Diseño e implementación de un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas

Resumen

Los pulmones ex vivo son útiles para una variedad de experimentos para recopilar datos fisiológicos y excluir las variables de confusión de los experimentos in vivo . Las configuraciones comerciales suelen ser caras y limitadas en cuanto a los tipos de datos que pueden recopilar. Describimos un método para construir una configuración totalmente modular, adaptable a varios diseños de estudio.

Resumen

Las preparaciones pulmonares ex vivo son un modelo útil que puede trasladarse a muchos campos de investigación diferentes, complementando los modelos in vivo e in vitro correspondientes. Los laboratorios que deseen utilizar pulmones aislados deben ser conscientes de los pasos importantes y los desafíos inherentes para establecer una configuración que sea asequible, confiable y que se pueda adaptar fácilmente para adaptarse al tema de interés. Este artículo describe un modelo DIY (hágalo usted mismo) para la ventilación y perfusión pulmonar ex vivo de ratas para estudiar los efectos de los fármacos y los gases sobre el tono vascular pulmonar, independientemente de los cambios en el gasto cardíaco. La creación de este modelo incluye a) el diseño y la construcción del aparato, y b) el procedimiento de aislamiento pulmonar. Este modelo da como resultado una configuración que es más rentable que las alternativas comerciales y, sin embargo, lo suficientemente modular como para adaptarse a los cambios en preguntas de investigación específicas. Hubo que resolver varios obstáculos para garantizar un modelo coherente que pudiera utilizarse en una variedad de temas de investigación diferentes. Una vez establecido, este modelo ha demostrado ser altamente adaptable a diferentes preguntas y puede modificarse fácilmente para diferentes campos de estudio.

Introducción

Las técnicas de perfusión pulmonar ex vivo (EVLP)¹ han experimentado un aumento en su uso en la última década como medio para estudiar los trasplantes pulmonares², la isquemia/reperfusión³, el metabolismo pulmonar⁴ y las respuestas inmunitarias⁵. Los pulmones aislados, pero intactos, ventilados y perfundidos ofrecen la capacidad de evaluar directamente la respuesta de los pulmones, incluida la vasculatura pulmonar, a posibles intervenciones y/o terapias sin posibles factores de confusión, como la entrada neuronal y hormonal o el cambio hemodinámico in vivo. Al mismo tiempo, mantienen la interacción fisiológica de ventilación y perfusión, en contraste con las condiciones in vitro. Una propuesta que analiza las respuestas inmunitarias en los pulmones⁵, por ejemplo, necesita la misma calidad de datos que un estudio centrado en aumentar el tamaño del grupo de donantes⁶ para los trasplantes de pulmón. EVLP se puede usar en una variedad de especies, incluidos ratones³, ratas 7,8,9,10,11,12, cerdos ¹³ y humanos 2. Por lo tanto, es necesario establecer un modelo que pueda producir datos confiables a partir de una variedad de parámetros experimentales diferentes. La relevancia clínica se generará en estudios posteriores utilizando como herramienta el modelo EVLP.

Si bien las configuraciones comerciales están disponibles para su compra para la mayoría de las especies, a menudo pueden tener un costo prohibitivo y confinar a los investigadores a una marca específica de equipo y software patentado. Cualquier desviación de la configuración lista para usar (por ejemplo, pasar de una especie a otra) requiere previsión y trabajar en torno a la configuración proporcionada, lo que puede resultar difícil o imposible. A continuación, se describe una configuración DIY (hágalo usted mismo) para pulmones aislados de rata que es modular y rentable, así como el procedimiento quirúrgico para aislar los pulmones.

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Protocolo

La parte in vivo de los experimentos (desde la anestesia general hasta la eutanasia) requiere la aprobación previa del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) respectivo. Todos los procedimientos descritos en este documento fueron aprobados (número de protocolo M1700168) por la IACUC en el Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt, Nashville, Tennessee, y se realizaron de acuerdo con las pautas ARRIVE¹⁴. Antes de la experimentación, todas las ratas se alojaban en el centro de cuidado de animales del instituto, con libre acceso a agua y comida. Incluyendo diferentes estudios fuera del ámbito de este manuscrito, hemos utilizado un total de 148 ratas Sprague Dawley macho, de 7 a 10 semanas de edad, con un peso entre 250 g y 400 g hasta el momento.

