Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model의 설계 및 구현

요약

Ex vivo lungs는 in vivo 실험의 교란 변수를 배제하면서 생리학적 데이터를 수집하기 위한 다양한 실험에 유용합니다. 상용 설정은 비용이 많이 들고 수집할 수 있는 데이터 유형이 제한되는 경우가 많습니다. 다양한 연구 설계에 적용할 수 있는 완전 모듈식 설정을 구축하는 방법을 설명합니다.

초록

Ex vivo lung preparations는 다양한 연구 분야로 전환될 수 있는 유용한 모델로, 해당 in vivo 및 in vitro 모델을 보완합니다. 고립된 폐를 사용하고자 하는 실험실은 저렴하고 신뢰할 수 있으며 관심 주제에 맞게 쉽게 조정할 수 있는 설정을 확립하기 위해 중요한 단계와 내재된 문제를 인식해야 합니다. 이 논문은 심박출량의 변화와 무관하게 폐혈관 긴장도에 대한 약물 및 가스 효과를 연구하기 위한 생체 외 쥐 폐 환기 및 관류를 위한 DIY(do it yourself) 모델을 설명합니다. 이 모델을 만드는 것에는 a) 장치의 설계 및 구성, b) 폐 분리 절차가 포함됩니다. 이 모델은 상용 대안보다 비용 효율적이면서도 특정 연구 질문의 변화에 적응할 수 있을 만큼 모듈화된 설정을 제공합니다. 다양한 연구 주제에 사용할 수 있는 일관된 모델을 보장하기 위해 다양한 장애물을 해결해야 했습니다. 일단 확립된 이 모델은 다양한 질문에 매우 적응할 수 있는 것으로 입증되었으며 다양한 연구 분야에 맞게 쉽게 변경할 수 있습니다.

서문

체외 폐 관류(EVLP) 기법¹은 지난 10년 동안 폐 이식^{2, 허}혈/재관류^{3, 폐} 대사4 및 면역 반응⁵을 연구하는 수단으로 사용이 증가하고 있다. 격리되어 있지만 온전한 환기 및 관류된 폐는 신경 및 호르몬 입력 또는 생체 내 혈류역학 변화와 같은 잠재적 교란 요인 없이 잠재적 중재 및/또는 치료법에 대한 폐 혈관 구조를 포함한 폐의 반응을 직접 평가할 수 있는 매우 중요한 기능을 제공합니다. 동시에, 그들은 체외 조건과 대조적으로 환기와 관류의 생리적 상호 작용을 유지합니다. 예를 들어, 폐⁵의 면역 반응을 조사하는 제안은 폐 이식을 위한 기증자 풀 크기⁶를 늘리는 데 초점을 맞춘 연구와 동일한 품질의 데이터를 필요로 합니다. EVLP는 마우스³, 랫트 7,8,9,10,11,12, 돼지 ¹³ 및 인간 2를 포함한 다양한 종에 걸쳐 사용할 수 있습니다. 따라서 다양한 실험 매개변수로부터 신뢰할 수 있는 데이터를 생성할 수 있는 모델을 확립할 필요가 있습니다. 임상적 관련성은 EVLP 모델을 도구로 사용하여 후속 연구에서 생성됩니다.

대부분의 종에 대해 상업용 설정을 구매할 수 있지만 비용이 많이 들고 연구자를 특정 브랜드의 장비 및 독점 소프트웨어로 제한할 수 있습니다. 즉시 사용 가능한 설정에서 벗어나는 경우(예: 한 종에서 다른 종으로 이동) 예측과 제공된 설정을 우회해야 하며, 이는 어렵거나 불가능한 것으로 판명될 수 있습니다. 다음에서는 모듈식이고 비용 효율적인 쥐 격리 폐를 위한 DIY(do it yourself) 설정과 폐를 분리하는 수술 절차에 대해 설명합니다.

