Détection en temps réel de la production d’espèces réactives de l’oxygène dans la réponse immunitaire dans le riz avec un test de chimiluminescence

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode pour la détection en temps réel de la production d’espèces réactives apoplastiques de l’oxygène (ROS) dans les tissus de riz dans la réponse immunitaire déclenchée par un modèle moléculaire associé à des agents pathogènes. Cette méthode est simple, standardisée et génère des résultats hautement reproductibles dans des conditions contrôlées.

Résumé

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle essentiel dans une variété de processus biologiques, y compris la détection des stress abiotiques et biotiques. En cas d’infection pathogène ou de provocation par des produits chimiques associés à des agents pathogènes (profils moléculaires associés aux agents pathogènes [PAMPs]), un éventail de réponses immunitaires, y compris une explosion de ROS, est rapidement induit chez les plantes, ce qui est appelé immunité déclenchée par PAMP (PTI). Un sursaut ROS est une réponse PTI caractéristique, qui est catalysée par un groupe de NADPH oxydases localisées dans la membrane plasmique - les protéines de la famille RBOH. La grande majorité des ROS comprennent du peroxyde d’hydrogène (_H2O2), qui peut être facilement et régulièrement détecté par une méthode de chimiluminescence à base de luminol. La chimiluminescence est une réaction produisant des photons dans laquelle le luminol, ou son dérivé (tel que L-012), subit une réaction redox avec ROS sous l’action d’un catalyseur. Cet article décrit une méthode de chimiluminescence optimisée basée sur L-012 pour détecter la production d’apoplast ROS en temps réel lors de l’obtention de PAMP dans les tissus de riz. La méthode est facile, stable, standardisée et hautement reproductible dans des conditions fermement contrôlées.

Introduction

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) comprennent une série de dérivés de l’oxygène chimiquement actifs, y compris les radicaux anioniques superoxydes (_O2-) et ses dérivés, les radicaux hydroxyles (OH^-), le peroxyde d’hydrogène et les produits de l’oxygène singulet ou des réactions d’oxydoréduction qui sont constamment produits dans les plastes et les chloroplastes, les mitochondries, les peroxysomes et d’autres emplacements subcellulaires¹ . Les ROS jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques et sont essentiels pour toutes les plantes ^2,3,4. Le large spectre des fonctions ROS varie de la régulation de la croissance et du développement à la perception des stress abiotiques et biotiques 5,6,7,8.

Dans le système immunitaire des plantes, les récepteurs localisés de la membrane plasmique des cellules végétales - appelés récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) - perçoivent les profils moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMPs) dérivés de produits chimiques dérivés d’agents pathogènes. Cette reconnaissance déclenche une série de réponses immunitaires rapides, y compris l’afflux de calcium, l’éclatement des ROS et la cascade MAPK; ainsi, cette couche d’immunité est appelée immunité déclenchée par la PAMP (PTI). Le sursaut ROS est une réponse PTI caractéristique, dont la détermination est largement appliquée aux études liées à la PTI ^9,10. La production de ROS déclenchée par les PAMP est attribuée à la NADPH oxydase résidant dans la membrane plasmique, ou aux protéines homologues de la famille des oxydases respiratoires éclatées (RBOH), qui transfèrent des électrons du NADPH cytosolique ou du NADH à l’oxygène extracellulaire pour produire du superoxyde (O2^-) qui est spontanément converti en peroxyde d’hydrogène (_H2O2) par la superoxyde dismutase⁸ . Le rafale ROS déclenchée par PAMP est assez rapide, apparaissant seulement quelques minutes après le traitement PAMP et culminant à ~10-12 min. La grande majorité des molécules ROS comprennent du peroxyde d’hydrogène (_H2O2), qui peut être facilement et régulièrement détecté par un test de chimiluminescence.

