Marsdenia tenacissima'nın Ganoderma lucidum ile Birlikte Fermantasyonu ve Fermantasyon Ürünlerinin Anti-Akciğer Kanseri Etkisi

Özet

Burada, Marsdenia tenacissima (Roxb.) kullanarak keskin saponinler açısından zengin biyotransformasyon ürünleri üretmek için sistematik ve kapsamlı bir ko-fermantasyon sistemi kurmak için bir protokol açıklıyoruz. Wight ve Arn. (MT) Ganoderma lucidum için bir fermantasyon ortamı olarak. Bu, diğer etnik ilaçların geliştirilmesi için metodolojik bir referans görevi görecektir.

Özet

Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight ve Arn. Geleneksel bir Çin ve Dai bitkisel ilacı olan (MT), anti-inflamatuar, antibakteriyel ve antitümör özelliklere sahiptir. Bununla birlikte, ana aktif maddelerinin çoğu, tenacigenin A ve tenacigenin B gibi aglikonlardır. MT'nin biyoyararlanımı düşük olduğundan ve tıbbi aktif bileşenlerinin sentezlenmesi zor olduğundan, öncelikle biyotransformasyon ile incelenir. Bu çalışma, Ganoderma lucidum (G. lucidum) için bir fermantasyon ortamı olarak MT kullanarak keskin saponinler açısından zengin biyotransformasyon ürünleri üretmeyi amaçlamaktadır.

Üç tıbbi mantarın ön taraması yoluyla, G. lucidum ve Ophiocordyceps sinensis'in (O. sinensis) genellikle MT için ortamda büyüyebildiği bulundu; Bu nedenle, iki mantar türünün fermantasyonunun etkinliği, bir fare akciğer kanseri modeli kullanılarak tarandı. Son olarak, daha fazla araştırma için G. lucidum ve MT'nin birlikte fermantasyonu seçildi. G. lucidum ko-fermantasyonu ile MT ürünleri üzerinde hedef dışı metabolomik analiz yapıldı. Fermantasyon ürünlerinden MT'nin 12 spesifik saponinini tanımladık ve fermantasyon ürünlerinden monomerik bir bileşik olan tenacigenin A'yı elde ettik.

Tenacigeninin çoğu, tenacigenin A ve tenacigenin B seviyeleri aracılığıyla önemli bir artış eğilimi gösterdi. Sonuçlar, MT'nin etkinliğinin G. lucidum tarafından fermantasyondan sonra arttığını gösterdi. Ayrıca, MT'deki C₂₁ steroidal glikozitlerin biyotransformasyonu, bu fermantasyon sürecindeki merkezi reaksiyondu. Özetle, bu çalışma, MT için sistematik ve kapsamlı bir ko-fermantasyon sistemi ve farmakodinamik değerlendirme yöntemi oluşturmuş, bu da sadece MT'deki etkili aktif maddelerin tam kullanımını arttırmakla kalmamış, aynı zamanda diğer etnik ilaçların geliştirilmesi için metodolojik bir referans sağlamıştır.

Giriş

Akciğer kanseri, geleneksel Çin tıbbında "akciğer karbonkülü" kategorisine aittir. Akciğer karbonkülünün patogenezi hastaların sağlıklı "Qi" nin zayıflığı, Yin ve Yang dengesizliği, toksinler ve akciğerdeki durgunluktur, bu da akciğer fonksiyon bozukluğuna, kan tıkanıklığına ve akciğerde sıvı kaybına yol açar. Böylece, akciğerlerde uzun süreli kan stazı ve balgam toksinleri bir akciğer kütlesi oluşturur¹. Bu nedenle, Qi'yi güçlendirmek ve patojenik faktörleri ortadan kaldırmak, akciğer kanseri tedavisinin temel prensibidir. Yin ve Yang'ı dengelemek, ısıyı temizlemek, durgunluğu detoksifiye etmek ve dağıtmak, Qi'yi takviye etmek ve Yin'i beslemek ve balgamı temizlemek için Yin'i besleme yöntemleri, akciğer karbonküllerinin oluşumunu tedavi etmek ve önlemek için kullanılır².