1. Construcción de aparatos

NOTA: Todas las piezas, incluidos los fabricantes respectivos, se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Para mantener cada pieza del equipo en su lugar, construya un entramado hecho a medida para permitir una fácil configuración e incorporación de los nuevos dispositivos (Figura 1). Fije los postes de aluminio (de 1 a 2 pies de largo, 1 cm de diámetro, disponibles en cualquier ferretería) entre sí usando abrazaderas cruzadas para crear un entramado 3D y colóquelos en una bandeja de plástico (30 pulgadas x 21 pulgadas) para evitar derrames de fluidos.
2. Monte los transductores de presión a la misma altura que los pulmones y conéctelos a las vías de la arteria pulmonar (AP), la vena pulmonar (PV) y al tubo de ventilación.
   NOTA: Estos transductores transmiten datos a sus respectivos bioamplificadores conectados al sistema de adquisición de datos (DAQ) y su software.
3. En lugar de usar cánulas disponibles en el mercado, elabore cánulas personalizadas (Figura 2) a partir de segmentos de tubo de plástico duro de 2 mm de ancho que se ensanchan en el extremo, utilizando una llama abierta para permitir el atado seguro de las suturas. Dóblelos en forma de U para reducir la tensión en los pulmones durante la suspensión y para que quepan en la cámara pulmonar.
4. Para hacer la cámara en la que se van a ventilar y perfundir los pulmones, coloque un vaso de precipitados de 1.000 mL dentro de un vaso de precipitados de 1.500 mL con un baño de agua entre los dos y dentro del vaso de precipitados de 1.000 mL, creando un baño maría. Coloque estos vasos de precipitados en una placa calefactora a 48 °C, creando una cámara para los pulmones que sea a la vez húmeda y resistente a las fluctuaciones de temperatura.
5. Mantenga el tampón para el experimento en un matraz aforado de 150 ml colocado sobre una placa calefactora ajustada a 37 °C. Utilice una barra agitadora magnética para hacer circular el tampón dentro del vaso de precipitados. Coloque el menisco del tampón a una altura tal que esté 4 cm por encima del pulmón, para crear una presión innata de 4 cmH₂O sobre el VP. Durante la cirugía, asegúrese de que los pulmones del animal estén a la misma altura que el tampón para reducir la formación de edema hidrostático.
   NOTA: El uso de un matraz minimiza la cantidad de superficie en contacto con el aire de la habitación, lo que minimiza la difusión de gas.
6. Use una bomba de rodillo para mover el tampón a través de un circuito que consta de una bobina de calentamiento y una trampa de aire antes de perfundir el pulmón. Recicle el efluente del PV de nuevo en el matraz volumétrico. Conecte el serpentín de calentamiento y la trampa de aire a un baño de agua circulante también ajustado a 37 °C. Ajuste la temperatura del baño de agua de acuerdo con la velocidad de la bomba, de modo que la perfusión tenga una temperatura constante de 37 °C.