En chimiluminescence, le réactif de chimiluminescence réagit avec l’oxygène actif, sous l’action d’un catalyseur, pour produire les intermédiaires à l’état excité. Ensuite, les électrons du produit reviennent à l’état fondamental par transition non radiative et émettent des photons. Les réactifs de chimiluminescence courants comprennent le luminol et le L-012, le luminol dominant l’application^11,12,13. Cependant, de plus en plus de chercheurs choisissent L-012 pour détecter la production de ROS, car le L-012 a une efficacité d’émission de lumière beaucoup plus élevée dans des conditions de pH neutre ou quasi neutre par rapport au luminol.

Cet article décrit une méthode de chimiluminescence optimisée, basée sur L-012, pour la détection en temps réel de la production de ROS après l’obtention de PAMP dans les tissus et la gaine des tissus du riz (Oryza sativa). La méthode fournie ici est simple, stable et standardisée, et est hautement adaptable pour répondre à différents besoins expérimentaux. Les données obtenues avec cette méthode sont hautement reproductibles dans des conditions fermement contrôlées.

Protocole

NOTE: Le protocole est applicable à différents tissus végétaux. La gaine de riz et les disques foliaires ont été utilisés dans ce protocole pour la détection des ROS lors de l’obtention du PAMP. Étant donné que les différences résultent principalement de la méthode d’échantillonnage, seules les procédures communes sont décrites ci-dessous, des étapes spécifiques étant mentionnées chaque fois que nécessaire.

1. Culture végétale

1. Stériliser les graines de riz décortiquées avec de l’éthanol à 70% pendant 1 min, puis avec de l’hypochlorite de sodium (NaClO) à 40% pendant 1 h. Ensuite, rincez les graines 5x avec de l’eau stérile pour éliminer le chlore résiduel.
2. Plaquer les graines de façon aseptique sur milieu 1/2 MS (2,37 g/L milieu Murashige et Skoog (MS), 30 g/L de saccharose, 2,1 g/L de phytagel, pH 5,7, autoclavé).
   1. Dans la méthode de la gaine de riz, plaquez directement les graines dans le récipient en verre stérile avec le milieu MS.
   2. Dans la méthode du disque foliaire, plaquer les graines sur des plaques de SEP pendant 5 à 7 jours et les transplanter dans la matrice de croissance ou le sol (figure 1A).
3. Cultivez les plants dans une salle de croissance avec une photopériode de lumière de 12 h / 12 h de photopériode.

2. Préparation et prétraitement des tissus

1. Gaine de riz
   1. Couper la gaine des plants de riz âgés de 10 jours en segments de 3 mm à l’aide d’une lame de rasoir tranchante ou d’une lame chirurgicale pour le prétraitement 1 jour avant le test ROS (Figure 1B).
   2. Placer cinq segments de gaine dans un puits individuel d’une plaque de microtitrage de 96 puits contenant 100 μL de ddH2O pendant 10-12 h, dans l’obscurité à 25 °C, ce qui permet aux fuites d’ions liées aux blessures et aux réponses de défense de s’atténuer (Figure 2).
      REMARQUE: Prendre soin de garder les coupes verticales pour assurer une surface de coupe constante exposée à la solution de déclenchement est une étape importante pour obtenir des résultats hautement reproductibles. Déplacez les segments doucement. Ne faites pas de coupures ou de plaies supplémentaires sur les segments, ce qui pourrait être une source de variation des données. En principe, chaque essai doit contenir au moins cinq répétitions car la variation de la valeur ROS est importante. Plus il y a de réplications, plus les données sont fiables.
2. Disque de feuille
   1. Couper les disques foliaires (4 mm de diamètre) des plants de riz âgés de 4 à 6 semaines à l’aide d’un poinçon de biopsie avec un piston. Coupez toujours les disques foliaires du tiers médian de la deuxième feuille (numérotés à partir du haut) du motoculteur principal pour réduire la variation des données (figure 1C).
   2. Placer un disque foliaire dans un puits individuel d’une plaque de microtitrage de 96 puits contenant 100 μL de ddH2O pendant 10 à₁₂heures pour le prétraitement, ce qui permet de réduire les réactions liées aux blessures car celles-ci pourraient interférer avec l’induction de ROS par les PAMP (Figure 2).
      REMARQUE: Utilisez les disques de feuilles doucement. Ne faites pas de coupures ou de plaies supplémentaires sur les disques dans l’expérience, ce qui pourrait entraîner une variation des données. L’induction de ROS se produit principalement à partir des cellules du bord coupé, car les surfaces des tissus de riz (feuilles ou gaines) sont recouvertes de couches hydrophobes. Seules les cellules des bords coupés sont en contact avec la solution d’élicitation (voir la section discussion).
   3. Gardez tous les disques foliaires flottants, avec la surface abaxiale tournée vers le haut, dans les puits d’une plaque de microtitrage pour le prétraitement de l’eau afin d’éviter toute variation associée au côté des feuilles.

