Una sonda de fluorescencia NIR-II brillante para imágenes vasculares y tumorales

Resumen

El presente protocolo describe una operación detallada de imágenes de fluorescencia NIR-II en tiempo real de un ratón utilizando un dispositivo de imágenes ópticas NIR-II.

Resumen

Como tecnología de imagen emergente, las imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano II (NIR-II, 1000-1700 nm) tienen un potencial significativo en el campo biomédico, debido a su alta sensibilidad, penetración de tejido profundo e imágenes superiores con resolución espacial y temporal. Sin embargo, el método para facilitar la implementación de imágenes de fluorescencia NIR-II para algunos campos urgentemente necesarios, como la ciencia médica y la farmacia, ha desconcertado a los investigadores relevantes. Este protocolo describe en detalle la construcción y las aplicaciones de bioimagen de una sonda molecular de fluorescencia NIR-II, HLY1, con un esqueleto D-A-D (donante-aceptor-donante). HLY1 mostró buenas propiedades ópticas y biocompatibilidad. Además, las imágenes vasculares y tumorales NIR-II en ratones se realizaron utilizando un dispositivo de imágenes ópticas NIR-II. Se adquirieron imágenes de fluorescencia NIR-II de alta resolución en tiempo real para guiar la detección de tumores y enfermedades vasculares. Desde la preparación de la sonda hasta la adquisición de datos, la calidad de la imagen se mejora considerablemente y se garantiza la autenticidad de las sondas moleculares NIR-II para el registro de datos en imágenes intravitales.

Introducción

La imagen de fluorescencia es la herramienta de imagen molecular comúnmente utilizada en la investigación básica, y también se usa a menudo para guiar la resección quirúrgica del tumor en las clínicas¹. El principio esencial de las imágenes de fluorescencia es emplear una cámara para recibir la fluorescencia emitida por un láser después de la irradiación de muestras (tejidos, órganos, etc.) ². El proceso se completa en unos pocos milisegundos³. Las longitudes de onda de las imágenes de fluorescencia se pueden dividir en ultravioleta (200-400 nm), región visible (400-700 nm), infrarrojo cercano I (NIR-I, 700-900 nm) e infrarrojo cercano II (NIR-II, 1000-1700 nm)^4,5,6. Debido a que las moléculas endógenas como la hemoglobina, la melanina, la desoxihemoglobina y la bilirrubina en los tejidos biológicos tienen una fuerte absorción y un efecto de dispersión sobre la luz en las regiones visibles, la penetración y la sensibilidad de la luz se reducen considerablemente, y la imagen de fluorescencia en longitudes de onda de luz visible se ve afectada negativamente ^7,8,9.

Las imágenes de fluorescencia NIR-II tienen baja absorción y dispersión de fotones, alta velocidad de imagen y alto contraste (o sensibilidad) de ^imagen10,11. A medida que aumenta la longitud de onda de la fluorescencia, la absorción y dispersión de la fluorescencia en los tejidos biológicos disminuye gradualmente, y la autofluorescencia en la región NIR-II es extremadamente baja¹². Así, la ventana NIR-II aumenta significativamente la profundidad de penetración de los tejidos y obtiene una mayor resolución y relación señal-ruido^13,14,15. La ventana NIR-II se puede subdividir en las ventanas NIR-IIa (1300-1400 nm) y NIR-lIb (1500-1700 nm)¹⁶. Hasta la fecha, se han reportado varios materiales NIR-II importantes, incluidos nanotubos de carbono de pared simple de material inorgánico, nanopartículas de tierras raras, puntos cuánticos y nanopartículas de polímeros semiconductores de material orgánico, colorantes de moléculas pequeñas, materiales luminiscentes inducidos por agregación, etc. 1,17,18,19,20,21,22. Los nanomateriales inorgánicos se acumulan fácilmente en el hígado, el bazo, etc., y tienen una biotoxicidad potencial a largo plazo²³. El fluoróforo orgánico de molécula pequeña tiene las ventajas de metabolismo rápido, baja toxicidad, fácil modificación y una estructura clara, que es la sonda más prometedora para uso clínico²⁴.

El sistema de imágenes ópticas NIR-II también es un componente crítico de la bioimagen de fluorescencia porque puede recolectar eficazmente señales de fluorescencia NIR-II de la sonda NIR-II, lo que genera imágenes funcionales, anatómicas y moleculares precisas^25,26. El sistema de imágenes NIR-II comprende principalmente cámaras infrarrojas de onda corta, filtros de paso largo (LP), láseres y procesadores de computadora. In vivo La imagen fluorescente NIR-II es considerada uno de los enfoques de imagen más factibles para dilucidar los mecanismos de las enfermedades y la naturaleza de la vida^27,28,29. La tecnología de imagen NIR-II ha sido ampliamente utilizada en campos biomédicos como la detección de células cancerosas, imágenes dinámicas, rastreo dirigido in vivo y terapia dirigida, especialmente en investigación oncológica^30,31. Sin embargo, teniendo en cuenta los altos requisitos técnicos de la tecnología de imágenes NIR-II en sondas e instrumentos de imágenes, también desconcierta y restringe el uso práctico de los investigadores en diferentes campos. Por lo tanto, la preparación de sondas de imagen NIR-II y las aplicaciones de imágenes NIR-II se presentan en detalle en este artículo.