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프로토콜

실험의 생체 내 부분(전신 마취에서 안락사까지)은 해당 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 사전 승인이 필요합니다. 본 명세서에 기술된 모든 절차는 테네시주 내슈빌에 있는 밴더빌트 대학 의료 센터의 IACUC에 의해 승인(프로토콜 번호 M1700168)되었으며, ARRIVE 가이드라인¹⁴에 따라 수행되었다. 실험에 앞서, 모든 쥐들은 연구소의 동물 보호 시설에 수용되어 물과 음식을 무료로 이용할 수 있었다. 이 원고의 범위를 벗어난 다른 연구를 포함하여, 우리는 지금까지 250g에서 400g 사이의 체중을 가진 7-10주 된 총 148마리의 수컷 Sprague Dawley 쥐를 사용했습니다.

1. 기구 구성

알림: 해당 제조업체를 포함한 모든 부품은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 각 장비를 제자리에 고정하려면 새 장치를 쉽게 구성하고 통합할 수 있도록 맞춤형 격자를 구성합니다(그림 1). 알루미늄 기둥 (길이 1-2 피트, 직경 1cm, 모든 철물점에서 구매 가능)을 크로스 클램프를 사용하여 서로 부착하여 3D 격자를 만들고 액체 유출을 방지하기 위해 플라스틱 트레이 (30 인치 x 21 인치)에 놓습니다.
2. 압력 변환기를 폐와 동일한 높이에 장착하고 폐동맥(PA), 폐정맥(PV) 및 인공관에 연결합니다.
   참고: 이 트랜스듀서는 데이터 수집 시스템(DAQ) 및 해당 소프트웨어에 연결된 각각의 생체 증폭기로 데이터를 전송합니다.
3. 시중에서 판매되는 캐뉼라를 사용하는 대신 봉합사를 안전하게 묶을 수 있도록 화염을 사용하여 끝에 플레어된 2mm 너비의 단단한 플라스틱 튜브 세그먼트로 맞춤형 캐뉼라(그림 2)를 제작합니다. U자형으로 구부려 매달리는 동안 폐에 가해지는 스트레스를 줄이고 폐실에 맞도록 합니다.
4. 폐를 환기시키고 관류할 챔버를 만들려면 1,500mL 비커 안에 1,000mL 비커를 넣고 둘 사이에 수조를 두고 1,000mL 비커 내부에 이중 보일러를 만듭니다. 이 비커를 48°C로 설정된 가열판에 올려 놓으면 습하고 온도 변화에 강한 폐를 위한 챔버를 만들 수 있습니다.
5. 실험을 위한 버퍼를 37°C로 설정된 가열판에 놓인 150mL 용량 플라스크에 보관합니다. 자기 교반 막대를 사용하여 완충액을 비커 내부로 순환시킵니다. 완충기의 반월상 연골을 폐에서 4cm 위에 있도록 설정하여 PV에 대한 타고난 4cmH₂O의 압력을 생성합니다. 수술 중에는 동물의 폐가 완충액과 같은 높이에 있는지 확인하여 수압 부종 형성을 줄이십시오.
   알림: 플라스크를 사용하면 실내 공기와 접촉하는 표면적이 최소화되어 가스 확산이 최소화됩니다.
6. 롤러 펌프를 사용하여 폐를 관류하기 전에 가열 코일과 에어 트랩으로 구성된 회로를 통해 완충액을 이동시킵니다. PV의 폐수를 부피 플라스크로 다시 재활용합니다. 가열 코일과 에어 트랩을 모두 37°C로 설정된 순환 수조에 연결합니다. 펌프 속도에 따라 수조의 온도를 조정하여 관류수의 온도가 37°C로 일정하게 유지되도록 합니다.