Marsdenia tenacissima (MT), Wuguteng olarak da bilinen Asclepiadaceae (Marsdenia ssp.) familyasına ait tıbbi bir bitkidir. Isıyı temizleme ve detoksifikasyon, öksürük ve astımı hafifletme etkilerine sahiptir ve antitümör özelliklere sahiptir³. Tek bir MT bitkisinden yapılan bir preparat olan Xiaoaiping enjeksiyonu, kliniklerde yaygın olarak kullanılmaktadır ve iyi terapötik antikanser etkisi gösterir⁴. Ancak nüfus artışıyla birlikte MT'ye olan talep keskin bir şekilde artmıştır. Buna göre, yabani MT kaynaklarının arzı yetersizdir ve ekili tıbbi malzemelerin kalitesi eşit değildir. Bitki materyallerinin kalitesizliği, bileşenlerin kararsız içeriği ve düşük biyoyararlanım gibi MT gelişimini ciddi şekilde tehdit eden sorunlar vardır. Bu biyoaktif bileşikler arasında, MT'den elde edilen saponinler oldukça araştırılmıştır. MT'den 100'den fazla saponin tanımlanmıştır; iki ana tipe ayrılabilirler: (1) MT'de tenasisosid AP, marsdenosid, tenacigenoside AL ve tenacigenin AD dahil olmak üzere C₂₁ steroidal glikozitler. (2) Oleanolik asit ve ursolik asit gibi pentasiklik triterpenler. Birçok çalışma, petrol eter ekstraktlarının antikanser aktivitesinin, MT'den gelen yüksek polar moleküllerden daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, saponinlerin ana polisakkaritini MT'den daha yüksek biyoyararlanım ve biyoaktiviteye sahip MT'nin başka bir küçük agalikonuna dönüştürmek avantajlıdır⁵.

Biyokataliz olarak da bilinen biyotransformasyon, biyolojik sistemlerde ilgili enzimler kullanılarak eksojen substratların transformasyonu veya yapısal modifikasyonunun fizyolojik ve biyokimyasal reaksiyonlarını ifade eder⁶. Geleneksel kimyasal sentezden daha ekonomik, daha güvenli, bölgesel olarak seçici ve stereoselektiftir ve geleneksel sentetik kimya ile hazırlanması zor olan bazı biyoaktif bileşikler üretebilir ^7,8. Bu nedenle, geleneksel Çin tıbbının ve doğal ilaçların geliştirilmesi, geleneksel Çin tıbbının modernleşmesini ve uluslararasılaşmasını teşvik etmek için çok önemlidir.

MT'nin ko-fermantasyon sistemi biyotransformasyon kullanılarak kurulmuştur. Orijinal tıbbi malzemeler mikrobiyal enzim sistemleri tarafından dönüştürüldü. Bir yandan, MT özütü, bu modda mantarların fermantasyon kültürünü üretmek için bir substrat olarak kullanıldı. Aynı zamanda, mantar fermantasyonu bakterilerin üreme döngüsünü kısalttı, üretim maliyetlerini düşürdü ve üretim verimliliğini artırdı⁹. Öte yandan, mantar fermantasyonu ile aktif bileşenlerin artan çökelmesi faydalıdır, kimyasal bileşenler üretir ve gelişmiş bir etkinlik¹⁰. Sıvı iki yönlü fermantasyon teknolojisinin kullanılması, tıbbi malzemelerin aktif bileşenlerini korumaya, etkinliği artırmaya, ilaç kaynaklarını korumaya yardımcı olur ve bitki materyallerinin aktif bileşenlerinin yapısal modifikasyonu için teknikler sağlayarak daha iyi etkinlik sağlayabilir. Geleneksel Çin tıbbının modernizasyon seviyesinin iyileştirilmesi büyük önem taşımaktadır.

