大鼠 离体 肺灌注模型的设计和实现

摘要

离体 肺可用于各种实验，以收集生理数据，同时排除 体内 实验的混杂变量。商业设置通常很昂贵，并且它们可以收集的数据类型有限。我们描述了一种构建完全模块化设置的方法，适用于各种研究设计。

摘要

离体 肺制剂是一种有用的模型，可以转化为许多不同的研究领域，补充相应的 体内 和 体外 模型。希望使用离体肺的实验室需要了解重要步骤和固有挑战，以建立经济实惠、可靠且易于适应感兴趣主题的设置。本文描述了一种 离体 大鼠肺通气和灌注的 DIY（自己动手）模型，以研究药物和气体对肺血管张力的影响，而与心输出量的变化无关。创建此模型包括 a） 设备的设计和构造，以及 b） 肺隔离程序。该模型产生的设置比商业替代方案更具成本效益，但模块化程度足以适应特定研究问题的变化。必须解决各种障碍，以确保模型能够用于各种不同的研究主题。一旦建立，该模型已被证明对不同的问题具有高度适应性，并且可以很容易地针对不同的研究领域进行更改。

引言

在过去十年中，离体肺灌注^（EVLP） 技术 1 作为研究肺移植²、缺血/再灌注³、肺代谢⁴ 和免疫反应⁵ 的手段的使用有所增加。孤立但完整的通气和灌注肺提供了至关重要的能力，可以直接评估肺部（包括肺血管系统）对潜在干预和/或治疗的反应，而没有潜在的混杂因素，例如神经元和激素输入或体内血流动力学的变化。同时，与体外条件相比，它们保持通气和灌注的生理相互作用。例如，一项研究肺免疫反应⁵（immune responses in lungs）的提案，需要与一项侧重于增加肺移植供体库规模⁶（donor pool size）的研究相同的数据质量。EVLP 可用于多种物种，包括小鼠³、大鼠^{7、8、9、10、11、12}、猪¹³ 和人类²。因此，有必要建立一个能够从各种不同的实验参数中产生可靠数据的模型。将使用 EVLP 模型作为工具在后续研究中生成临床相关性。

虽然大多数物种都可以购买商业设置，但它们通常成本高昂，并且将研究人员限制在特定品牌的设备和专有软件中。任何与开箱即用设置的偏差（例如，从一个物种到另一个物种）都需要有远见并围绕提供的设置工作，这可能被证明是困难或不可能的。在下文中，描述了一种用于大鼠离体肺的 DIY（自己动手）设置，该装置既模块化又具有成本效益，以及用于离肺的外科手术。

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研究方案

实验的 体内 部分（从全身麻醉到安乐死）需要事先获得相应机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。此处描述的所有程序均已获得田纳西州纳什维尔范德堡大学医学中心的 IACUC 的批准（协议编号 M1700168），并按照 ARRIVE 指南¹⁴ 执行。在实验之前，所有大鼠都被安置在研究所的动物护理设施中，可以免费获得水和食物。包括本手稿范围之外的不同研究，我们总共使用了 148 只雄性 Sprague Dawley 大鼠，年龄为 7-10 周龄，体重在 250 克至 400 克之间。

1. 设备构造

注意:所有零件，包括各自的制造商，均列在 材料表中。

1. 为了将每台设备固定到位，构建一个定制的晶格，以便轻松配置和整合新设备（图 1）。使用交叉夹将铝杆（1 至 2 英尺长，直径 1 厘米，可在任何五金店购买）相互连接，形成 3D 晶格，并放置在塑料托盘（30 英寸 x 21 英寸）上，以防止液体溢出。
2. 将压力传感器安装在与肺部等高的位置，并将它们连接到肺动脉 （PA）、肺静脉 （PV） 和通气管。
   注意:这些传感器将数据传输到连接到数据采集系统 （DAQ） 及其软件的相应生物放大器。
3. 与其使用市售的套管，不如用 2 毫米宽的硬塑料管段制作定制的插管（图 2），这些管段在末端呈喇叭形，使用明火允许牢固地系扎缝合线。将它们弯曲成 U 形，以减少悬挂时对肺部的压力并适合肺腔。
4. 为了使肺室通气和灌注，将 1,000 mL 烧杯放入 1,500 mL 烧杯中，在两者之间和 1,000 mL 烧杯内放置水浴，形成一个双锅炉。将这些烧杯放在设置为 48 °C 的加热板上，为肺部创建一个既潮湿又能抵抗温度波动的腔室。
5. 将实验缓冲液保存在 150 mL 容量瓶中，置于设置为 37 °C 的加热板上。 使用磁力搅拌棒使缓冲液在烧杯内循环。将缓冲液的弯月面设置在肺上方 4 cm 的高度，以在 PV 上产生先天式 4 cmH₂O 的压力。在手术过程中，确保动物的肺与缓冲液处于同一高度，以减少静水水肿的形成。
   注:使用培养瓶可最大限度地减少与室内空气接触的表面积，从而最大限度地减少气体扩散。
6. 在灌注肺之前，使用滚轮泵将缓冲液通过由加热线圈和气穴组成的回路。将 PV 中的流出物回收回容量瓶中。将加热盘管和空气阱连接到同样设置为 37 °C 的循环水浴上。 根据泵速调节水浴的温度，使灌注液的温度恒定为 37 °C。

