massa, al tempo di ritenzione, alla corrispondenza isotopica, al punteggio di purezza della libreria MS/MS e alla formula molecolare computazionale. Utilizzare i seguenti parametri di impostazione della libreria: errore di massa < 5 ppm, differenza del rapporto isotopico < 20 e punteggio della libreria > 50.

Risultati

Risultati preliminari dello screening dei ceppi
Per esplorare funghi in grado di co-fermentare con MT, abbiamo selezionato tre funghi: G. lucidum, I. obliquus e O. sinensis. In primo luogo, i ceppi sono stati attivati: G. lucidum, I. obliquus e O. sinensis sono stati inoculati nel terreno PDA come mostrato nella Figura 1A-C; La Fig...

Discussione

Dopo gli esperimenti di screening dei ceppi, abbiamo scoperto che non tutti i funghi medicinali possono sopravvivere normalmente su materiali a base di erbe. Senza alcun mezzo aggiuntivo, la sopravvivenza dei funghi medicinali dipende dalla degradazione dei componenti nei materiali medicinali attraverso i propri enzimi per sintetizzare le fonti di carbonio e azoto necessarie. Si può dedurre che I. obliquus potrebbe non contenere enzimi in grado di degradare le saponine di MT. P...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20200923
Agar	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., USA	NO.20080107
Autoclave	BinJiang Medical Co., Ltd., Jiangyin, China	LS-50LD
constant shaking incubator	Zhicheng Inc. All rights reserved., Shanghai, China	ZWY-100D
Ganoderma lucidum	BeNa Culture Collection, Beijing, China	31732
Inonotus obliquus	BeNa Culture Collection, Beijing, China	117822
LLC Mouse lung cancer cell	National Infrastructure of Cell Line Resource, Beijing, China	PUMC000673
Male C57BL/6J mice	Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Beiijng, China	No.110011210107024684
Methanol	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20210723
Ophiocordyceps sinensis	BeNa Culture Collection, Beijing, China	118371
Poly tetra fluoroethylene	Jinteng Experiment Equipment Co., Ltd., Tianjing,China	No.997
QTRAP 5500 LC/MS	AB Sciex Pte. Ltd., USA	CV20231711
Rotary Evaporator	BUCHI Co., Ltd., Shanghai, China	R-300
Syringe	Zhiyu Medical Instrument Co., Ltd., Jinagsu, China	V500111
Ultra-clean bench	BOXUN Medica Bioological Instrument Co., Ltd., Shanghai, China	SW-CJ-LFD