Desenho e Implementação de um Modelo de Perfusão Pulmonar Ex Vivo de Rato

Resumo

Os pulmões ex vivo são úteis para uma variedade de experimentos para coletar dados fisiológicos, excluindo as variáveis de confusão dos experimentos in vivo . As configurações comerciais geralmente são caras e limitadas nos tipos de dados que podem coletar. Descrevemos um método para construir uma configuração totalmente modular, adaptável para vários projetos de estudo.

Resumo

As preparações pulmonares ex vivo são um modelo útil que pode ser traduzido para muitos campos diferentes de pesquisa, complementando os modelos in vivo e in vitro correspondentes. Os laboratórios que desejam usar pulmões isolados precisam estar cientes das etapas importantes e dos desafios inerentes para estabelecer uma configuração acessível, confiável e que possa ser facilmente adaptada para se adequar ao tópico de interesse. Este artigo descreve um modelo DIY (faça você mesmo) para ventilação e perfusão pulmonar ex vivo de ratos para estudar os efeitos de drogas e gases no tônus vascular pulmonar, independentemente de alterações no débito cardíaco. A criação deste modelo inclui a) o projeto e a construção do aparelho e b) o procedimento de isolamento pulmonar. Esse modelo resulta em uma configuração mais econômica do que as alternativas comerciais e, no entanto, modular o suficiente para se adaptar a mudanças em questões específicas de pesquisa. Vários obstáculos tiveram que ser resolvidos para garantir um modelo consistente que seja capaz de ser usado para uma variedade de tópicos de pesquisa diferentes. Uma vez estabelecido, esse modelo provou ser altamente adaptável a diferentes questões e pode ser facilmente alterado para diferentes campos de estudo.

Introdução

As técnicas de perfusão pulmonar ex vivo (EVLP)¹ tiveram um aumento no uso na última década como meio de estudar transplantes pulmonares², isquemia/reperfusão³, metabolismo pulmonar⁴ e respostas imunes⁵. Pulmões isolados, mas intactos, ventilados e perfundidos oferecem a capacidade criticamente importante de avaliar diretamente a resposta dos pulmões, incluindo a vasculatura pulmonar, a possíveis intervenções e/ou terapêuticas sem potenciais fatores de confusão, como entrada neuronal e hormonal ou alteração hemodinâmica in vivo. Ao mesmo tempo, eles mantêm a interação fisiológica de ventilação e perfusão, em contraste com as condições in vitro. Uma proposta que analisa as respostas imunes nos pulmões⁵, por exemplo, precisa da mesma qualidade de dados que um estudo focado em aumentar o tamanho do pool de doadores⁶ para transplantes de pulmão. A EVLP pode ser usada em uma variedade de espécies, incluindo camundongos³, ^ratos 7,8,9,10,11,12, porcos 13 e humanos 2. Portanto, é necessário estabelecer um modelo que possa produzir dados confiáveis a partir de uma variedade de parâmetros experimentais diferentes. A relevância clínica será gerada em estudos subsequentes usando o modelo EVLP como ferramenta.

Embora as configurações comerciais estejam disponíveis para compra para a maioria das espécies, elas geralmente podem ter um custo proibitivo e confinar os pesquisadores a uma marca específica de equipamento e software proprietário. Qualquer desvio da configuração pronta para uso (por exemplo, ir de uma espécie para outra) requer previsão e trabalho em torno da configuração fornecida, o que pode ser difícil ou impossível. A seguir, uma configuração DIY (faça você mesmo) para pulmões isolados de ratos que é modular e econômica, bem como o procedimento cirúrgico para isolar os pulmões, são descritos.

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Protocolo

A parte in vivo dos experimentos (da anestesia geral à eutanásia) requer aprovação prévia do respectivo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados (número de protocolo M1700168) pela IACUC no Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee, e foram realizados em conformidade com as diretrizes ARRIVE¹⁴. Antes da experimentação, todos os ratos foram alojados nas instalações de cuidados com animais do instituto, com acesso gratuito a água e comida. Incluindo diferentes estudos fora do alcance deste manuscrito, usamos um total de 148 ratos Sprague Dawley machos, de 7 a 10 semanas de idade, com peso entre 250 g e 400 g até o momento.