Protocolo

Los experimentos con animales para estudios de imágenes NIR-II se llevaron a cabo en el Centro de Experimentos con Animales de la Universidad de Wuhan, que ha sido galardonado con la Asociación Internacional para el Cuidado de Animales Experimentales (AALAC). Todos los estudios en animales se realizaron siguiendo las Directrices de la Comisión de Bienestar Animal de China para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Experimental de Animales de la Universidad de Wuhan.

Para el presente estudio se utilizaron ratones desnudos BALB/c hembra (~20 g) a las 6 semanas de edad.

1. Preparación de imágenes NIR-II

1. Coloque cartón negro disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en el centro del transportador. Luego, coloque la muestra encima del cartón negro, de modo que la muestra esté en el centro del portador (una etapa ubicada en el dispositivo de imágenes).
   NOTA: En comparación con el cartón blanco, el cartón negro tiene menos interferencia de fondo durante las imágenes NIR-II.
2. Seleccione un filtro adecuado en función de la longitud de onda de la sonda NIR-II. Pulse long (>2 s) para controlar el área de la caja (como 900 LP) correspondiente al modelo de filtro en la interfaz de pantalla cuando el sistema mueve el filtro a la ruta de imagen óptica.
3. Mantenga presionada la plataforma hacia arriba en la interfaz de la pantalla táctil del área de control de la consola del operador para que las consolas del portador se levanten; Mantenga presionada la plataforma hacia abajo para que el portador se consuele hacia abajo.
4. Ajuste la altura de la plataforma a "0 mm" (ajuste de altura) y utilice el enfoque automático para que la imagen NIR-II sea clara.

2. Síntesis del colorante NIR-II (HLY1)

1. Pesar las materias primas necesarias para el experimento de síntesis. Asegúrese de que no se deterioren.
2. Añadir el compuesto 1 (200 mg, 0,18 mmol), PdCl 2(dppf)2 CH 2 Cl 2 (28 mg, 0,04 mmol), N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)naftalen-2-amina (170 mg, 0,4 mmol) y K ₂ CO₃ (46 mg, 0,34 mmol) a lasolución de tetrahidrofurano (THF) en un matraz de fondo redondo de 25 ml. Revuelva la mezcla durante 4 h a 75 °C bajo atmósfera de_N2 (Figura 1A).
   NOTA: Para el procedimiento de síntesis del compuesto 1 y N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)naftalen-2-amina, véase Li et al²¹. Las estructuras químicas se muestran en la Figura 1A.
3. Después de enfriar a temperatura ambiente, apagar la reacción con agua destilada (DI) (80 ml) y extraer la mezcla con DCM (diclorometano)/_H2O(30 ml) (tres veces). Purificar el producto crudo mediante cromatografía en columna 16 (éter de petróleo: DCM =¹⁰ : 1) para hacer de HLY1 un sólido verde (78 mg, 30% de rendimiento).
4. Coloque el tinte HLY1 bajo la protección de nitrógeno en el refrigerador para su uso posterior. Esto se puede almacenar hasta por 6 meses.

3. Preparación de nanosondas suspensibles al agua

1. Pesar HLY1 (1 mg) y materiales de encapsulación anfipática, 1,2-distearoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2k (DSPE-PEG2k, 10 mg; ver Tabla de materiales).
2. Prepare HLY1 puntos²⁰ empleando DSPE-PEG2k como matriz de encapsulación (método de nanoprecipitación¹²) (Figura 1C). Disolver HLY1 en THF (1 ml) y añadir lentamente a un vaso de precipitados que contenga solución acuosa DSPE-PEG2k (9 ml) con sonicación a 25 °C. Posteriormente, retire el THF de la mezcla mediante diálisis²⁰.
3. Concentrar la solución anterior centrífugamente con ultrafiltración 18 (7100 x g durante¹⁰ min) y luego colocarla en un refrigerador a 4 °C para su uso futuro. Esto se puede almacenar hasta por 1 mes.
   NOTA: La solución acuosa de nanosonda cargada por DSPE-PEG_2k debe almacenarse por encima de 0 °C y utilizarse lo antes posible.