Figure 1 : État de croissance et stades des plants de riz pour l’échantillonnage de la gaine et des parties de la gaine de riz et des feuilles de riz utilisées dans l’essai. (A) Les plants de riz cultivés sur 1/2 milieu MS dans des conditions stériles pendant 10 jours peuvent être échantillonnés pour le dosage ROS. Les graines de riz stérilisées ont été cultivées sur milieu 1/2 MS et cultivées en photopériode de 12 h de lumière / 12 h de foncé dans un flacon en verre transparent, de 8,5 cm de diamètre et 15 cm de hauteur. (B) Schéma de principe des parties de prélèvement des gaines foliaires. Les gaines foliaires ont été coupées à partir de plants de riz âgés de 10 jours. Les positions des gaines foliaires étaient au-dessus des racines et au-dessous de la première feuille. C) Schéma de principe de la position d’échantillonnage des disques foliaires. Les disques foliaires peuvent être coupés à partir du tiers médian de la deuxième feuille (compter à partir du haut) du motoculteur principal des plants de riz sains à n’importe quel stade de croissance. Abréviations : ROS = espèces réactives de l’oxygène; MS = Murashige et Skoog. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Schéma de la configuration de la plaque pour mesurer la production de ROS avec différentes lignées d’Oryza sativa. Prétraitement et test des tissus de riz à l’aide d’une plaque de 96 puits. La ligne 1, la ligne 2 et la ligne 3 (jusqu’à huit lignes sur une plaque) peuvent être n’importe quel matériau d’intérêt, différents cultivars, mutants ou lignées transgéniques. Les tissus ont été stimulés avec des solutions de déclenchement avec PAMP (PAMP, blanc) ou sans PAMP (ddH₂O, gris) pour mesurer la réponse ROS. Il convient de noter que plus il y a d’échantillons à tester, plus l’intervalle de temps entre les lectures est long. Abréviations : ROS = espèces réactives de l’oxygène; PAMP = profil moléculaire associé à un agent pathogène; ddH₂O = eau bidistillée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Préparation de la solution d’élicitation

1. Dissoudre la poudre de L-012 dans une solution aqueuse de 20 mM (6,23 mg/mL) avec du_ddH2Opour obtenir la solution mère. Ensuite, diluer la solution mère avec un tampon Tris HCl de 50 mM (pH 7,5) pour obtenir la solution de travail à la concentration finale de 500 μM L-012. Conserver la solution mère congelée et diluer dans la solution de travail avant utilisation.
2. Préparer la solution provoquée contenant de la PAMP, de la L-012 et de la peroxydase de raifort (HRP; 10 mg/mL dans ddH_2O). Pour une solution élicitationnelle de 10 mL, mélanger 9,4 mL de solution de Tris HCl (pH 7,5) à 50 mM, 400 μL de la solution de L-012, 100 μL de HRP et 100 μL de flg22 (PAMP; 10 mM dans ddH₂O). Pour le témoin négatif, ajouter 100 μL de_ddH2Oau lieu de PAMP.
   REMARQUE: Conservez les solutions de déclenchement préparées à température ambiante pour éviter le stress dû au froid sur les tissus du riz. D’autres PAMP peuvent également être utilisés pour le traitement au besoin, comme la chitine (20 ng/mL en concentration finale). Puisque le L-012 est sensible à la lumière, couvrir tous les tubes contenant une solution de L-012 avec une feuille d’aluminium.

