Kemilüminesans Testi ile Pirinçte İmmün Yanıtta Reaktif Oksijen Türleri Üretiminin Gerçek Zamanlı Tespiti

Özet

Burada, patojenle ilişkili moleküler paternle tetiklenen immün yanıtta pirinç dokularında apoplastik reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin gerçek zamanlı tespiti için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem basit, standartlaştırılmış ve kontrollü koşullar altında yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar üretir.

Özet

Reaktif oksijen türleri (ROS), abiyotik ve biyotik streslerin algılanması da dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerde hayati roller oynamaktadır. Patojen enfeksiyonu veya patojenle ilişkili kimyasallarla (patojenle ilişkili moleküler desenler [PAMP'ler]) meydan okuması üzerine, bir ROS patlaması da dahil olmak üzere bir dizi bağışıklık tepkisi, PAMP ile tetiklenen bağışıklık (PTI) olarak adlandırılan bitkilerde hızla indüklenir. Bir ROS patlaması, bir grup plazma zarı lokalize NADPH oksidaz-RBOH ailesi proteinleri tarafından katalize edilen ayırt edici bir PTI yanıtıdır. ROS'un büyük çoğunluğu, luminol bazlı bir kemilüminesans yöntemiyle kolayca ve istikrarlı bir şekilde tespit edilebilen hidrojen peroksit (_H2O2) içerir. Kemilüminesans, luminolün veya türevinin (L-012 gibi), bir katalizörün etkisi altında ROS ile bir redoks reaksiyonuna maruz kaldığı foton üreten bir reaksiyondur. Bu makalede, pirinç dokularında PAMP inisitümü üzerine apoplast ROS üretimini gerçek zamanlı olarak tespit etmek için optimize edilmiş bir L-012 tabanlı kemilüminesans yöntemi açıklanmaktadır. Yöntem kolay, istikrarlı, standartlaştırılmış ve sıkı bir şekilde kontrol edilen koşullar altında yüksek oranda tekrarlanabilir.

Giriş

Reaktif oksijen türleri (ROS), süperoksit anyon radikalleri (_O2-) ve türevleri, hidroksil radikalleri (OH-), hidrojen peroksit ve plastitlerde ve kloroplastlarda, mitokondrilerde, peroksizomlarda ve diğer hücre altı konumlarda sürekli olarak üretilen singlet oksijen veya oksidasyon-indirgeme reaksiyonlarının ürünleri dahil olmak üzere bir dizi kimyasal olarak aktif oksijen türevini içerir¹ . ROS birçok biyolojik süreçte önemli rol oynar ve tüm bitkiler için gereklidir ^2,3,4. ROS fonksiyonlarının geniş spektrumu, büyüme ve gelişmenin düzenlenmesinden abiyotik ve biyotik streslerin algılanmasına kadar değişir 5,6,7,8.

Bitki bağışıklık sisteminde, bitki hücresi plazma zarı-lokalize reseptörler-sözde örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) - patojen kaynaklı kimyasalları-patojenle ilişkili moleküler paternleri (PAMP'ler) algılar. Bu tanıma, kalsiyum akışı, ROS patlaması ve MAPK kaskadı dahil olmak üzere bir dizi hızlı bağışıklık tepkisini tetikler; Bu nedenle, bu bağışıklık katmanı PAMP ile tetiklenen bağışıklık (PTI) olarak adlandırılır. ROS patlaması, PTI ile^{ilgili çalışmalara} yaygın olarak uygulanan ^9,10 numaralı ayırt edici bir PTI yanıtıdır. PAMP'ler tarafından tetiklenen ROS üretimi, süperoksit dismutaz 8 tarafından kendiliğinden hidrojen peroksite (H2 O2) dönüştürülen süperoksit (_O2^-) üretmek için elektronları sitozolik NADPH veya NADH'den hücre dışı oksijene aktaran plazma zarında yerleşik NADPH oksidaz veya solunum patlaması oksidaz homolog(RBOH) ailesi proteinlerine atfedilir . PAMP tarafından tetiklenen ROS patlaması oldukça hızlıdır, PAMP tedavisinden sadece birkaç dakika sonra ortaya çıkar ve ~ 10-12 dakikada zirveye ulaşır. ROS moleküllerinin büyük çoğunluğu, bir kemilüminesans testi ile kolayca ve istikrarlı bir şekilde tespit edilebilen hidrojen peroksit (_H2O2) içerir.

