Co-fermentation de Marsdenia tenacissima avec Ganoderma lucidum et effet anti-cancer du poumon des produits de fermentation

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour établir un système de co-fermentation systématique et complet afin de produire des produits de biotransformation riches en saponines piquantes en utilisant Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT) comme milieu de fermentation pour Ganoderma lucidum. Cela servira de référence méthodologique pour le développement d’autres drogues ethniques.

Résumé

Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT), en tant que phytothérapie traditionnelle chinoise et Dai, a des propriétés anti-inflammatoires, antibactériennes et antitumorales. Cependant, la plupart de ses principales substances actives sont des aglycones, telles que la ténacigénine A et la ténacigénine B. Comme la biodisponibilité de la MT est faible et que ses composants actifs médicinaux sont difficiles à synthétiser, elle est principalement étudiée par biotransformation. Cette étude vise à produire des produits de biotransformation riches en saponines piquantes en utilisant la MT comme milieu de fermentation pour Ganoderma lucidum (G. lucidum).

Grâce au criblage préliminaire de trois champignons médicinaux, il a été constaté que G. lucidum et Ophiocordyceps sinensis (O. sinensis) peuvent généralement se développer dans le milieu pour la MT ; Par conséquent, l’efficacité de la fermentation des deux types de champignons a été testée à l’aide d’un modèle murin de cancer du poumon. Enfin, la co-fermentation de G. lucidum et de MT a été sélectionnée pour une étude plus approfondie. Une analyse métabolomique non ciblée a été effectuée sur les produits de la co-fermentation de MT avec G. lucidum . Nous avons identifié 12 saponines spécifiques de MT à partir des produits de fermentation, et obtenu un composé monomère, la ténacigénine A, à partir des produits de fermentation.

La majeure partie de la ténacigénine a montré une tendance à la hausse significative, à travers les niveaux de ténacigénine A et de ténacigénine B. Les résultats ont montré que l’efficacité de la MT s’est améliorée après la fermentation par G. lucidum. De plus, la biotransformation des glycosides stéroïdiens en C₂₁ dans la MT a été la réaction centrale dans ce processus de fermentation. En résumé, cette étude a établi un système de co-fermentation systématique et complet et une méthode d’évaluation pharmacodynamique pour la MT, qui ont non seulement amélioré l’utilisation complète des substances actives efficaces dans la MT, mais ont également fourni une référence méthodologique pour le développement d’autres drogues ethniques.

Introduction

Le cancer du poumon appartient à la catégorie des « escarboucles pulmonaires » dans la médecine traditionnelle chinoise. La pathogenèse de l’anthrax pulmonaire est une faiblesse du « Qi » sain des patients, un déséquilibre du Yin et du Yang, des toxines et une stagnation dans les poumons, entraînant un dysfonctionnement pulmonaire, un blocage sanguin et une perte de liquide dans les poumons. Ainsi, la stase sanguine à long terme et les toxines des expectorations dans les poumons forment une masse pulmonaire¹. Par conséquent, le renforcement du Qi et l’élimination des facteurs pathogènes sont le principe de base du traitement du cancer du poumon. Les méthodes de nourrir le Yin pour équilibrer le Yin et le Yang, d’évacuer la chaleur, de détoxifier et de disperser la stagnation, de compléter le Qi et de nourrir le Yin, et d’éliminer les mucosités sont utilisées pour traiter et prévenir la formation d’escarboucles pulmonaires².

Marsdenia tenacissima (MT) est une plante médicinale appartenant à la famille des Asclepiadaceae (Marsdenia ssp.), également connue sous le nom de Wuguteng. Il a pour effet d’évacuer la chaleur et de détoxifier, de soulager la toux et l’asthme, et a des propriétés antitumorales³. L’injection de Xiaoaiping, une préparation à base d’une seule plante de MT, a été largement utilisée dans les cliniques et montre un bon effet anticancéreux^{thérapeutique 4}. Cependant, avec l’augmentation de la population, la demande de MT a fortement augmenté. En conséquence, l’approvisionnement en ressources sauvages de MT est insuffisant et la qualité des matériaux médicinaux cultivés est inégale. Il existe des problèmes tels que la mauvaise qualité des matières végétales, le contenu instable des ingrédients et la faible biodisponibilité, qui menacent sérieusement le développement de la MT. Parmi ces composés bioactifs, les saponines de MT ont été fortement étudiées. Plus de 100 saponines de MT ont été identifiées ; ils peuvent être divisés en deux types principaux : (1) les glycosides stéroïdiens C₂₁ dans la MT, y compris le ténacissoside A-P, le marsdénoside A-M, le ténagénoside A-L et la ténacénine A-D. (2) Triterpènes pentacycliques, tels que l’acide oléanolique et l’acide ursolique. De nombreuses études ont indiqué que l’activité anticancéreuse des extraits d’éther de pétrole est supérieure à celle des molécules hautement polaires de MT. Par conséquent, il est avantageux de convertir le polysaccharide majeur des saponines de MT en un autre aglycone mineur de MT avec une biodisponibilité et des bioactivités plus élevées⁵.