2. 操作步骤

1. 在实验开始之前，请准备设置。
   1. 确保软件正在运行（见下文）并正确收集数据。
   2. 每天校准所有压力传感器，以确保它们不会漂移。
   3. 准备缓冲液（参见表 1 了解含有 4% 牛血清白蛋白 [BSA] 的生理盐水溶液的成分）并确保 pH 值为 7.4，使用 HCl 进行相应调整。设置灌注系统，加热的缓冲液（表 1）在整个过程中循环，确保不存在气泡。在实验开始前至少 30 分钟添加 BSA，使其有足够的时间溶解。在没有氧合器的情况下，在添加气体成分为 65% N₂、30% O₂ 和 5% CO₂ 的 BSA 之前，将气体鼓泡到灌注缓冲液中，以模拟体内肺的 CO₂ 水平。这可以防止溶液在添加 BSA 后起泡。
   4. 用所有必要的手术工具、缝合线和胶带准备手术区域。将手术板倾斜 15° 角，使麻醉大鼠的头部高于身体其他部位，并且可以轻松操作气管和心肺阻滞。
   5. 穿戴适当的个人防护设备，称量大鼠并腹膜内注射戊巴比妥 （65 mg/^kg-1）。10 分钟后，用脚趾捏确保已到达全身麻醉的手术平面。如有必要，给予更多的麻醉剂。
2. 将大鼠转移到手术区域，并通过分别用胶带固定其前腿，然后将后腿并拢，确保前腿的胶带足够松，以便在麻醉不够深的情况下可以看到疼痛反射（图 3A）。
3. 通过在门牙后面用一条细长的条带粘住嘴巴来固定大鼠的头部，而不会限制仍然自主呼吸的大鼠的舌头或气流（图 3B）。
4. 使用镊子捏住气管上方的皮肤并用手术剪刀切割，进行气管切开术。使用弯曲的镊子，钝性地解剖肌肉和组织以到达气管。确保在此步骤中没有出血。
   1. 将弯曲的镊子穿过气管下方并打开它们，以便有空间通过下面的 3-0 缝合线，然后可以预先打成一个箱结（图 3B）。在气管的软骨环之间做一个小切口，然后插入气管插管（修改后的 18 G 针，直径为 1 毫米的管子粘在尖端上以形成一个缺口）。系紧缝合线，确保没有空气可以从气管切口逸出，并且套管不会对气管造成任何压力。
5. 将呼吸机设置为使用 30% O₂、5% CO₂ 和 65% N₂ 的气体混合物运行， 潮气量 （VT） 为 10 mL/kg，呼 气末正压 （PEEP） 为 0 cmH₂O，呼吸 频率为 60 次/分钟。
6. 用缝合线固定气管插管后，开始用上述设置给大鼠通气。
   注意:使用的手术方法改编自 Nelson 等人 ⁹ 并逐步描述。
7. 使用大手术剪刀和镊子从大鼠腹部去除毛发。
   注意:脱毛软膏也可以在实验开始前使用。
8. 在用镊子固定剑突的同时，在肋骨下方做一个小的水平切口，确保隔膜保持完整。一旦可以安全地看到内部器官，就加宽水平切口以露出整个隔膜。
9. 要格外小心，避免刺穿肺部，用 3,000 G 注射器将肝素 （22 U/^kg-1） 注射到下腔静脉 （IVC） 中。
10. 同样，用镊子握住剑突，沿着胸骨颅骨切开，同时不断观察肺部以防止割伤它们。
11. 为了正确看到心肺阻滞，请使用两个大镊子将胸腔分开，并确保避免折断肋骨，这可能会导致锋利的骨头碎片刺穿肺部（图 3C）。
    注意:胸腔打开后，使用 2-3 cmH₂O 的 PEEP，由连接到呼吸机呼气肢的水锁设置，以避免肺不张。
12. 此时，切开 IVC 以通过放血对大鼠实施安乐死。小心确保注射肝素后至少已经过去了 1 分钟（参见步骤 2.9），以使其有足够的时间循环并防止肺部出现微凝块。
13. 放置灌注插管时，请不断检查压力以确保不会发生突然变化。
    注意:当泵以恒定速度运行时，压力突然升高表明堵塞形成，而突然降低则表明泄漏。
14. 修剪任何多余的胸腺，以便更容易地观察肺血管系统。找到 PA，将小而弯曲的镊子穿过下面，然后再次在下面穿过 3-0 缝合线并预先打成一个箱形结。
15. 在心脏的右心室做一个小切口，插入 PA 插管（由直径 2 毫米的塑料管制成，末端使用明火张开，以便缝合），轻柔地避免相邻动脉破裂。使用缝合线和灌注固定套管，从 1.5 mL/^min-1 开始（图 3D）。
16. 立即切除心尖，以避免肺部压力积聚。使用小的弯曲镊子，打破二尖瓣，并目视确保镊子能够不受限制地进入左心房。
17. 在心房下方的心脏周围放置一根预先打结的 3-0 缝合线（图 3E）。
18. 将 PV 套管（类似于 PA 套管的结构）插入左心房，并确保缓冲液可以在系扎缝合线之前从中流出。
    注意:将 PV 套管放置在二尖瓣上方至关重要，以确保它可以正确系扎，同时不要放置得太深以至于伤害 PV 或阻碍流（图 3E）。打结缝线时要格外小心，因为打得太松会导致血流丢失，而打得太紧会损坏心脏，削弱套管的位置并可能导致渗漏。
19. 使用钝头剪刀修剪胸腔和气管切开切口之间的多余组织，以避免损坏气管。确保可以看到气管插管下方的整个气管和整个心肺阻滞。
20. 握住气管插管并用一把弯曲的钝头剪刀切除气管后面的结缔组织，去除心肺阻滞和气管，留下连接食道以获得额外的结构支撑（图 3F）。
21. 逐渐增加流速至最大流速 40 mL/^kg-1/^min-1。让前 50 mL 缓冲液流出系统，以去除可能释放的任何炎性细胞因子（图 3G）。
22. 轻轻地将分离的肺移动到用两个烧杯创建的双锅炉室中。确保 PA、PV 或气管插管在移动肺部或悬挂肺部时在任何位置都不会扭曲。
    注意:在取肺和连接到装置期间预防肺不张很重要，尤其是当 EVLP 用于已经受损的肺或计划在 EVLP 之前进行干预时。这可以通过例如，在转移到呼吸机¹⁵ 之前吸气后在气管上放一个小夹来实现。