2. Procedimiento

1. Antes del inicio del experimento, prepare la configuración.
   1. Asegúrese de que el software se esté ejecutando (ver más abajo) y recopile datos correctamente.
   2. Calibre todos los transductores de presión diariamente para asegurarse de que no estén a la deriva.
   3. Prepare el tampón (consulte la Tabla 1 para ver los ingredientes de una solución salina fisiológica con albúmina sérica bovina [BSA] al 4%) y asegúrese de que el pH esté en 7,4, utilizando HCl para ajustar en consecuencia. Configure el sistema de perfusión con tampón calentado (Tabla 1) circulando por todas partes, asegurándose de que no haya burbujas de aire. Agregue BSA al menos 30 minutos antes del inicio del experimento para darle tiempo suficiente para disolverse. En ausencia de un oxigenador, burbujee el gas en el tampón de perfusión antes de la adición de BSA con una composición de gas de 65% de N₂, 30% de O₂ y 5% de CO₂ para imitar los niveles de CO₂ de los pulmones in vivo . Esto evita que la solución forme espuma una vez que se agrega BSA.
   4. Prepare el área de operación con todas las herramientas quirúrgicas, suturas y cinta adhesiva necesarias. Incline la tabla de operaciones en un ángulo de 15°, de modo que la rata anestesiada pueda colocarse con la cabeza elevada por encima del resto del cuerpo, y la tráquea y el bloqueo corazón-pulmón puedan manipularse fácilmente.
   5. Con el equipo de protección personal adecuado, pesar a la rata y administrar una inyección intraperitoneal de pentobarbital (65 mg/^kg-1). Después de 10 minutos, use un pellizco en el dedo del pie para asegurarse de que se haya alcanzado el plano quirúrgico de la anestesia general. Administre más anestesia si es necesario.
2. Transfiera la rata al área de operación y fíjela a la placa de operaciones pegando sus patas delanteras por separado, seguidas de las patas traseras juntas, asegurándose de que las patas delanteras estén lo suficientemente sueltas con cinta adhesiva para permitir que se visualice un reflejo de dolor en caso de que la anestesia no sea lo suficientemente profunda (Figura 3A).
3. Asegure la cabeza de la rata tapando la boca con una tira larga y delgada detrás de los dientes frontales, sin restringir la lengua o el flujo de aire para la rata que aún respira espontáneamente (Figura 3B).
4. Realice una traqueotomía pellizcando la piel por encima de la tráquea con fórceps y cortando con tijeras quirúrgicas. Con pinzas curvas, diseccione sin rodeos el músculo y el tejido para llegar a la tráquea. Asegúrese de que no haya sangrado durante este paso.
   1. Pase pinzas curvas por debajo de la tráquea y ábralas para dejar espacio para pasar 3-0 suturas por debajo que luego se pueden preatar en un nudo de caja (Figura 3B). Haga una pequeña incisión entre los anillos cartilaginosos de la tráquea e inserte la cánula traqueal (aguja modificada de 18 G con tubo de 1 mm de diámetro pegado alrededor de la punta para crear una muesca). Ate la sutura, asegurándose de que no pueda escapar aire de la incisión traqueal y de que la cánula no ejerza ninguna presión sobre la tráquea.
5. Configure el ventilador para que funcione con una mezcla de gases de 30% O₂, 5% de CO₂ y 65% N₂, con un volumen corriente (VT) de 10 mL/kg, una presión final espiratoria positiva (PEEP) de 0 cmH₂O y una tasa de 60 respiraciones/min.
6. Una vez que la cánula traqueal esté asegurada con la sutura, comience a ventilar la rata con los ajustes anteriores.
   NOTA: El método quirúrgico utilizado fue adaptado de Nelson et ^al.9 y se describe paso a paso.
7. Retira el pelaje del abdomen de la rata con unas tijeras quirúrgicas grandes y unas pinzas.
   NOTA: Los ungüentos depilatorios también se pueden usar antes del inicio del experimento.
8. Mientras sostiene la apófisis xifoides con pinzas, haga una pequeña incisión horizontal debajo de las costillas, asegurándose de que el diafragma permanezca intacto. Una vez que se puedan visualizar los órganos internos de manera segura, amplíe el corte horizontal para exponer todo el diafragma.
9. Con extremo cuidado para evitar perforar los pulmones, inyecte heparina (3.000 U/^kg-1) en la vena cava inferior (IVC) con una jeringa de 22 G.
10. Una vez más, sostenga la apófisis xifoides con fórceps y corte cranealmente a lo largo del esternón mientras visualiza constantemente los pulmones para evitar cortarlos.
11. Para ver correctamente el bloqueo corazón-pulmón, separe la caja torácica con dos pinzas grandes y asegúrese de evitar romperse las costillas, lo que puede resultar en un fragmento de hueso afilado que perfore el pulmón (Figura 3C).
    NOTA: Una vez abierta la caja torácica, utilizar un PEEP de 2-3 cmH₂O, fijado por una esclusa de agua fijada a la extremidad espiratoria del ventilador, para evitar atelectasias.
12. En este momento, corte la VCI para sacrificar a la rata mediante exanguinación. Asegúrese cuidadosamente de que haya pasado al menos 1 minuto desde la inyección de heparina (ver paso 2.9) para darle tiempo suficiente para circular y prevenir la formación de microcoágulos en los pulmones.
13. Al colocar las cánulas de perfusión, revise constantemente las presiones para asegurarse de que no se produzcan cambios bruscos.
    NOTA: Un aumento repentino de la presión mientras la bomba funciona a una velocidad constante indica la formación de un bloqueo, mientras que una disminución repentina puede indicar una fuga.
14. Recorte cualquier exceso de timo para permitir una visualización más fácil de la vasculatura pulmonar. Localice el PA, pase unas pinzas pequeñas y curvas por debajo, y de nuevo pase una sutura 3-0 por debajo y preátelo en un nudo de caja.
15. Haga una pequeña incisión en el ventrículo derecho del corazón e inserte la cánula PA (hecha de un tubo de plástico de 2 mm de diámetro ensanchado en el extremo con una llama abierta para permitir que las suturas se aten alrededor), siendo suave para evitar la ruptura de la arteria adyacente. Asegure la cánula con la sutura y la perfusión, a partir de 1,5 mL/^min-1 (Figura 3D).
16. Extirpe inmediatamente el ápice del corazón para evitar la acumulación de presión en los pulmones. Con pinzas pequeñas y curvas, rompa la válvula mitral y asegúrese visualmente de que las pinzas puedan entrar en la aurícula izquierda sin restricciones.
17. Coloque una sutura 3-0 preatada alrededor del corazón por debajo de la aurícula (Figura 3E).
18. Inserte la cánula PV (construcción similar a la cánula PA) en la aurícula izquierda y asegúrese de que el tampón pueda salir de ella antes de atar la sutura.
    NOTA: Es fundamental que la cánula PV se coloque más allá de la válvula mitral para garantizar que se pueda atar correctamente, sin que se coloque demasiado profunda como para dañar el flujo PV o el gravamen (Figura 3E). Tenga mucho cuidado al atar la sutura, ya que atarla demasiado floja da como resultado una pérdida de flujo, mientras que atarla demasiado puede dañar el corazón, debilitar la colocación de la cánula y potencialmente causar fugas.
19. Recorte el exceso de tejido entre la cavidad torácica y la incisión de la traqueostomía con unas tijeras de punta roma para evitar dañar la tráquea. Asegúrese de que toda la tráquea por debajo de la cánula traqueal y todo el bloqueo corazón-pulmón sean visibles.
20. Retire el bloqueo corazón-pulmón y la tráquea sosteniendo la cánula traqueal y extirpando el tejido conectivo detrás de la tráquea con un par de tijeras curvas de punta roma, dejando el esófago unido para un soporte estructural adicional (Figura 3F).
21. Aumente gradualmente el caudal hasta un caudal máximo de 40 mL/^kg-1/^min-1. Permita que los primeros 50 ml de tampón salgan del sistema para eliminar cualquier citocina inflamatoria que pueda liberarse (Figura 3G).
22. Mueva suavemente los pulmones aislados a la cámara de baño maría creada con los dos vasos de precipitados. Asegúrese de que la cánula PA, PV o traqueal no se tuerza en ningún momento mientras mueve los pulmones o los cuelga.
    NOTA: La prevención de atelectasias durante la extracción pulmonar y la conexión a la instalación es importante, especialmente cuando se utiliza EVLP para pulmones ya dañados o cuando se planifican intervenciones previas a EVLP. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante un pequeño clip en la tráquea después de la inspiración antes de la transferencia al ventilador¹⁵.