4. Construcción de ratones portadores de tumores

1. Cultive células de cáncer de mama de ratón 4T1 (4T1) en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (v / v) y penicilina-estreptomicina al 1% (v / v) (consulte la Tabla de materiales), y manténgalo en una incubadora humidificada con 5% de_CO2 a 37 ° C.
2. Para el experimento de imágenes fluorescentes NIR-II, cultivar células 4T1 (5 x 10⁷) durante 24 h, digerir con tripsina (1 ml) y lavar dos veces con DMEM sin suero (4 ml).
3. Anestesiar a los ratones mediante el tratamiento con isoflurano (2%). Confirme la anestesia adecuada estimulando los dedos de los pies o las plantas de los pies de los ratones, y observe si los ratones responden. Si no hay respuesta, significa que la anestesia es suficiente³².
4. Luego, usando una aguja de inyección de insulina, inyecte la mezcla de células 4T1 en los ratones a través de una inyección subcutánea (100 μL).
   NOTA: Los estudios de imagen NIR-II se realizaron ~ 2 semanas después de la inoculación, cuando el tumor había crecido a un volumen de ~ 100 mm³. Antes de la toma de imágenes del tumor NIR-II, confirme el tamaño del tumor. El tamaño del tumor fue estimado por un calibrador vernier electrónico para el presente estudio¹¹.

5. Imágenes de fluorescencia NIR-II in vivo

1. Anestesiar a los ratones tratando con isoflurano (2%) y realizar imágenes NIR-II de todo el cuerpo de los ratones utilizando un sistema óptico de imágenes NIR-II (ver Tabla de materiales).
   NOTA: Preste atención a la dosis de anestésico para evitar la muerte de los ratones. Generalmente, la anestesia dura de 5 a 10 minutos. Estimule los dedos de los pies o las plantas de los pies de los ratones y observe si los ratones responden. Si no hay respuesta, significa que la anestesia es suficiente.
2. Tome una solución de HLY1 puntos (0,8 mg/ml, 200 μl). Inyecte los puntos HLY1 por vía intravenosa en los ratones anestesiados, y 3 minutos más tarde, realice imágenes de fluorescencia NIR-II de los vasos sanguíneos de todo el cuerpo de ratones utilizando un sistema de imágenes NIR-II. Concéntrese más en la cabeza del ratón para recolectar imágenes vasculares cerebrales.
   NOTA: Use guantes experimentales limpios durante la toma de imágenes, lo que ayudará a obtener imágenes NIR-II limpias.
3. Recopile las imágenes 5 minutos después de la inyección de puntos HLY1 en ratones y procese los datos utilizando el software ImageJ. Los parámetros del instrumento del sistema óptico de imágenes NIR-II son 90 mW/^cm2 (láser de 808 nm).
4. Al finalizar el experimento, sacrificar a los animales siguiendo protocolos aprobados institucionalmente.
   NOTA: Para el presente estudio, los animales fueron sacrificados exponiéndolos a un exceso de isoflurano³².

Resultados

La intensidad fluorescente y el brillo de los puntos HLY1 suspensibles al agua se determinaron mediante un instrumento de imagen NIR-II. La intensidad fluorescente de HLY1 en la mezcla de 90%_{f w} THF/_H2Ofue cinco veces mayor que en la solución de THF, lo que indicó una característica prominente de AIE de HLY1 (Figura 1B). Además, los puntos HLY1 emitieron fuertes señales fluorescentes bajo un filtro LP de 1.500 nm, lo que demuestra que los puntos HLY1 se pu...

Discusión

Las imágenes fluorescentes NIR-I se pueden usar hasta cierto punto para imágenes tumorales y vasculares, pero debido a la longitud de onda de emisión máxima limitada de los fluoróforos NIR-I (<900 nm), da como resultado una penetración tisular deficiente y una relación de fondo de señal tumoral^33,34. La resolución de imágenes deficiente y baja puede causar una desviación entre el resultado del tratamiento de retroalimentación de imágenes y el efecto ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous pyridine	Perimed	110-86-1
Anhydrous sodium sulfate	China national medicines Co.,Ltd	SY006376
Black cardboard	Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd	AO00158
Column chromatography	Energy Chemical	E080498
Diphenylphosphine palladium dichloride	Sigma-Aldrich	B2161-1g
DSPE-PEG2000	Ponsure	PS-E1
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	8121587
EGTA	Biofroxx	EZ6789D115
Fetal bovine serum	Gibco	2166090RP
Isoflurane	GLPBIO	GC45487-1
K2CO3	Macklin	P816305-5g
N. N '- dimethylformamide	China national medicines Co.,Ltd	02-12-1968
NIR-II imaging instrument	Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd	16011109
N-sulfenanilide	Enerry chemical	1250030-5g
PdCl2(dppf)2CH2Cl2	TCI	B2064-1g
penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Tetrahydrofuran	China national medicines Co.,Ltd	M005197
Tetratriphenylphosphine palladium	Immochem	1021232-5g
Tetratriphenylphosphine palladium	Sigma-Aldrich	1021232-5g
Tributyltin chloride	Immochem	QH004335
Trimethylchlorosilane	China national medicines Co.,Ltd	40060560