Detecção em Tempo Real da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio na Resposta Imune em Arroz com Ensaio de Quimioluminescência

Resumo

Aqui, descrevemos um método para a detecção em tempo real da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) apoplásicas em tecidos de arroz em resposta imune desencadeada por padrão molecular associado a patógenos. Este método é simples, padronizado e gera resultados altamente reprodutíveis em condições controladas.

Resumo

Espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenham papéis vitais em uma variedade de processos biológicos, incluindo a detecção de estresses abióticos e bióticos. Após a infecção do patógeno ou desafio com produtos químicos associados a patógenos (padrões moleculares associados a patógenos [PAMPs]), uma série de respostas imunes, incluindo uma explosão de ROS, são rapidamente induzidas em plantas, o que é chamado de imunidade desencadeada por PAMP (PTI). A explosão de ROS é uma resposta característica do PTI, que é catalisada por um grupo de NADPH oxidases localizadas na membrana plasmática - as proteínas da família RBOH. A grande maioria das ERO compreende peróxido de hidrogênio (H2 O₂), que pode ser fácil e constantemente detectado por um método de quimioluminescência à base de luminol. A quimioluminescência é uma reação produtora de fótons na qual o luminol, ou seu derivado (como L-012), sofre uma reação redox com ROS sob a ação de um catalisador. Este trabalho descreve um método otimizado de quimioluminescência baseado em L-012 para detectar a produção de ROS de apoplasto em tempo real após a elicitação por PAMP em tecidos de arroz. O método é fácil, estável, padronizado e altamente reprodutível sob condições firmemente controladas.

Introdução

As espécies reativas de oxigênio (EROs) compreendem uma série de derivados quimicamente ativos do oxigênio, incluindo radicais ânion superóxido (O₂-) e seus derivados, radicais hidroxila ^(OH-), peróxido de hidrogênio e produtos de oxigênio singlete ou reações de oxidação-redução, que são constantemente produzidos em plastídios e cloroplastos, mitocôndrias, peroxissomas e outros locais subcelulares ¹ . As ERO desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos e são essenciais para todas as plantas ^2,3,4

Protocolo

NOTA: O protocolo é aplicável a diferentes tecidos vegetais. Bainha de arroz e discos foliares foram utilizados neste protocolo para detecção de ROS após elicitação de PAMP. Uma vez que as diferenças surgem principalmente devido ao método de amostragem, apenas os procedimentos comuns são descritos a seguir, sendo mencionadas etapas específicas sempre que necessário.

1. Cultura vegetal

1. Esterilizar as sementes de arroz descascadas com etanol 70% por 1 min e, em seguida, com hipoclorito de sódio (NaClO) a 40% por 1 h. Em seguida, enxágue as sementes 5x com água estéril para remover o cloro residual.
2. Planear....

Resultados

Aqui, tomamos o material de arroz como exemplo para determinar as ROS produzidas com o tratamento flg22. A geração de ROS após a elicitação é transitória. No arroz, o aumento na produção de ROS foi detectado pela primeira vez em 1-2 min, atingiu o pico em 10-12 min e retornou à linha de base em ~30-35 min (Figura 3). Em comparação com o teste controle, no qual PAMP estava ausente na solução de elicitação, resultando em indução de ROS sem óbvia, um burst específico de ROS .......

Discussão

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método altamente eficiente para quantificar a produção precoce de ERO em resposta ao PAMP em tecidos de arroz. Este método fornece um procedimento padronizado para a determinação em tempo real de ROS de apoplasto produzido a partir de tecidos de arroz tratados. Este método é simples na operação, baixo custo, claro na composição e independente de kits comerciais. Usando este método, os pesquisadores podem estudar a produção em tempo real de ROS apoplasto quando as .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well microtiter plate	WHB	WHB-96-01
Ethanol absolute	Innochem	A43543
flg22	Sangon Biotech	p20973	PAMP
Gen5	BioTek		software
L-012	FUJIFILM	120-04891	8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5
Microplate reader	BioTek	Synergy 2
MS Medium	Solarbio	M8521
NaCLO	Aladdin	S101636
Peroxidase from horseradish (HRP)	Sigma	P8375
Phytagel	Sigma	P8169
Sampler	Miltex	15110-40
Sucrose	Sangon Biotech	A502792
Tris	Sangon Biotech	A610195