Detección en tiempo real de la producción reactiva de especies de oxígeno en la respuesta inmune en el arroz con un ensayo de quimioluminiscencia

Resumen

Aquí, describimos un método para la detección en tiempo real de la producción de especies reactivas de oxígeno apoplásico (ROS) en tejidos de arroz en la respuesta inmune desencadenada por patrones moleculares asociados a patógenos. Este método es simple, estandarizado y genera resultados altamente reproducibles en condiciones controladas.

Resumen

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel vital en una variedad de procesos biológicos, incluida la detección de estreses abióticos y bióticos. Tras la infección del patógeno o el desafío con productos químicos asociados a patógenos (patrones moleculares asociados a patógenos [PAMP]), se induce rápidamente una serie de respuestas inmunes, incluida una explosión de ROS, en las plantas, lo que se denomina inmunidad activada por PAMP (PTI). Una explosión de ROS es una respuesta PTI distintiva, que es catalizada por un grupo de NADPH oxidasas localizadas en la membrana plasmática, las proteínas de la familia RBOH. La gran mayoría de las ROS comprenden peróxido de hidrógeno (_H2O2), que puede detectarse fácil y constantemente mediante un método de quimioluminiscencia basado en luminol. La quimioluminiscencia es una reacción productora de fotones en la que el luminol, o su derivado (como L-012), sufre una reacción redox con ROS bajo la acción de un catalizador. Este documento describe un método optimizado de quimioluminiscencia basado en L-012 para detectar la producción de ROS de apoplast en tiempo real tras la obtención de PAMP en tejidos de arroz. El método es fácil, estable, estandarizado y altamente reproducible bajo condiciones firmemente controladas.

Introducción

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) comprenden una serie de derivados de oxígeno químicamente activos, incluidos los radicales aniónicos superóxido (_O2-) y sus derivados, radicales hidroxilo ^(OH-), peróxido de hidrógeno y productos de oxígeno singlete o reacciones de ^{oxidación-reducción}, que se producen constantemente en plastidios y cloroplastos, mitocondrias, peroxisomas y otras ubicaciones subcelulares¹ . Las ROS juegan un papel importante en muchos procesos biológicos y son esenciales para todas las plantas ^2,3,4. El amplio espectro de funciones de ROS varía desde la regulación del crecimiento y desarrollo hasta la percepción de estreses abióticos y bióticos 5,6,7,8.

En el sistema inmune de las plantas, los receptores localizados en la membrana plasmática de las células vegetales, los llamados receptores de reconocimiento de patrones (PRR), perciben patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) de productos químicos derivados de patógenos. Este reconocimiento desencadena una serie de respuestas inmunes rápidas, incluyendo la afluencia de calcio, la explosión de ROS y la cascada MAPK; por lo tanto, esta capa de inmunidad se denomina inmunidad activada por PAMP (PTI). La ruptura de ROS es una respuesta de PTI distintiva, cuya determinación se aplica ampliamente a los estudios relacionados con PTI ^9,10. La producción de ROS desencadenada por PAMPs se atribuye a la NADPH oxidasa residente en la membrana plasmática, o proteínas de la familia homóloga de oxidasa de explosión respiratoria (RBOH), que transfieren electrones de NADPH o NADH citosólico a oxígeno extracelular para producir superóxido (O2^-) que se convierte espontáneamente en peróxido de hidrógeno (_H2O2) por la superóxido dismutasa⁸ . La explosión de ROS activada por PAMP es bastante rápida, aparece solo unos minutos después del tratamiento con PAMP y alcanza un máximo de ~ 10-12 min. La gran mayoría de las moléculas de ROS comprenden peróxido de hidrógeno (_H2O2), que se puede detectar de manera fácil y constante con un ensayo de quimioluminiscencia.