3. Adquisición de datos

1. Para la recopilación de datos, utilice cualquier convertidor de analógico a digital y sistema DAQ disponibles en el mercado.
2. Preste atención a que la frecuencia de muestreo sea suficiente para el propósito dado (200 Hz aquí) y que todos los parámetros dependientes relevantes de los bioamplificadores y otros dispositivos de entrada se recopilen simultáneamente (presión de las vías respiratorias, PA y presión PV elegidas para este protocolo)¹⁶.
3. Registre parámetros independientes (p. ej., velocidad de perfusión, tasa de ventilación, composición del gas ventilado, composición del electrolito tampón y peso pulmonar).

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Resultados

Después de 10 minutos de estabilización y lecturas basales, aleatorizamos un primer grupo de 10 ratas Sprague Dawley macho en cinco grupos pequeños: isquemia global sin flujo durante 5, 7,5, 8, 9 o 10 minutos (n = 2 por grupo) seguida de reperfusión; Estos experimentos preliminares limitados de búsqueda de dosis se llevaron a cabo para identificar el tiempo de isquemia más largo posible para permitir una ventilación y reperfusión suficientes antes del desarrollo final de un aumento precipitado e irreversible de l...

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Discusión

Se han realizado con éxito más de 100 experimentos en nuestro laboratorio utilizando esta configuración. El diseño modular de esta configuración personalizada proporcionó una gran flexibilidad a los posibles cambios en los requisitos experimentales. Mientras que otras configuraciones utilizan un desoxigenador¹⁸ para imitar el consumo constante de oxígeno y la producción de CO₂ por parte de los órganos terminales, este modelo simplificado no empleó esta característica, debido ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
1,500 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
Air Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149
Bioamplifiers	CWE Inc	BPM-832
Clamps	Fisher Scientific	S02626
DAQ (Data Acquisition)	National Instruments, Austin, TX	NI USB-6343
Gas Mixer	CWE Inc, Ardmore, PA	GSM-4
Heating Coil	Radnoti, Covina, CA	158822
Heating Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	11-100-49SH
Heparin	Pfizer	W63422
LabVIEW Full Development System 2014	National Instruments
Pentobarbital	Diamondback Drugs	G2270-0235-50
pH700 Probe	OAKTON, Vernon Hills, IL	EW-35419-10
Polystat Water Bath	Cole-Parmer	EW-12121-02
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Model 683
Roller Pump	Cole-Parmer, Wertheim, Germany	Ismatec REGLO Digital MS 2/8
Sprague Dawley Rat	Charles River, Wilmington, MA	Strain code 001
VetScan i-STAT	Abraxis, Chicago, IL	i-STAT 1