1. Construção de aparelhos

NOTA: Todas as peças, incluindo os respectivos fabricantes, estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Para manter cada equipamento no lugar, construa uma treliça personalizada para permitir fácil configuração e incorporação dos novos dispositivos (Figura 1). Prenda postes de alumínio (1 a 2 pés de comprimento, 1 cm de diâmetro, disponíveis em qualquer loja de ferragens) uns aos outros usando grampos cruzados para criar uma treliça 3D e coloque em uma bandeja de plástico (30 pol x 21 pol) para evitar derramamento de fluidos.
2. Monte os transdutores de pressão a uma altura igual aos pulmões e conecte-os às linhas da artéria pulmonar (AP), veia pulmonar (VP) e ao tubo de ventilação.
   NOTA: Esses transdutores transmitem dados para seus respectivos bioamplificadores conectados ao sistema de aquisição de dados (DAQ) e seu software.
3. Em vez de usar cânulas disponíveis comercialmente, crie cânulas personalizadas (Figura 2) a partir de segmentos de tubos de plástico rígido de 2 mm de largura que são alargados na extremidade, usando uma chama aberta para permitir a amarração segura das suturas. Dobre-os em forma de U para reduzir o estresse nos pulmões durante a suspensão e para caber na câmara pulmonar.
4. Para fazer a câmara em que os pulmões devem ser ventilados e perfundidos, coloque um béquer de 1.000 mL dentro de um copo de 1.500 mL com banho-maria entre os dois e dentro do béquer de 1.000 mL, criando um banho-maria. Coloque esses béqueres em uma placa de aquecimento regulada para 48 °C, criando uma câmara para os pulmões que seja úmida e resistente às flutuações de temperatura.
5. Manter o tampão para a experiência num balão volumétrico de 150 ml colocado numa placa de aquecimento regulada para 37 °C. Use uma barra de agitação magnética para circular o tampão dentro do copo. Ajuste o menisco do tampão a uma altura tal que fique 4 cm acima do pulmão, para criar uma pressão inata de 4 cmH₂O na VP. Durante a cirurgia, certifique-se de que os pulmões do animal estejam na mesma altura do tampão para reduzir a formação de edema hidrostático.
   NOTA: O uso de um frasco minimiza a quantidade de área de superfície em contato com o ar ambiente, o que minimiza a difusão do gás.
6. Use uma bomba de rolo para mover o buffer através de um circuito que consiste em uma serpentina de aquecimento e um coletor de ar antes de perfundir o pulmão. Reciclar o efluente do PV de volta para o balão volumétrico. Conecte a serpentina de aquecimento e o coletor de ar a um banho-maria circulante também regulado para 37 °C. Ajuste a temperatura do banho-maria de acordo com a velocidade da bomba, para que o perfusato tenha uma temperatura constante de 37 °C.