En la quimioluminiscencia, el reactivo de quimioluminiscencia reacciona con el oxígeno activo, bajo la acción de un catalizador, para producir los intermedios del estado excitado. Luego, los electrones en el producto regresan al estado fundamental a través de una transición no radiativa y emiten fotones. Los reactivos de quimioluminiscencia comunes incluyen luminol y L-012, con luminol dominando la aplicación^11,12,13. Sin embargo, más investigadores están eligiendo L-012 para detectar la producción de ROS, ya que L-012 tiene una eficiencia de emisión de luz mucho mayor en condiciones de pH neutro o casi neutro en comparación con el luminol.

Este artículo describe un método de quimioluminiscencia optimizado, basado en L-012, para la detección en tiempo real de la producción de ROS después de la obtención de PAMPs en discos y vaina de tejidos de arroz (Oryza sativa). El método proporcionado aquí es simple, estable y estandarizado, y es altamente adaptable para satisfacer diferentes necesidades experimentales. Los datos obtenidos con este método son altamente reproducibles en condiciones firmemente controladas.

Protocolo

NOTA: El protocolo es aplicable a diferentes tejidos vegetales. La vaina de arroz y los discos de hoja se utilizaron en este protocolo para la detección de ROS tras la obtención de PAMP. Dado que las diferencias surgen principalmente debido al método de muestreo, a continuación sólo se describen los procedimientos comunes, y se mencionan medidas específicas cuando sea necesario.

1. Cultivo vegetal

1. Esterilizar las semillas de arroz descascarilladas con etanol al 70% durante 1 min, luego con hipoclorito de sodio al 40% (NaClO) durante 1 h. Luego, enjuague las semillas 5 veces con agua estéril para eliminar el cloro residual.
2. Emplatar las semillas asépticamente en 1/2 MS mediano (2,37 g/L Murashige y Skoog (MS) medio, 30 g/L sacarosa, 2,1 g/L fitagel, pH 5,7, autoclave).
   1. En el método de vaina de arroz, emplate directamente las semillas en el recipiente de vidrio estéril con medio MS.
   2. En el método del disco foliar, emplatar las semillas en placas de EM durante 5-7 días y trasplantarlas a la matriz de crecimiento o al suelo (Figura 1A).
3. Cultivar las plántulas en una sala de crecimiento con un fotoperiodo de 12 h claro/12 h oscuro.

2. Preparación y pretratamiento de tejidos

1. Vaina de arroz
   1. Corte la vaina de las plántulas de arroz de 10 días de edad en segmentos de 3 mm con una cuchilla de afeitar afilada o una cuchilla quirúrgica para el pretratamiento 1 día antes del ensayo ROS (Figura 1B).
   2. Coloque cinco segmentos de vaina en un pocillo individual de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenga 100 μLde ddH2O durante 10-12 h, en la oscuridad a 25 °C, lo que permite que las fugas de iones relacionadas con lesiones de la herida y las respuestas de defensa disminuyan (Figura 2).
      NOTA: Tener cuidado de mantener los cortes verticales para garantizar un área de superficie de corte consistente expuesta a la solución de obtención es un paso importante para obtener resultados altamente reproducibles. Mueva los segmentos suavemente. No haga cortes o heridas adicionales en los segmentos, lo que podría ser una fuente de variación de datos. Como principio, cada prueba debe contener al menos cinco réplicas ya que la variación del valor ROS es grande. Cuantas más réplicas se establezcan, más fiables serán los datos.
2. Disco de hoja
   1. Corte los discos de hojas (4 mm de diámetro) de las plantas de arroz de 4 a 6 semanas de edad con un punzón de biopsia con un émbolo. Siempre corte los discos de hojas del tercio medio de la segunda hoja (numerados desde la parte superior) del timón principal para reducir la variación de datos (Figura 1C).
   2. Colocar un disco foliar en un pocillo individual de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenga 100 μL deddH2O durante 10-12 h para pretratamiento, lo que permite que las respuestas relacionadas con la herida disminuyan ya que podrían interferir con la inducción de ROS por PAMPs (Figura 2).
      NOTA: Accione los discos de hojas suavemente. No haga cortes o heridas adicionales en los discos en el experimento, lo que podría resultar en una variación de los datos. La inducción de ROS ocurre principalmente desde las células del borde cortado, ya que las superficies de los tejidos de arroz (hojas o vainas), están cubiertas con capas hidrófobas. Solo las celdas de los bordes cortados están en contacto con la solución de obtención (consulte la sección de discusión).
   3. Mantenga todos los discos foliares flotando, con la superficie abaxial hacia arriba, en los pocillos de una placa de microtitulación para el pretratamiento del agua para evitar la variación asociada al lado de la hoja.