Kemilüminesansta, kemilüminesans reaktifi, uyarılmış durum ara ürünlerini üretmek için bir katalizörün etkisi altında aktif oksijenle reaksiyona girer. Daha sonra, üründeki elektronlar ışınımsal olmayan geçiş yoluyla zemin durumuna geri döner ve fotonlar yayar. Yaygın kemilüminesans reaktifleri luminol ve L-012'yi içerir ve luminol uygulamaya ^11,12,13 hakimdir. Bununla birlikte, daha fazla araştırmacı ROS üretimini tespit etmek için L-012'yi seçmektedir, çünkü L-012, luminol'e kıyasla nötr veya nötr pH koşullarına yakın koşullar altında çok daha yüksek bir ışık emisyon verimliliğine sahiptir.

Bu yazıda, pirinç (Oryza sativa) doku-yaprak diskleri ve kılıfında PAMP'lerin ortaya çıkarılmasından sonra ROS üretiminin gerçek zamanlı tespiti için L-012'ye dayanan optimize edilmiş bir kemilüminesans yöntemi açıklanmaktadır. Burada sağlanan yöntem basit, kararlı ve standartlaştırılmıştır ve farklı deneysel ihtiyaçları karşılamak için oldukça uyarlanabilir. Bu yöntemle elde edilen veriler, sıkı bir şekilde kontrol edilen koşullar altında yüksek oranda tekrarlanabilir.

Protokol

NOT: Protokol farklı bitki dokularına uygulanabilir. Bu protokolde PAMP inisitümü üzerine ROS tespiti için pirinç kılıfı ve yaprak diskleri kullanılmıştır. Farklılıklar esas olarak örnekleme yönteminden kaynaklandığından, aşağıda yalnızca ortak prosedürler açıklanmış ve gerektiğinde belirli adımlardan bahsedilmiştir.

1. Bitki kültürü

1. Kabuğu çıkarılmış pirinç tohumlarını 1 dakika boyunca% 70 etanol, daha sonra 1 saat boyunca% 40 sodyum hipoklorit (NaClO) ile sterilize edin. Ardından, kalan kloru gidermek için tohumları 5 kat steril suyla durulayın.
2. Tohumları aseptik olarak 1/2 MS ortamında (2.37 g / L Murashige ve Skoog (MS) ortamı, 30 g / L sakaroz, 2.1 g / L fitajel, pH 5.7, otoklavlanmış) kaplayın.
   1. Pirinç kılıfı yönteminde, tohumları doğrudan steril cam kapta MS ortamı ile kaplayın.
   2. Yaprak disk yönteminde, tohumları MS plakalarında 5-7 gün bekletin ve büyüme matrisine veya toprağa nakledin (Şekil 1A).
3. Fideleri 12 saat ışık / 12 saat karanlık fotoperiyot ile bir büyüme odasında büyütün.

2. Doku hazırlama ve ön tedavi

1. Pirinç kılıfı
   1. 10 günlük pirinç fidelerinin kılıfını, ROS tahlilinden 1 gün önce ön işlem için keskin bir tıraş bıçağı veya cerrahi bıçakla 3 mm'lik parçalara ayırın (Şekil 1B).
   2. Beş kılıf segmentini, 10-12 saat boyunca 100 μL ddH 2 O içeren 96 delikli bir mikrotitre plakasınınbireysel bir kuyucuğuna, karanlıkta 25 ° C'de yerleştirin, bu da yara yaralanmasına bağlı iyon sızıntısının ve savunma tepkilerinin azalmasına izin verir (Şekil 2).
      NOT: Elimitasyon çözeltisine maruz kalan tutarlı bir kesme yüzeyi alanı sağlamak için kesimlerin dikey tutulmasına özen gösterilmesi, yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için önemli bir adımdır. Segmentleri yavaşça hareket ettirin. Segmentlerde, veri varyasyonu kaynağı olabilecek fazladan kesikler veya yaralar yapmayın. Prensip olarak, ROS değerinin değişimi büyük olduğu için her test en az beş çoğaltma içermelidir. Ne kadar çok çoğaltma kümesi olursa, veriler o kadar güvenilir olur.
2. Yaprak disk
   1. 4-6 haftalık pirinç bitkilerinden yaprak disklerini (4 mm çapında) bir pistonla biyopsi zımba kullanarak kesin. Veri varyasyonunu azaltmak için yaprak disklerini her zaman ana yeke makinesinin ikinci yaprağının orta üçte birinden (üstten numaralandırılmış) kesin (Şekil 1C).
   2. Bir yaprak diskini, ön işlem için 10-12 saat boyunca 100 μL ddH 2 O içeren 96 deliklibir mikrotitre plakasının bireysel bir kuyucuğuna yerleştirin, bu da PAMP'ler tarafından ROS'un indüksiyonuna müdahale edebileceğinden yaralanma ile ilgili tepkilerin azalmasına izin verir (Şekil 2).
      NOT: Yaprak diskleri yavaşça çalıştırın. Deneydeki disklerde veri varyasyonuna neden olabilecek fazladan kesikler veya yaralar açmayın. ROS'un indüksiyonu çoğunlukla kesilmiş kenarın hücrelerinden meydana gelir, çünkü pirinç dokularının yüzeyleri (yapraklar veya kılıflar) hidrofobik tabakalarla kaplıdır. Sadece kesilmiş kenarların hücreleri uyarılma çözeltisi ile temas halindedir (tartışma bölümüne bakınız).
   3. Tüm yaprak disklerini, abaksiyel yüzey yukarı bakacak şekilde, yaprak tarafı ile ilişkili varyasyonları önlemek için su ön arıtımı için bir mikrotitre plakasının kuyularında yüzer halde tutun.