2. 절차

1. 실험을 시작하기 전에 설정을 준비합니다.
   1. 소프트웨어가 실행 중이고(아래 참조) 데이터를 제대로 수집하고 있는지 확인하십시오.
   2. 모든 압력 트랜스듀서를 매일 교정하여 표류하지 않도록 합니다.
   3. 완충액을 준비하고(4% 소 혈청 알부민[BSA]가 함유된 생리식염수 성분은 표 1 참조) HCl을 사용하여 pH가 7.4가 되도록 합니다. 따뜻해진 완충액(표 1)이 전체적으로 순환하는 관류 시스템을 설정하여 기포가 없는지 확인합니다. 실험 시작 최소 30분 전에 BSA를 추가하여 용해될 충분한 시간을 확보합니다. 산소발생기가 없는 경우, 생체 내 폐의 CO₂ 수준을 모방하기 위해 65%_N2, 30%_O2 및 5%_CO2 의 가스 조성을 가진 BSA를 첨가하기 전에 관류 완충액에 기포 가스를 주입합니다. 이렇게 하면 BSA가 첨가되면 용액이 거품이 생기는 것을 방지할 수 있습니다.
   4. 필요한 모든 수술 도구, 봉합사 및 테이프로 수술 부위를 준비합니다. 수술 보드를 15° 각도로 기울여 마취된 쥐가 머리를 몸의 나머지 부분보다 높게 올릴 수 있도록 하고 기관과 심장-폐 블록을 쉽게 조작할 수 있습니다.
   5. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 쥐의 무게를 잰 다음 펜토바르비탈(65mg/^kg-1)을 복강 내 주사합니다. 10분 후 발가락 꼬집을 사용하여 전신 마취의 수술 평면에 도달했는지 확인합니다. 필요한 경우 더 많은 마취제를 투여하십시오.
2. 쥐를 수술 부위로 옮기고 앞다리를 따로 테이프로 감은 다음 뒷다리를 함께 테이프로 붙여서 수술 보드에 고정하고, 마취가 충분히 깊지 않은 경우 통증 반사를 시각화할 수 있도록 앞다리를 테이프로 감쌉니다(그림 3A).
3. 아직 자발적으로 숨을 쉬는 쥐의 혀나 공기 흐름을 제한하지 않고 앞니 뒤에 길고 얇은 스트립으로 입을 테이프로 감아 쥐의 머리를 고정합니다(그림 3B).
4. 집게를 사용하여 기관 위의 피부를 꼬집고 수술용 가위로 절단하여 기관 절개술을 수행합니다. 구부러진 집게를 사용하여 근육과 조직을 뭉툭하게 절개하여 기관에 도달합니다. 이 단계에서 출혈이 없는지 확인하십시오.
   1. 기관 아래에 구부러진 겸자를 통과시키고 열어 아래에 3-0 봉합사를 통과시킬 수 있는 공간을 확보한 다음 상자 매듭에 미리 묶을 수 있습니다(그림 3B). 기관의 연골 고리 사이를 작게 절개하고 기관 캐뉼라(팁 주위에 붙어 노치를 만들기 위해 직경 18mm 튜브가 붙은 수정된 1G 바늘)를 삽입합니다. 봉합사를 묶어 기관 절개 부위에서 공기가 빠져나가지 않고 캐뉼라가 기관에 부담을 주지 않도록 합니다.
5. 30%_O2, 5%_CO2 및 65%_N2의 가스 혼합물, 일회 호흡량(VT) 10mL/kg, 호기말 양압(PEEP) 0cmH_2O, 60호흡/분의 속도로 인공호흡기를 작동하도록 설정합니다.
6. 기관 캐뉼라가 봉합사로 고정되면 위의 설정으로 쥐를 환기시키기 시작합니다.
   참고: 사용된 수술 방법은 Nelson et ^al.9 에서 채택되었으며 단계별로 설명되어 있습니다.
7. 큰 수술용 가위와 집게를 사용하여 쥐의 복부에서 털을 제거합니다.
   참고: 제모 연고는 실험 시작 전에 사용할 수도 있습니다.
8. 집게로 xiphoid 돌기를 잡으면서 갈비뼈 아래를 수평으로 작게 절개하여 다이어프램이 손상되지 않도록 합니다. 내부 장기를 안전하게 시각화할 수 있게 되면 수평 절단부를 넓혀 전체 횡격막이 노출되도록 합니다.
9. 폐에 구멍이 뚫리지 않도록 각별히 주의하여 헤파린(3,000U/^kg-1)을 22G 주사기로 하대정맥(IVC)에 주입합니다.