2. Procedimento

1. Antes do início do experimento, prepare a configuração.
   1. Certifique-se de que o software esteja em execução (veja abaixo) e coletando dados corretamente.
   2. Calibre todos os transdutores de pressão diariamente para garantir que não estejam à deriva.
   3. Prepare o tampão (consulte a Tabela 1 para ingredientes para uma solução salina fisiológica com albumina de soro bovino a 4% [BSA]) e certifique-se de que o pH esteja em 7,4, usando HCl para ajustar de acordo. Configure o sistema de perfusão com tampão aquecido (Tabela 1) circulando por toda parte, garantindo que não haja bolhas de ar. Adicione BSA pelo menos 30 minutos antes do início do experimento para dar tempo suficiente para se dissolver. Na ausência de um oxigenador, borbulhe gás no tampão de perfusão antes da adição de BSA com uma composição gasosa de 65% de N₂, 30% de O₂ e 5% de CO₂ para imitar os níveis de CO₂ dos pulmões in vivo . Isso evita que a solução espume depois que o BSA é adicionado.
   4. Prepare a área de operação com todas as ferramentas cirúrgicas, suturas e fitas adesivas necessárias. Incline a prancha cirúrgica em um ângulo de 15°, de modo que o rato anestesiado possa ser posicionado com a cabeça elevada acima do resto do corpo, e o bloqueio traqueia e coração-pulmão possam ser manipulados facilmente.
   5. Usando equipamento de proteção individual adequado, pesar o rato e administrar uma injeção intraperitoneal de pentobarbital (65 mg / ^kg-1). Após 10 min, use uma pinça no dedo do pé para garantir que o plano cirúrgico da anestesia geral tenha sido alcançado. Administre mais anestésico, se necessário.
2. Transfira o rato para a área de operação e fixe-o na placa cirúrgica prendendo as patas dianteiras separadamente, seguidas pelas patas traseiras juntas, certificando-se de que as patas dianteiras estejam soltas o suficiente para permitir que um reflexo de dor seja visualizado caso a anestesia não seja profunda o suficiente (Figura 3A).
3. Prenda a cabeça do rato prendendo a boca com uma tira longa e fina atrás dos dentes da frente, sem restringir a língua ou o fluxo de ar para o rato que ainda respira espontaneamente (Figura 3B).
4. Realize uma traqueostomia beliscando a pele acima da traqueia usando uma pinça e cortando com uma tesoura cirúrgica. Usando uma pinça curva, disseque sem rodeios o músculo e o tecido para alcançar a traqueia. Certifique-se de que não haja sangramento durante esta etapa.
   1. Passe uma pinça curva por baixo da traqueia e abra-a para permitir que haja espaço para passar suturas 3-0 por baixo, que podem ser pré-amarradas em um nó de caixa (Figura 3B). Faça uma pequena incisão entre os anéis de cartilagem da traqueia e insira a cânula traqueal (agulha 18 G modificada com tubo de 1 mm de diâmetro colado ao redor da ponta para criar um entalhe). Amarre a sutura, garantindo que nenhum ar possa escapar da incisão traqueal e que a cânula não esteja sobrecarregando a traqueia.
5. Defina o ventilador para funcionar com uma mistura de gases de 30% O₂, 5% CO₂ e 65% N₂, com um volume corrente (VT) de 10 mL / kg, uma pressão expiratória final positiva (PEEP) de 0 cmH₂O e uma frequência de 60 respirações / min.
6. Uma vez que a cânula traqueal esteja presa com a sutura, comece a ventilar o rato com as configurações acima.
   NOTA: O método cirúrgico utilizado foi adaptado de Nelson et ^al.9 e é descrito passo a passo.
7. Remova o pelo do abdômen do rato usando uma grande tesoura cirúrgica e uma pinça.
   NOTA: Pomadas de depilação também podem ser usadas antes do início do experimento.
8. Enquanto segura o processo xifóide com uma pinça, faça uma pequena incisão horizontal abaixo das costelas, garantindo que o diafragma permaneça intacto. Uma vez que os órgãos internos possam ser visualizados com segurança, amplie o corte horizontal para expor todo o diafragma.
9. Tomando extremo cuidado para evitar perfurar os pulmões, injete heparina (3.000 U/^kg-1) na veia cava inferior (VCI) com uma seringa de 22 G.
10. Novamente, segure o processo xifóide com uma pinça e corte cranialmente ao longo do esterno enquanto visualiza constantemente os pulmões para evitar cortá-los.
11. Para ver corretamente o bloqueio coração-pulmão, afaste a caixa torácica usando duas pinças grandes e certifique-se de evitar quebrar as costelas, o que pode resultar em um fragmento ósseo pontiagudo perfurando o pulmão (Figura 3C).
    NOTA: Uma vez aberta a caixa torácica, use uma PEEP de 2-3 cmH₂O, definida por uma trava de água presa ao ramo expiratório do ventilador, para evitar atelectasia.
12. Neste momento, corte o IVC para sacrificar o rato por exsanguinação. Certifique-se cuidadosamente de que pelo menos 1 minuto se passou desde a injeção de heparina (consulte a etapa 2.9) para dar tempo suficiente para circular e evitar microcoágulos nos pulmões.
13. Ao colocar as cânulas de perfusão, verifique constantemente as pressões para garantir que não ocorram mudanças bruscas.
    NOTA: Um pico repentino de pressão enquanto a bomba está funcionando a uma velocidade constante indica formação de bloqueio, enquanto uma diminuição repentina pode indicar um vazamento.
14. Apare qualquer excesso de timo para permitir uma visualização mais fácil da vasculatura pulmonar. Localize o PA, passe uma pinça pequena e curva por baixo e passe novamente uma sutura 3-0 por baixo e pré-amarre em um nó de caixa.
15. Faça uma pequena incisão no ventrículo direito do coração e insira a cânula PA (feita de tubo de plástico de 2 mm de diâmetro alargado na extremidade usando uma chama aberta para permitir que as suturas sejam amarradas), sendo suave para evitar a ruptura da artéria adjacente. Fixe a cânula com sutura e perfusão, a partir de 1,5 mL/^min-1 (Figura 3D).
16. Extirpar imediatamente o ápice do coração para evitar um acúmulo de pressão nos pulmões. Usando uma pinça pequena e curva, rompa a válvula mitral e certifique-se visualmente de que a pinça possa entrar no átrio esquerdo sem restrições.
17. Coloque uma sutura 3-0 pré-amarrada ao redor do coração abaixo do átrio (Figura 3E).
18. Insira a cânula PV (construção semelhante à cânula PA) no átrio esquerdo e certifique-se de que o tampão possa fluir para fora dela antes de amarrar a sutura.
    NOTA: É fundamental que a cânula fotovoltaica seja colocada além da válvula mitral para garantir que possa ser amarrada adequadamente, sem ser colocada muito fundo a ponto de ferir a VP ou sobrecarregar o fluxo (Figura 3E). Tome cuidado extra ao amarrar a sutura, pois amarrá-la muito solta resulta em perda de fluxo, enquanto amarrá-la muito apertada pode danificar o coração, enfraquecendo a colocação da cânula e potencialmente causando vazamentos.
19. Apare o excesso de tecido entre a cavidade torácica e a incisão da traqueostomia usando uma tesoura de ponta romba para evitar danificar a traqueia. Certifique-se de que toda a traqueia abaixo da cânula traqueal e todo o bloqueio coração-pulmão estejam visíveis.
20. Remova o bloqueio coração-pulmão e a traqueia segurando a cânula traqueal e excisando o tecido conjuntivo atrás da traqueia com uma tesoura curva de ponta romba, deixando o esôfago preso para suporte estrutural extra (Figura 3F).
21. Aumente gradualmente a vazão até um fluxo máximo de 40 mL/^kg-1/^min-1. Deixe os primeiros 50 mL de tampão fluírem para fora do sistema para remover quaisquer citocinas inflamatórias que possam ser liberadas ( Figura 3G ).
22. Mova suavemente os pulmões isolados para a câmara de banho-maria criada com os dois béqueres. Certifique-se de que o PA, PV ou cânula traqueal não fique torcido em nenhum ponto ao mover os pulmões ou pendurá-los.
    NOTA: A prevenção da atelectasia durante a recuperação pulmonar e a conexão com a configuração é importante, especialmente quando a PPEV é usada para pulmões já danificados ou quando intervenções antes da PPEV são planejadas. Isso pode ser conseguido, por exemplo, por um pequeno clipe na traqueia após a inspiração antes da transferência para o ventilador¹⁵.