La biotransformation, également connue sous le nom de biocatalyse, fait référence aux réactions physiologiques et biochimiques de la transformation ou de la modification structurelle de substrats exogènes à l’aide d’enzymes apparentées dans les systèmes biologiques⁶. Il est plus économique, plus sûr, sélectif au niveau régional et stéréosélectif que la synthèse chimique traditionnelle et peut produire des composés bioactifs difficiles à préparer par la chimie synthétique conventionnelle ^7,8. Par conséquent, le développement de la médecine traditionnelle chinoise et des médicaments naturels est essentiel pour promouvoir la modernisation et l’internationalisation de la médecine traditionnelle chinoise.

Le système de co-fermentation de MT a été établi par biotransformation. Les matériaux médicinaux originaux ont été transformés par des systèmes d’enzymes microbiennes. D’une part, l’extrait de MT a été utilisé comme substrat pour produire la culture de fermentation de champignons dans ce mode. Dans le même temps, la fermentation fongique a raccourci le cycle de reproduction des bactéries, réduit les coûts de production et amélioré l’efficacité de la production⁹. D’autre part, la précipitation accrue des composants actifs par la fermentation fongique est bénéfique, produisant des composants chimiques et une efficacité améliorée¹⁰. L’utilisation de la technologie de fermentation liquide bidirectionnelle est utile pour protéger les ingrédients actifs des matières médicinales, améliorer l’efficacité, économiser les sources de médicaments et peut produire une meilleure efficacité en fournissant des techniques de modification structurelle des ingrédients actifs des matières végétales. Il est d’une grande importance d’améliorer le niveau de modernisation de la médecine traditionnelle chinoise.

Dans cette étude, G. lucidum, O. sinensis et Inonotus obliquus (I. obliquus) ont été sélectionnés comme microorganismes de fermentation à un stade précoce après l’examen de la littérature, et les souches ont fait l’objet d’un dépistage préliminaire. Ensuite, les souches de fermentation finales ont été déterminées en explorant l’efficacité des souches criblées à travers le modèle murin tumoral. Enfin, les métabolites primaires et secondaires des produits de fermentation ont été systématiquement analysés et évalués par LC-MS, et nous avons obtenu un composé monomère, la ténacigénine A, à partir de produits de fermentation.

Protocole

Cette étude a été menée conformément aux recommandations du Centre pour les animaux expérimentaux de l’Université Minzu (No. ECMUC2019008AA). Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique des animaux d’expérimentation de l’Université Minzu. La MT a été collectée à Kunming, dans la province du Yunnan.

1. Préparation de l’étude

1. Extraire MT à l’eau chaude (100 °C ; MT/eau = 1/10, p/v) pendant 30 min et recueillir le résidu d’extraction MT comme matériau d’essai.
2. Maintenir la lignée cellulaire de cancer du poumon de souris LLC dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine dans une atmosphère humidifiée à 37 °C sous 5 % de CO₂.
3. Conservez les souris C57BL/6J, âgées de 6 à 8 semaines et pesant 19 ± 2 g, dans une pièce à environnement contrôlé avec un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h et avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau. Désinfectez-les régulièrement.

2. Dépistage préliminaire des souches

1. Inoculer trois souches de champignons dans un milieu solide de gélose au dextrose de pomme de terre (PDA) à l’aide de techniques stériles et les cultiver dans l’obscurité à 28 °C. Une fois que la vaisselle est entièrement recouverte de champignons, conservez-la à 4 °C.
2. Inoculer les souches conservées dans le milieu solide PDA dans la solution de graines de la fiole agitée de premier étage et les cultiver à 28 °C, en agitant à 120 tr/min pendant 4 à 5 jours. Inoculer le liquide de champignons de première étape dans la fiole agitée contenant le liquide de champignons secondaires dans un rapport de volume de 1:20 dans un agitateur à température constante pendant 4 à 5 jours.
3. Diluer la MT avec de l’eau à 100 mg/L (MT/eau) et ajouter la solution à la gélose pour former un milieu solide. Inoculer 1 mL du liquide fongique secondaire de chacune des trois souches dans la culture solide contenant uniquement du MT, puis diviser en systèmes de culture G. lucidum-MT, I. obliquus-MT et O. sinensis-MT. Placez ces systèmes de culture à 28 °C sans les secouer dans l’obscurité.
4. Après un certain temps, observez la croissance des souches dans les trois systèmes de culture ci-dessus et sélectionnez les souches qui ne peuvent croître qu’avec la MT pour un dépistage plus approfondi.