Bu çalışmada, literatür taramasından sonra erken dönemde fermantasyon mikroorganizmaları olarak G. lucidum, O. sinensis ve Inonotus obliquus (I. obliquus) seçilmiş ve suşlar ön elemeden geçirilmiştir. Daha sonra, nihai fermantasyon suşları, tümör fare modeli aracılığıyla taranan suşların etkinliği araştırılarak belirlendi. Son olarak, fermantasyon ürünlerinin birincil metabolitleri ve ikincil metabolitleri LC-MS ile sistematik olarak analiz edildi ve değerlendirildi ve fermantasyon ürünlerinden monomerik bir bileşik olan tenacigenin A elde edildi.

Protokol

Bu çalışma, Minzu Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezi'nin (No. ECMUC2019008AA). Protokol, Minzu Üniversitesi Deney Hayvanları Etik Kurulu tarafından onaylandı. MT, Yunnan eyaleti, Kunming'den toplandı.

1. Çalışma için hazırlık

1. MT'yi sıcak suyla (100 °C; MT / su = 1/10, w / v) 30 dakika boyunca MT ekstraksiyon kalıntısını toplayın ve test materyali olarak MT ekstraksiyon kalıntısını toplayın.
2. LLC fare akciğer kanseri hücre hattını, %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) 37 ° C'de% 5 CO 2 altında nemlendirilmiş bir atmosferde_koruyun.
3. 6-8 haftalık ve 19 ± 2 g ağırlığındaki C57BL/6J fareleri, 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsüne ve yiyecek ve suya sınırsız erişime sahip, çevre tarafından kontrol edilen bir odada tutun. Onları düzenli olarak dezenfekte edin.

2. Suşların ön taraması

1. Steril teknikler kullanarak üç mantar türünü patates dekstroz agar (PDA) katı ortamına aşılayın ve karanlıkta 28 °C'de kültürleyin. Bulaşıklar tamamen mantarlarla kaplandıktan sonra 4 °C'de saklayın.
2. PDA katı ortamında korunan suşları, birinci aşama çalkalama şişesinin tohum çözeltisine aşılayın ve 28 ° C'de, 4-5 gün boyunca 120 rpm'de çalkalayarak kültürleyin. Birinci aşama mantar sıvısını, 4-5 gün boyunca sabit sıcaklıktaki bir çalkalayıcıda 1:20 hacim oranında ikincil mantar sıvısını içeren çalkalama şişesine aşılayın.
3. MT'yi suyla 100 mg/L'ye (MT/su) seyreltin ve katı bir ortam oluşturmak için çözeltiyi agar'a ekleyin. Üç suşun her birinin ikincil mantar sıvısının 1 mL'sini sadece MT içeren katı kültüre aşılayın ve daha sonra G. lucidum-MT, I. obliquus-MT ve O. sinensis-MT kültür sistemlerine bölün. Bu kültür sistemlerini karanlıkta sallamadan 28 °C'ye yerleştirin.
4. Bir süre sonra, yukarıdaki üç kültür sistemindeki suşların büyümesini gözlemleyin ve daha fazla tarama için yalnızca MT ile büyüyebilen suşları seçin.

3. Gerinim seçiminin yeniden taranması

NOT: Ön taramadan sonra, sadece G. lucidum ve O. sinensis MT içeren katı ortamda normal şekilde büyüyebilir. İyi antitümör etkiye sahip sistemi daha fazla seçmek için, antitümör etkinliği, nakledilen bir tümör fare modelinde test edildi.

1. G. lucidum ve O. sinensis'i sadece G. lucidum ko-fermantasyonu (MGF) ile MT-MT ve O. sinensis ko-fermantasyonu (MOF) ile MT içeren sıvı ortama aşılayın ve 180 rpm'de çalkalanarak 28 ° C'de 10 gün boyunca fermente edin.
2. Fermantasyondan sonra, miselyum gazlı bezden süzün ve kurutun. % 80 etanol ile ekstrakte edin 3 x 12 saat.
3. LLC tümör hücresi taşıyan C57BL / 6J farelerinde fermente edilmiş ve fermente edilmemiş MT'nin antitümör aktivitesini kontrol edin.
   1. Deri altından LLC hücrelerini (fare başına 0.2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1.0 ×^{10 6} hücre) erkek C57BL / 6J farelerin sağ kanadına enjekte edin (kontrol grubu hariç).
   2. Modelin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu doğrulamak için tümör nodüllerine dokunun ve ~ 5 mm boyutunda olduklarını doğrulayın. Tümör taşıyan fareleri (grup başına n = 10) model grubu, MGF grubu, MOF grubu, MT grubu ve sisplatin grubu (pozitif kontrol) olarak rastgele gruplandırın. Kontrol grubuna (tümör hücresi yok) ve model grubuna salin uygulayın. 14 günlük tedaviden sonra fareleri sakfiye edin ve tümör dokusunu toplayın.