10. 다시 말하지만, 집게로 시푸스 돌기를 잡고 흉골을 따라 두개골을 자르면서 폐를 지속적으로 시각화하여 절단을 방지합니다.
11. 심장-폐 블록을 제대로 보려면 두 개의 큰 집게를 사용하여 흉곽을 벌리고 날카로운 뼈 조각이 폐를 뚫을 수 있는 갈비뼈가 부러지지 않도록 해야 합니다(그림 3C).
    알림: 흉곽이 열리면 무기폐를 피하기 위해 인공호흡기의 호기단에 부착된 물 잠금 장치로 설정된 2-3cmH₂O의 PEEP를 사용하십시오.
12. 이때 IVC를 잘라 쥐를 출혈로 안락사시킨다. 헤파린을 주입한 후 최소 1분이 지났는지 주의깊게 확인하여(2.9단계 참조) 헤파린이 순환하고 폐의 미세 혈전을 예방할 충분한 시간을 확보합니다.
13. 관류 캐뉼러를 배치할 때 갑작스러운 변화가 발생하지 않도록 압력을 지속적으로 확인하십시오.
    알림: 펌프가 일정한 속도로 작동하는 동안 압력이 갑자기 급증하면 막힘이 형성되었음을 나타내고 급격한 감소는 누출을 나타낼 수 있습니다.
14. 폐 혈관 구조를 더 쉽게 시각화할 수 있도록 과도한 흉선을 잘라냅니다. PA를 찾아 아래에 있는 작고 구부러진 집게를 통과시키고 다시 아래에 3-0 봉합사를 통과시키고 상자 매듭에 미리 묶습니다.
15. 심장의 우심실을 작게 절개하고 PA 캐뉼라(봉합사를 묶을 수 있도록 화염을 사용하여 끝에 플레어된 직경 2mm 플라스틱 튜브로 만든)를 삽입하고 인접한 동맥이 파열되지 않도록 부드럽게 삽입합니다. 1.5mL/^min-1 부터 시작하여 봉합사와 관류를 사용하여 캐뉼라를 고정합니다(그림 3D).
16. 폐에 압력이 쌓이는 것을 방지하기 위해 심장 정점을 즉시 절제하십시오. 작고 구부러진 겸자를 사용하여 승모판막을 파열시키고 겸자가 좌심방으로 제한 없이 들어갈 수 있는지 육안으로 확인합니다.
17. 심방 아래의 심장 주위에 미리 묶인 3-0 봉합사를 놓습니다(그림 3E).
18. PV 캐뉼라(PA 캐뉼라와 유사한 구조)를 좌심방에 삽입하고 봉합사를 묶기 전에 완충액이 흘러나올 수 있는지 확인합니다.
    알림: PV 캐뉼라를 승모판 너머로 배치하여 적절하게 묶을 수 있도록 하는 동시에 PV를 손상시키거나 흐름을 방해할 만큼 너무 깊게 배치하지 않는 것이 중요합니다(그림 3E). 봉합사를 너무 느슨하게 묶으면 흐름이 손실될 수 있으므로 봉합사를 묶을 때 각별한 주의를 기울여야 하며, 너무 꽉 묶으면 심장이 손상되어 캐뉼라의 위치가 약해지고 잠재적으로 누출이 발생할 수 있습니다.
19. 기관이 손상되지 않도록 끝이 뭉툭한 가위를 사용하여 흉강과 기관 절개 사이의 과도한 조직을 잘라냅니다. 기관 캐뉼라 아래의 전체 기관과 전체 심장-폐 블록이 보이는지 확인하십시오.
20. 기관 캐뉼라를 잡고 끝이 뭉툭한 곡선형 가위로 기관 뒤의 결합 조직을 절제하여 심장-폐 블록과 기관을 제거합니다(그림 3F).
21. 최대 유량 40mL/^kg-1/^min-1까지 유속을 점차적으로 증가시킵니다. 처음 50mL의 완충액이 시스템 밖으로 흘러나오도록 하여 방출될 수 있는 염증성 사이토카인을 제거합니다(그림 3G).
22. 격리된 폐를 두 개의 비커로 만든 이중 보일러실로 부드럽게 이동합니다. PA, PV 또는 기관 캐뉼라가 폐를 움직이거나 매달아 놓는 동안 어느 지점에서도 꼬이지 않도록 하십시오.
    알림: 폐 회수 중 무기폐를 예방하고 설정에 연결하는 것이 중요하며, 특히 이미 손상된 폐에 EVLP를 사용하거나 EVLP 이전 개입을 계획하는 경우 중요합니다. 이는, 예를 들어, 인공호흡기⁽¹⁵)로 전달하기 전에 흡기 후 기관 상의 작은 클립에 의해 달성될 수 있다.