3. Resélection de la souche

REMARQUE : Après un dépistage préliminaire, seuls G. lucidum et O. sinensis ont pu se développer normalement sur un milieu solide contenant du MT. Pour sélectionner davantage le système avec un bon effet antitumoral, l’efficacité antitumorale a été testée dans un modèle de souris tumorale transplantée.

1. Inculquer G. lucidum et O. sinensis dans un milieu liquide contenant uniquement du MT-MT avec la co-fermentation de G. lucidum (MGF) et du MT avec la co-fermentation d’O . sinensis (MOF), et faire fermenter pendant 10 jours à 28 °C en agitant à 180 tr/min.
2. Après la fermentation, filtrez le mycélium à travers de la gaze et séchez-le. Extrait à 80 % d’éthanol 3 x 12 h.
3. Vérifiez l’activité antitumorale du MT fermenté et non fermenté chez les souris LLC porteuses de cellules tumorales C57BL / 6J.
   1. Injecter par voie sous-cutanée des cellules LLC (1,0 × 10⁶ cellules dans 0,2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par souris) dans le flanc droit des souris mâles C57BL/6J (sauf dans le groupe témoin).
   2. Pour confirmer l’établissement réussi du modèle, touchez les nodules tumoraux et vérifiez qu’ils mesurent ~5 mm. Regroupez au hasard les souris porteuses de tumeurs (n = 10 par groupe) dans le groupe modèle, le groupe MGF, le groupe MOF, le groupe MT et le groupe cisplatine (contrôle positif). Administrez une solution saline au groupe témoin (pas de cellules tumorales) et au groupe modèle. Sacrifiez les souris après 14 jours de traitement et récupérez le tissu tumoral.

4. Analyse de la composition chimique des produits de fermentation

REMARQUE : Après avoir vérifié l’efficacité de la fermentation, G. lucidum a été sélectionné comme souche de fermentation dans cette étude. Nous avons effectué une analyse métabolomique de la MGF par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS)¹¹.

1. Extraire 10 mg de MT, G. lucidum et MT avec co-fermentation de G. lucidum (MGF) avec 500 μL de méthanol :H₂O (7:3), agiter à 4 °C pendant 1 min, sonicate pendant 30 min et centrifuger pendant 20 min à 1 200 × g. Collectez les surnageants, filtrez-les à travers une membrane de fluorure de polyvinylidène de 0,22 μm et injectez-les dans le dispositif de chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS).
   REMARQUE : Des métabolites séparés par chromatographie liquide ultra-performante (UPLC) et une banque d’échantillons de contrôle de la qualité (CQ) ont été construits par spectrométrie de masse à haute résolution (voir le tableau des matériaux).
2. Utilisez les conditions UPLC suivantes : une colonne C18 (100 mm x 2,1 mm ; 8 μm), de l’acide formique mobile à 0,1 % (v/v) dans de l’eau ultrapure, de l’acétonitrile mobile en phase B. Réglez le profil d’élution du gradient sur 0 min 5 % B ; 2 min 5 % B ; 14 min à 98 % B ; 17 min à 98 % B ; 17,1 min 5 % B ; 20 min 5 % à un débit de 0,3 mL/min.
3. Détecter et identifier les métabolites par spectrométrie de masse à haute résolution. Réglez la température de la colonne à 40 °C, la température de l’injecteur automatique à 4 °C et le volume d’injection à 2 μL. Maintenez les conditions MS suivantes : tension de la source d’ions par électronébulisation : +5 500/-4 500 V ; la pression du gaz rideau, de la source d’ions 1 et de la source d’ions 2 : 35, 60 et 60 psi, respectivement ; la température de la source d’ions : 600 °C ; le potentiel de dépolymérisation : ± 100 V.
4. Préparez les échantillons de contrôle de la qualité (CQ) en mélangeant des volumes égaux d’extraits MT, GL et MGF, et nommez les trois répétitions CQ 1-3, respectivement. Traitez et détectez les échantillons de contrôle qualité et d’analyse en suivant les mêmes étapes. Insérez un échantillon de contrôle de la qualité pour trois échantillons afin d’évaluer la répétabilité de la détection et de l’analyse.