4. Fermantasyon ürünlerinin kimyasal bileşim analizi

NOT: Fermantasyonun etkinliği doğrulandıktan sonra, bu çalışmada fermantasyon suşu olarak G. lucidum seçilmiştir. MGF'nin metabolomik analizini sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS)¹¹ ile gerçekleştirdik.

1. 500 μL metanol ile G. lucidum ko-fermantasyonu (MGF) ile 10 mg MT, G. lucidum ve MT ekstrakte edin: H₂O (7: 3), 1 dakika boyunca 4 ° C'de çalkalayın, 30 dakika sonikat ve 1.200 × g'da 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları toplayın, 0.22 μm poliviniliden florür membranından filtreleyin ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi kurulumuna (LC-MS/MS) enjekte edin.
   NOT: Ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) ile ayrılmış metabolitler ve bir kalite kontrol (QC) numune kütüphanesi, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile oluşturulmuştur (bkz.
2. Aşağıdaki UPLC koşullarını kullanın: bir C18 sütunu (100 mm x 2,1 mm; 8 μm), ultra saf suda mobil faz A-%0,1 (h/h) formik asit, mobil faz B-asetonitril. Gradyan elüsyon profilini 0 min %5 B olarak ayarlayın; 2 dk %5 B; 14 dk %98 B; 17 dk %98 B; 17.1 dk %5 B; 0,3 mL/dk akış hızında 20 dk %5.
3. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile metabolitleri tespit edin ve tanımlayın. Kolon sıcaklığını 40 °C'ye, otomatik enjektör sıcaklığını 4 °C'ye ve enjeksiyon hacmini 2 μL'ye ayarlayın. Aşağıdaki MS koşullarını koruyun: elektrosprey iyon kaynağının voltajı: +5.500/-4.500 V; perde gazının, iyon kaynağı 1'in ve iyon kaynağı 2'nin basıncı: sırasıyla 35, 60 ve 60 psi; iyon kaynağının sıcaklığı: 600 °C; depolimerizasyon potansiyeli: ± 100 V.
4. Eşit hacimlerde MT, GL ve MGF ekstraktlarını karıştırarak kalite kontrol numunelerini (QC'ler) hazırlayın ve üç kopyayı sırasıyla QC 1-3 olarak adlandırın. Aynı adımları izleyerek kalite kontrol ve analiz numunelerini işleyin ve tespit edin. Algılama ve analizin tekrarlanabilirliğini araştırmak için her üç örnek için bir kalite kontrol örneği ekleyin.

5. Fermantasyon ürünlerinin ekstraksiyonu ve izolasyonu

1. Fermantasyon suyundan elde edilen fermantasyon ekstraktını damıtılmış suda çözün ve iyice karıştırın.
   NOT: Burada 40 L fermantasyon suyundan 2 kg fermantasyon ekstraktı elde edilmiştir.
2. Bölüm 4'ten, makro gözenekli bir adsorpsiyon reçine kolonu kullanarak %10, %30, %50, %70 ve %95 etanol fraksiyonlarını elüte edin ve fraksiyonları toplayın.
   NOT: Burada 10.72 g %95 etanol fraksiyonu, 34.72 g %70 etanol fraksiyonu, 61.57 g %50 etanol fraksiyonu ve 79.7 g %30 etanol fraksiyonu elde edilmiştir.
3. Fraksiyonların polaritesine bağlı olarak, etil asetat: metanol elüsyonu ile silika jel kolon kromatografisi kullanarak% 70 etanol fraksiyonunu elüte edin ve fraksiyonları toplayın.
   NOT: Burada, Fr. 1-Fr. 7 toplanmıştır.
4. Fraksiyonları daha da saflaştırmak için Sephadex LH-20 kolon kromatografisini gerçekleştirin (burada, Fr. 3 ve Fr. 4) ve ardından her fraksiyondan 1.0 g kullanarak saflaştırmadan sonra yarı hazırlayıcı sıvı faz ayrımı yapın.
   NOT: Yarı hazırlayıcı sıvı kromatografisi ve silika jel kolon kromatografisi kullanarak,% 95 etanol fraksiyonunu izole ettik ve saflaştırdık.
5. Mikrospektroskopi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi yapın ve bileşik(ler)in yapısını 600M ve 700M veri tabanlarındaki yapılarla karşılaştırın ve bileşik(ler)in düzlemsel yapısını belirleyin.
   NOT: Burada, karışımın moleküler ağırlığını belirlemek için bir hibrit kütle spektrometresi kullanılmıştır. Bir bileşiğin yapısını tanımladık (bakınız Ek Şekil S1).