3. Aquisição de dados

1. Para coleta de dados, use qualquer conversor analógico-digital e sistema DAQ disponível comercialmente.
2. Preste atenção para que a frequência de amostragem seja suficiente para a finalidade dada (200 Hz aqui) e que todos os parâmetros dependentes relevantes de bioamplificadores e outros dispositivos de entrada sejam coletados simultaneamente (pressão das vias aéreas, PA e pressão PV escolhida para este protocolo)¹⁶.
3. Registre parâmetros independentes (por exemplo, velocidade de perfusão, taxa de ventilação, composição do gás ventilado, composição do eletrólito tampão e peso pulmonar).

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Resultados

Após 10 min de estabilização e leituras basais, randomizamos um primeiro conjunto de 10 ratos Sprague Dawley machos em cinco pequenos grupos: isquemia global sem fluxo por 5, 7,5, 8, 9 ou 10 min (n = 2 por grupo) seguida de reperfusão; Esses experimentos preliminares limitados de determinação de dose foram conduzidos para identificar o maior tempo de isquemia possível para ainda permitir ventilação e reperfusão suficientes antes do eventual desenvolvimento de um aumento precipitado e irreversível na pressão d...

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Discussão

Mais de 100 experimentos foram realizados com sucesso em nosso laboratório usando essa configuração. O design modular desta configuração personalizada deu grande flexibilidade a possíveis mudanças nos requisitos experimentais. Enquanto outras configurações utilizam um desoxigenador¹⁸ para imitar o consumo constante de oxigênio e a produção de CO₂ pelos órgãos-alvo, esse modelo simplificado não empregou esse recurso, devido ao foco no estudo dos efeitos de diferentes compo...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
1,500 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
Air Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149
Bioamplifiers	CWE Inc	BPM-832
Clamps	Fisher Scientific	S02626
DAQ (Data Acquisition)	National Instruments, Austin, TX	NI USB-6343
Gas Mixer	CWE Inc, Ardmore, PA	GSM-4
Heating Coil	Radnoti, Covina, CA	158822
Heating Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	11-100-49SH
Heparin	Pfizer	W63422
LabVIEW Full Development System 2014	National Instruments
Pentobarbital	Diamondback Drugs	G2270-0235-50
pH700 Probe	OAKTON, Vernon Hills, IL	EW-35419-10
Polystat Water Bath	Cole-Parmer	EW-12121-02
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Model 683
Roller Pump	Cole-Parmer, Wertheim, Germany	Ismatec REGLO Digital MS 2/8
Sprague Dawley Rat	Charles River, Wilmington, MA	Strain code 001
VetScan i-STAT	Abraxis, Chicago, IL	i-STAT 1