Figura 1: La condición de crecimiento y las etapas de las plántulas de arroz para el muestreo de vaina y partes de la vaina de arroz y las hojas de arroz utilizadas en el ensayo. (A) Las plántulas de arroz cultivadas en medio 1/2 MS en condiciones estériles durante 10 días pueden ser muestreadas para el ensayo ROS. Las semillas de arroz esterilizadas se cultivaron en medio de 1/2 MS y se cultivaron en un fotoperíodo de 12 h claro/12 h oscuro en vial de vidrio transparente, de 8,5 cm de diámetro y 15 cm de altura. (B) Diagrama esquemático de las partes de muestreo de las vainas foliares. Las vainas de las hojas se cortaron de plántulas de arroz de 10 días de edad. Las posiciones de las vainas de las hojas estaban por encima de las raíces y por debajo de la primera hoja. (C) Diagrama esquemático de la posición de muestreo de los discos foliares. Los discos de hojas se pueden cortar desde el tercio medio de la segunda hoja (contar desde la parte superior) del labrador principal de plantas de arroz sanas en cualquier etapa de crecimiento. Abreviaturas: ROS = especies reactivas de oxígeno; MS = Murashige y Skoog. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diagrama esquemático de la configuración de la placa para medir la producción de ROS con diferentes líneas de Oryza sativa. Pretratamiento y prueba de tejidos de arroz utilizando una placa de 96 pocillos. La línea 1, la línea 2 y la línea 3 (hasta ocho líneas en una placa) pueden ser cualquier material de interés, diferentes cultivares, mutantes o líneas transgénicas. Los tejidos fueron estimulados con soluciones de obtención con PAMP (PAMP, blanco) o sin PAMP (ddH₂O, gris) para medir la respuesta ROS. Cabe señalar que cuantas más muestras se analicen, mayor será el intervalo de tiempo entre lecturas. Abreviaturas: ROS = especies reactivas de oxígeno; PAMP = patrón molecular asociado al patógeno; ddH₂O = agua doblemente destilada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación de la solución de obtención

1. Disuelva el polvo de L-012 en una solución acuosa de 20 mM (6,23 mg/ml) con_ddH2Opara obtener la solución madre. A continuación, diluir la solución madre con tampón Tris HCl de 50 mM (pH 7,5) para obtener la solución de trabajo a la concentración final de 500 μM L-012. Mantenga la solución madre congelada y diluir hasta obtener la solución de trabajo antes de usarla.
2. Prepare la solución de obtención que contiene PAMP, L-012 y peroxidasa de rábano picante (HRP; 10 mg/ml en_ddH2O). Para una solución de obtención de 10 ml, mezclar 9,4 ml de solución de Tris HCl (pH 7,5) de 50 mM, 400 μL de la solución L-012, 100 μL de HRP y 100 μL de flg22 (PAMP; 10 mM en ddH₂O). Para el control negativo, añadir 100 μL de_ddH2Oen lugar de PAMP.
   NOTA: Mantenga las soluciones de obtención preparadas a temperatura ambiente para evitar el estrés por frío en los tejidos del arroz. También se pueden usar otros PAMP para el tratamiento según sea necesario, como la quitina (20 ng / ml en concentración final). Dado que L-012 es sensible a la luz, cubra todos los tubos que contienen la solución de L-012 con papel de aluminio.