3. 数据采集

1. 对于数据收集，请使用任何市售的模数转换器和 DAQ 系统。
2. 请注意，采样频率足以满足给定目的（此处为 200 Hz），并且同时收集来自生物放大器和其他输入设备的所有相关相关参数（为本协议选择的气道压力、PA 和 PV 压力）¹⁶。
3. 记录独立参数（例如，灌注速度、通气率、通气气体成分、缓冲液电解质成分和肺重量）。

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结果

在 10 分钟的稳定和基线读数后，我们将第一组 10 只雄性 Sprague Dawley 大鼠随机分为五个小组:整体无流缺血 5、7.5、8、9 或 10 分钟（每组 n = 2），然后再灌注;进行这些有限的初步剂量探索实验，以确定在气道压力和水肿形成最终急剧且不可逆地增加之前，仍允许足够的通气和再灌注的最长缺血时间。重要的是，在缺血期间，我们选择不停止通气，而是将其频率从 60 次呼吸/min-1 降低到 20 次/^min-1...

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讨论

使用这种设置在我们的实验室中成功进行了 100 多次实验。这种定制装置的模块化设计为实验要求的潜在变化提供了极大的灵活性。虽然其他设置使用脱氧器¹⁸ 来模拟终末器官的恒定耗氧量和 CO₂ 产生，但这种简化模型没有采用此功能，因为重点是研究不同气体成分对肺血管张力的影响。这种方法中 CO₂ 仅由吸入气体浓度控制，也允许独立于微小通气对 CO₂...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
1,500 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
Air Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149
Bioamplifiers	CWE Inc	BPM-832
Clamps	Fisher Scientific	S02626
DAQ (Data Acquisition)	National Instruments, Austin, TX	NI USB-6343
Gas Mixer	CWE Inc, Ardmore, PA	GSM-4
Heating Coil	Radnoti, Covina, CA	158822
Heating Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	11-100-49SH
Heparin	Pfizer	W63422
LabVIEW Full Development System 2014	National Instruments
Pentobarbital	Diamondback Drugs	G2270-0235-50
pH700 Probe	OAKTON, Vernon Hills, IL	EW-35419-10
Polystat Water Bath	Cole-Parmer	EW-12121-02
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Model 683
Roller Pump	Cole-Parmer, Wertheim, Germany	Ismatec REGLO Digital MS 2/8
Sprague Dawley Rat	Charles River, Wilmington, MA	Strain code 001
VetScan i-STAT	Abraxis, Chicago, IL	i-STAT 1