3. 데이터 수집

1. 데이터 수집을 위해 시중에서 판매되는 아날로그-디지털 컨버터 및 DAQ 시스템을 사용하십시오.
2. 샘플링 주파수는 주어진 목적에 충분하고(여기서는 200Hz) 생체 증폭기 및 기타 입력 장치의 모든 관련 종속 매개변수가 동시에 수집된다는 점에 유의하십시오(이 프로토콜에 대해 선택된 기도 압력, PA 및 PV 압력)¹⁶.
3. 독립적인 매개변수(예: 관류 속도, 환기율, 환기 가스 조성, 완충 전해질 조성 및 폐 중량)를 기록합니다.

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결과

10 분의 안정화 및 기준선 판독 후, 우리는 10 마리의 수컷 Sprague Dawley 쥐의 첫 번째 세트를 5 개의 작은 그룹으로 무작위 배정했습니다 : 5, 7.5, 8, 9 또는 10 분 (그룹 당 n = 2) 및 재관류; 이러한 제한된 예비 용량 찾기 실험은 기도 압력 및 부종 형성의 가파르고 돌이킬 수 없는 증가가 궁극적으로 발생하기 전에 충분한 환기 및 재관류를 허용할 수 있는 가능한 가장 긴 허혈 시간을 식별하기 위해 수행?...

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토론

이 설정을 사용하여 실험실에서 100개 이상의 실험이 성공적으로 수행되었습니다. 이 맞춤형 설정의 모듈식 설계는 실험 요구 사항의 잠재적 변경에 대한 뛰어난 유연성을 제공했습니다. 다른 설정에서는 말단 장기에 의한 일정한 산소 소비 및_CO2 생성을 모방하기 위해 탈산소화기⁽¹⁸)를 사용하지만, 이 단순화된 모델은 폐 혈관 긴장도에 대한 상이한 가스 조성의 영향을 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
1,500 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
Air Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149
Bioamplifiers	CWE Inc	BPM-832
Clamps	Fisher Scientific	S02626
DAQ (Data Acquisition)	National Instruments, Austin, TX	NI USB-6343
Gas Mixer	CWE Inc, Ardmore, PA	GSM-4
Heating Coil	Radnoti, Covina, CA	158822
Heating Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	11-100-49SH
Heparin	Pfizer	W63422
LabVIEW Full Development System 2014	National Instruments
Pentobarbital	Diamondback Drugs	G2270-0235-50
pH700 Probe	OAKTON, Vernon Hills, IL	EW-35419-10
Polystat Water Bath	Cole-Parmer	EW-12121-02
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Model 683
Roller Pump	Cole-Parmer, Wertheim, Germany	Ismatec REGLO Digital MS 2/8
Sprague Dawley Rat	Charles River, Wilmington, MA	Strain code 001
VetScan i-STAT	Abraxis, Chicago, IL	i-STAT 1