Şekil 1: Kılıf örneklemesi için pirinç fidelerinin büyüme durumu ve aşamaları ve tahlilde kullanılan pirinç kılıfı ve pirinç yapraklarının parçaları. (A) 10 gün boyunca steril koşullarda 1/2 MS ortamında yetiştirilen pirinç fideleri ROS testi için örneklenebilir. Sterilize edilmiş pirinç tohumları 1/2 MS ortamında kültürlendi ve 8,5 cm çapında ve 15 cm yüksekliğinde şeffaf cam şişede 12 saat ışık/12 saat karanlık fotoperiyotta yetiştirildi. (B) Yaprak kılıflarının örnekleme kısımlarının şematik diyagramı. Yaprak kılıfları 10 günlük pirinç fidelerinden kesildi. Yaprak kılıflarının pozisyonları köklerin üstünde ve ilk yaprağın altındaydı. (C) Yaprak disklerin örnekleme konumunun şematik diyagramı. Yaprak diskleri, herhangi bir büyüme aşamasında sağlıklı pirinç bitkilerinin ana yeke makinesinin ikinci yaprağının orta üçte birinden (üstten sayım) kesilebilir. Kısaltmalar: ROS = reaktif oksijen türleri; MS = Murashige ve Skoog. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: Farklı Oryza sativa hatları ile ROS üretimini ölçmek için plaka kurulumunun şematik diyagramı. 96 delikli bir plaka kullanarak pirinç dokularının ön işlemi ve testi. Satır 1, Satır 2 ve Satır 3 (bir plakada sekiz satıra kadar) ilgilenilen herhangi bir malzeme, farklı çeşitler, mutantlar veya transgenik çizgiler olabilir. ROS yanıtını ölçmek için dokular PAMP (PAMP, beyaz) veya PAMP olmadan (ddH₂O, gri) uyarılma solüsyonları ile uyarıldı. Test edilecek numuneler ne kadar fazla olursa, okumalar arasındaki zaman aralığının o kadar uzun olduğu belirtilmelidir. Kısaltmalar: ROS = reaktif oksijen türleri; PAMP = patojenle ilişkili moleküler patern; ddH₂O = çift damıtılmış su. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Uyarma çözeltisinin hazırlanması

1. L-012 tozunu stok çözeltisini yapmak için ddH₂O ile 20 mM (6.23 mg / mL) sulu çözelti halinde çözün. Daha sonra, çalışma çözeltisini 500 μM L-012'nin son konsantrasyonunda yapmak için stok çözeltisini 50 mM Tris HCl tamponu (pH 7.5) ile seyreltin. Stok çözeltisini donmuş halde tutun ve kullanmadan önce çalışma çözeltisine seyreltin.
2. PAMP, L-012 ve yaban turpu peroksidaz (HRP; ddH₂O'da 10 mg / mL) içeren elimitasyon çözeltisini hazırlayın. 10 mL'lik bir uyarılma çözeltisi için, 9,4 mL'lik 50 mM Tris HCl (pH 7,5) çözeltisini, 400 μL'lik L-012 çözeltisini, 100 μL'lik HRP'yi ve 100 μL'lik flg22'yi (PAMP;_ddH2O'da 10 mM) karıştırın. Negatif kontrol için, PAMP yerine 100 μL ddH₂O ekleyin.
   NOT: Pirinç dokularında soğuk stresi önlemek için hazırlanan uyarma çözeltilerini oda sıcaklığında tutun. Diğer PAMP'ler de kitin (nihai konsantrasyonda 20 ng / mL) gibi gerektiğinde tedavi için kullanılabilir. L-012 ışığa duyarlı olduğundan, L-012 çözeltisi içeren tüm tüpleri alüminyum folyo ile örtün.