4. Démarrage du logiciel et configuration du protocole avec le lecteur de microplaques référencé (voir le tableau des matériaux)

REMARQUE: Il faut un certain temps pour configurer les paramètres du logiciel de lecteur de microplaques. Il est recommandé de préparer la machine et le protocole (un clic pour continuer) avant d’ajouter la solution d’élicitation.

1. Démarrez le logiciel. Cliquez sur le bouton Expériences pour créer un protocole ou utiliser un protocole existant.
2. Cliquez sur Procédure dans la fenêtre contextuelle pour configurer la plaque. Sélectionnez les puits de la plaque à surveiller.
3. Cliquez sur Démarrer Kinetic pour configurer la durée totale d’exécution et l’intervalle de lecture. Définissez la durée d’exécution sur 35 min ou plus, selon les exigences expérimentales. Pour obtenir des lectures aussi souvent que possible, sélectionnez Intervalle minimum. Pour le temps d’intégration, choisissez 1 s ou plus, en fonction de l’intensité du signal.
   REMARQUE: L’intervalle de lecture dépend du nombre d’échantillons et de la durée d’intégration du signal.
4. Cliquez sur Valider | OK pour confirmer les paramètres.
5. Cliquez sur Détecter la nouvelle plaque dans la fenêtre contextuelle et attendez que le logiciel invite la boîte de dialogue de la plaque de charge. Placez la plaque à tester sur le support.
6. Arrêtez-vous ici pour attendre que le système d’élicitation soit établi (dans la section suivante). Dès que le système d’élicitation est prêt, cliquez sur Exécuter pour commencer la lecture.

5. Mise en place du système d’élicitation et mesure de la production de ROS en temps réel

1. Retirez délicatement le_ddH2Odes puits contenant les tissus prétraités, en évitant toute lésion tissulaire ou dessiccation.
2. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 200 μL de la solution de déclenchement aux puits contenant les tissus.
3. Secouer doucement pour mélanger. Cliquez sur Exécuter pour lancer la détection.
   REMARQUE: Avec le traitement PAMP, les tissus végétaux répondent et produisent des ROS très rapidement. Par conséquent, il est suggéré que le contrôle négatif sans PAMP soit traité en premier pour réduire la durée de l’opération, lorsqu’il y a plusieurs traitements. Opérer le plus rapidement possible pour réduire le délai d’obtention entre les traitements. Plus le temps entre l’ajout de la solution d’élicitation et le début de la détection est court, meilleure sera la saisie des données expérimentales importantes.

Résultats

Ici, nous prenons l’exemple du riz pour déterminer les ROS produites avec le traitement flg22. La génération de ROS après déclenchement est transitoire. Dans le riz, l’augmentation de la production de ROS a été détectée pour la première fois en 1-2 min, a culminé à 10-12 min, et est revenue à la ligne de base en ~30-35 min (Figure 3). Par rapport à l’essai de contrôle, dans lequel le PAMP était absent de la solution de déclenchion, ce qui n’a entraîné aucune induct...

Discussion

Le but de cette étude était d’établir une méthode très efficace pour quantifier la production précoce de ROS en réponse au PAMP dans les tissus du riz. Cette méthode fournit une procédure normalisée pour la détermination en temps réel de l’apoplast ROS produit à partir de tissus de riz traités. Cette méthode est simple à utiliser, peu coûteuse, claire dans sa composition et indépendante des kits commerciaux. Grâce à cette méthode, les chercheurs peuvent étudier la production en temps réel d’a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well microtiter plate	WHB	WHB-96-01
Ethanol absolute	Innochem	A43543
flg22	Sangon Biotech	p20973	PAMP
Gen5	BioTek		software
L-012	FUJIFILM	120-04891	8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5
Microplate reader	BioTek	Synergy 2
MS Medium	Solarbio	M8521
NaCLO	Aladdin	S101636
Peroxidase from horseradish (HRP)	Sigma	P8375
Phytagel	Sigma	P8169
Sampler	Miltex	15110-40
Sucrose	Sangon Biotech	A502792
Tris	Sangon Biotech	A610195