4. Inicio del software y configuración del protocolo con el lector de microplacas al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales)

NOTA: Se necesita algún tiempo para configurar los parámetros del software lector de microplacas. Se recomienda preparar la máquina y el protocolo (un clic para continuar) antes de agregar la solución de obtención.

1. Inicie el software. Haga clic en el botón Experimentos para crear un nuevo protocolo o utilizar un protocolo existente.
2. Haga clic en Procedimiento en la ventana emergente para configurar la placa. Seleccione los pocillos de la placa a monitorear.
3. Haga clic en Iniciar cinética para configurar el tiempo total de ejecución y el intervalo de lectura. Establezca el tiempo de ejecución en 35 minutos o más, dependiendo de los requisitos experimentales. Para obtener lecturas con la mayor frecuencia posible, seleccione Intervalo mínimo. Para el tiempo de integración, elija 1 s o más, dependiendo de la intensidad de la señal.
   NOTA: El intervalo de lectura depende del número de muestras y de la duración de la integración de la señal.
4. Haga clic en Validar | Aceptar para confirmar la configuración.
5. Haga clic en Detectar la nueva placa en la ventana emergente y espere a que el software muestre el cuadro de diálogo de la placa de carga. Coloque la placa a probar en el portador.
6. Deténgase aquí para esperar a que se establezca el sistema de obtención (en la siguiente sección). Tan pronto como el sistema de obtención esté listo, haga clic en Ejecutar para comenzar la lectura.

5. Establecer el sistema de obtención y medir la producción de ROS en tiempo real

1. Retire con cuidado el_ddH2Ode los pocillos que contienen los tejidos pretratados, evitando cualquier daño tisular o desecación.
2. Utilice una pipeta multicanal para añadir 200 μL de la solución de obtención a los pocillos que contienen los tejidos.
3. Agitar suavemente para mezclar. Haga clic en Ejecutar para comenzar la detección.
   NOTA: Con el tratamiento PAMP, los tejidos vegetales responden y producen ROS muy rápidamente. Por lo tanto, se sugiere que el control negativo sin PAMP se trate primero para reducir el tiempo de operación, cuando hay múltiples tratamientos. Opere lo más rápido posible para reducir el retraso de obtención entre tratamientos. Cuanto más corto sea el tiempo entre la adición de la solución de obtención y el inicio de la detección, mejor será la captura de datos experimentales importantes.

Resultados

Aquí, tomamos el material de arroz como ejemplo para determinar las ROS producidas con el tratamiento flg22. La generación de ROS después de la obtención es transitoria. En el arroz, el aumento en la producción de ROS se detectó por primera vez en 1-2 min, alcanzó un máximo de 10-12 min y regresó a la línea de base en ~ 30-35 min (Figura 3). En comparación con la prueba de control, en la que PAMP estaba ausente en la solución de obtención que no resultaba en una inducción de RO...

Discusión

El propósito de este estudio fue establecer un método altamente eficiente para cuantificar la producción temprana de ROS en respuesta a PAMP en tejidos de arroz. Este método proporciona un procedimiento estandarizado para la determinación en tiempo real de ROS de apoplast producidas a partir de tejidos de arroz tratados. Este método es simple en operación, bajo en costo, claro en composición e independiente de los kits comerciales. Usando este método, los investigadores pueden estudiar la producción en tiempo r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well microtiter plate	WHB	WHB-96-01
Ethanol absolute	Innochem	A43543
flg22	Sangon Biotech	p20973	PAMP
Gen5	BioTek		software
L-012	FUJIFILM	120-04891	8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5
Microplate reader	BioTek	Synergy 2
MS Medium	Solarbio	M8521
NaCLO	Aladdin	S101636
Peroxidase from horseradish (HRP)	Sigma	P8375
Phytagel	Sigma	P8169
Sampler	Miltex	15110-40
Sucrose	Sangon Biotech	A502792
Tris	Sangon Biotech	A610195