6. İstatistiksel analizler

1. Tüm fermantasyon deneylerini altı kez tekrarlayın. Student'ın t-testini kullanarak istatistiksel anlamlılığı değerlendirin. Tüm verileri ortalama ± SD olarak ifade edin, tüm deneyleri üç nüsha olarak tekrarlayın ve istatistiksel anlamlılık için p < 0.05 olarak ayarlayın (*0.01 ≤ p ≤ 0.05, **0.001 ≤ p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001).
2. Metabolitleri temel olarak kütle hatası, alıkonma süresi, izotop eşleşmesi, MS/MS kütüphanesi saflık skoru ve hesaplamalı moleküler formüle dayalı olarak tanımlamak için SCIEX OS yazılımını kullanın. Aşağıdaki kitaplık ayar parametrelerini kullanın: kütle hatası < 5 ppm, izotop oranı farkı < 20 ve kitaplık puanı > 50.

Sonuçlar

Suşların ön tarama sonuçları
MT ile birlikte fermente olabilen mantarları keşfetmek için üç mantar seçtik: G. lucidum, I. obliquus ve O. sinensis. İlk olarak, suşlar aktive edildi: G. lucidum, I. obliquus ve O. sinensis, Şekil 1A-C'de gösterildiği gibi PDA ortamında aşılandı; Şekil 1D-F,

Tartışmalar

Suş tarama deneylerinden sonra, tüm tıbbi mantarların bitki materyalleri üzerinde normal şekilde hayatta kalamayacağını bulduk. Herhangi bir ek ortam olmadan, tıbbi mantarların hayatta kalması, gerekli karbon ve nitrojen kaynaklarını sentezlemek için tıbbi malzemelerdeki bileşenlerin kendi enzimleri aracılığıyla parçalanmasına bağlıdır. I. obliquus'un MT ile birlikte fermente edilebilen G. lucidum ve O. sinensis için, her iki tıbbi m...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20200923
Agar	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., USA	NO.20080107
Autoclave	BinJiang Medical Co., Ltd., Jiangyin, China	LS-50LD
constant shaking incubator	Zhicheng Inc. All rights reserved., Shanghai, China	ZWY-100D
Ganoderma lucidum	BeNa Culture Collection, Beijing, China	31732
Inonotus obliquus	BeNa Culture Collection, Beijing, China	117822
LLC Mouse lung cancer cell	National Infrastructure of Cell Line Resource, Beijing, China	PUMC000673
Male C57BL/6J mice	Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Beiijng, China	No.110011210107024684
Methanol	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20210723
Ophiocordyceps sinensis	BeNa Culture Collection, Beijing, China	118371
Poly tetra fluoroethylene	Jinteng Experiment Equipment Co., Ltd., Tianjing,China	No.997
QTRAP 5500 LC/MS	AB Sciex Pte. Ltd., USA	CV20231711
Rotary Evaporator	BUCHI Co., Ltd., Shanghai, China	R-300
Syringe	Zhiyu Medical Instrument Co., Ltd., Jinagsu, China	V500111
Ultra-clean bench	BOXUN Medica Bioological Instrument Co., Ltd., Shanghai, China	SW-CJ-LFD