5. Extraction et isolement des produits de fermentation

1. Dissoudre l’extrait de fermentation obtenu à partir du bouillon de fermentation dans de l’eau distillée et bien mélanger.
   REMARQUE : Ici, 2 kg d’extrait de fermentation ont été obtenus à partir de 40 L de bouillon de fermentation.
2. À partir de la section 4, éluer 10 %, 30 %, 50 %, 70 % et 95 % d’éthanol à l’aide d’une colonne de résine d’adsorption macroporeuse et recueillir les fractions.
   REMARQUE : Ici, 10,72 g de la fraction d’éthanol à 95 %, 34,72 g de la fraction d’éthanol à 70 %, 61,57 g de la fraction d’éthanol à 50 % et 79,7 g de la fraction d’éthanol à 30 % ont été obtenus.
3. En fonction de la polarité des fractions, éluer la fraction d’éthanol à 70 % à l’aide de la chromatographie sur colonne de gel de silice avec élution acétate d’éthyle :méthanol et recueillir les fractions.
   REMARQUE : Ici, Fr. 1-Fr. 7 ont été collectés.
4. Effectuer une chromatographie sur colonne Sephadex LH-20 pour purifier davantage les fractions (ici, Fr. 3 et Fr. 4) suivie d’une séparation semi-préparative en phase liquide après purification en utilisant 1,0 g de chaque fraction.
   REMARQUE : En utilisant la chromatographie liquide semi-préparative et la chromatographie sur colonne de gel de silice, nous avons isolé et purifié la fraction d’éthanol à 95 %.
5. Effectuer une microspectroscopie et une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire et comparer la structure du ou des composés avec les structures des bases de données pour 600M et 700M et déterminer la structure plane du ou des composés.
   REMARQUE : Ici, un spectromètre de masse hybride a été utilisé pour déterminer la masse moléculaire du mélange. Nous avons identifié la structure d’un composé (voir la figure supplémentaire S1).

6. Analyses statistiques

1. Répétez toutes les expériences de fermentation six fois. Évaluez la signification statistique à l’aide du test t de Student. Exprimez toutes les données comme la moyenne ± écart-type, répétez toutes les expériences en trois exemplaires et fixez p < 0,05 pour la signification statistique (*0,01 ≤ p ≤ 0,05, **0,001 ≤ p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001).
2. Utilisez le logiciel SCIEX OS pour identifier les métabolites principalement en fonction de l’erreur de masse, du temps de rétention, de la correspondance isotopique, du score de pureté de la bibliothèque MS/MS et de la formule moléculaire computationnelle. Utilisez les paramètres de réglage de la bibliothèque suivants : erreur de masse < 5 ppm, différence de rapport isotopique < 20 et score de bibliothèque > 50.

Résultats

Résultats préliminaires du dépistage des souches
Pour explorer les champignons capables de co-fermenter avec la MT, nous avons sélectionné trois champignons : G. lucidum, I. obliquus et O. sinensis. Tout d’abord, les souches ont été activées : G. lucidum, I. obliquus et O. sinensis ont été inoculés dans le milieu PDA comme le montre la figure 1A-C ...

Discussion

Après des expériences de criblage de souches, nous avons constaté que tous les champignons médicinaux ne peuvent pas survivre normalement sur des matières herbacées. En l’absence de milieu supplémentaire, la survie des champignons médicinaux dépend de la dégradation des composants des matériaux médicinaux par leurs propres enzymes pour synthétiser les sources de carbone et d’azote nécessaires. On peut en déduire que I. obliquus peut ne pas contenir d’enzymes...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20200923
Agar	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., USA	NO.20080107
Autoclave	BinJiang Medical Co., Ltd., Jiangyin, China	LS-50LD
constant shaking incubator	Zhicheng Inc. All rights reserved., Shanghai, China	ZWY-100D
Ganoderma lucidum	BeNa Culture Collection, Beijing, China	31732
Inonotus obliquus	BeNa Culture Collection, Beijing, China	117822
LLC Mouse lung cancer cell	National Infrastructure of Cell Line Resource, Beijing, China	PUMC000673
Male C57BL/6J mice	Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Beiijng, China	No.110011210107024684
Methanol	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20210723
Ophiocordyceps sinensis	BeNa Culture Collection, Beijing, China	118371
Poly tetra fluoroethylene	Jinteng Experiment Equipment Co., Ltd., Tianjing,China	No.997
QTRAP 5500 LC/MS	AB Sciex Pte. Ltd., USA	CV20231711
Rotary Evaporator	BUCHI Co., Ltd., Shanghai, China	R-300
Syringe	Zhiyu Medical Instrument Co., Ltd., Jinagsu, China	V500111
Ultra-clean bench	BOXUN Medica Bioological Instrument Co., Ltd., Shanghai, China	SW-CJ-LFD