4. Yazılımı başlatmak ve protokolü referans verilen mikroplaka okuyucu ile kurmak (bkz.

NOT: Mikroplaka okuyucu yazılımının parametrelerinin ayarlanması biraz zaman alır. Uyandırma çözeltisini eklemeden önce makineyi ve protokolü hazırlamanız önerilir (devam etmek için tek bir tıklama).

1. Yazılımı başlatın. Yeni bir protokol oluşturmak veya mevcut bir protokolü kullanmak için Denemeler düğmesini tıklayın.
2. Plakayı ayarlamak için açılır pencerede Prosedür'ü tıklayın. İzlenecek plakadan kuyucukları seçin.
3. Toplam çalışma süresini ve okuma aralığını ayarlamak için Kinetic'i Başlat'ı tıklatın. Deneme süresini, deneysel gereksinimlere bağlı olarak 35 dakika veya daha uzun bir süreye ayarlayın. Okumaları mümkün olduğunca sık elde etmek için Minimum Aralık'ı seçin. Entegrasyon süresi için, sinyal yoğunluğuna bağlı olarak 1 s veya daha uzun bir süre seçin.
   NOT: Okuma aralığı, numune sayısına ve sinyal entegrasyon süresine bağlıdır.
4. Doğrula'ya tıklayın | Tamam ayarları onaylamak için.
5. Açılır pencerede Yeni plakayı algıla'ya tıklayın ve yazılımın yükleme plakası iletişim kutusunu sormasını bekleyin. Test edilecek plakayı taşıyıcıya yerleştirin.
6. Uyandırma sisteminin kurulmasını beklemek için burada durun (bir sonraki bölümde). Uyandırma sistemi hazır olur olmaz, okumaya başlamak için Çalıştır'a tıklayın.

5. Uyandırma sisteminin kurulması ve gerçek zamanlı ROS üretiminin ölçülmesi

1. ddH₂O'yu önceden işlenmiş dokuları içeren kuyucuklardan dikkatlice çıkarın, herhangi bir doku hasarı veya kurumasını önleyin.
2. Dokuları içeren kuyucuklara 200 μL uyarma çözeltisi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.
3. Karıştırmak için hafifçe sallayın. Algılamayı başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın.
   NOT: PAMP tedavisi ile bitki dokuları çok hızlı bir şekilde yanıt verir ve ROS üretir. Bu nedenle, birden fazla tedavinin olduğu durumlarda, ameliyat süresini azaltmak için öncelikle PAMP'sız negatif kontrolün tedavi edilmesi önerilmektedir. Tedaviler arasındaki uyarılma gecikmesini azaltmak için mümkün olduğunca çabuk çalışın. Uyarma çözeltisinin eklenmesi ile tespitin başlaması arasındaki süre ne kadar kısa olursa, önemli deneysel verilerin yakalanması o kadar iyi olur.

Sonuçlar

Burada, flg22 işlemi ile üretilen ROS'u belirlemek için pirinç malzemesini örnek olarak alıyoruz. Uyarılmadan sonra ROS oluşumu geçicidir. Pirinçte, ROS üretimindeki artış ilk olarak 1-2 dakika içinde tespit edilmiş, 10-12 dakikada zirveye ulaşmış ve ~ 30-35 dakika içinde taban çizgisine geri dönmüştür (Şekil 3). PAMP'ın elicitation çözeltisinde bulunmadığı ve belirgin bir ROS indüksiyonu ile sonuçlanmadığı kontrol testi ile karşılaştırıldığında, s...

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, pirinç dokularında PAMP'a yanıt olarak erken ROS üretimini ölçmek için oldukça etkili bir yöntem oluşturmaktır. Bu yöntem, işlenmiş pirinç dokularından üretilen apoplast ROS'un gerçek zamanlı olarak belirlenmesi için standartlaştırılmış bir prosedür sağlar. Bu yöntem kullanımda basit, düşük maliyetli, bileşimde berrak ve ticari kitlerden bağımsızdır. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar bitkiler biyotik veya abiyotik streslere maruz kaldıklarında apopl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well microtiter plate	WHB	WHB-96-01
Ethanol absolute	Innochem	A43543
flg22	Sangon Biotech	p20973	PAMP
Gen5	BioTek		software
L-012	FUJIFILM	120-04891	8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5
Microplate reader	BioTek	Synergy 2
MS Medium	Solarbio	M8521
NaCLO	Aladdin	S101636
Peroxidase from horseradish (HRP)	Sigma	P8375
Phytagel	Sigma	P8169
Sampler	Miltex	15110-40
Sucrose	Sangon Biotech	A502792
Tris	Sangon Biotech	A610195