JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описывается детальная операция флуоресцентной визуализации мыши в режиме реального времени NIR-II с использованием оптического устройства визуализации NIR-II.

Аннотация

Флуоресцентная визуализация ближнего инфракрасного диапазона II (NIR-II, 1000-1700 нм) имеет значительный потенциал в биомедицинской области благодаря своей высокой чувствительности, глубокому проникновению в ткани и превосходной визуализации с пространственным и временным разрешением. Тем не менее, метод, облегчающий внедрение флуоресцентной визуализации NIR-II для некоторых остро необходимых областей, таких как медицина и фармация, озадачил соответствующих исследователей. В этом протоколе подробно описывается конструкция и применение биовизуализации флуоресцентного молекулярного зонда NIR-II, HLY1, со скелетом D-A-D (донор-акцептор-донор). HLY1 показал хорошие оптические свойства и биосовместимость. Кроме того, визуализация сосудов и опухолей NIR-II у мышей проводилась с использованием оптического устройства визуализации NIR-II. Флуоресцентные изображения NIR-II с высоким разрешением в режиме реального времени были получены для выявления опухолей и сосудистых заболеваний. От подготовки зонда до сбора данных качество визуализации значительно улучшается, и обеспечивается подлинность молекулярных зондов NIR-II для записи данных при прижизненной визуализации.

Введение

Флуоресцентная визуализация является широко используемым инструментом молекулярной визуализации в фундаментальных исследованиях, а также часто используется для проведения хирургической резекции опухоли в клиниках1. Основной принцип флуоресцентной визуализации заключается в использовании камеры для получения флуоресценции, испускаемой лазером после облучения образцов (тканей, органов и т. Д.) 2. Процесс завершается в течение нескольких миллисекунд3. Длины волн флуоресцентной визуализации можно разделить на ультрафиолетовую (200-400 нм), видимую область (400-700 нм), ближнюю инфракрасную I (NIR-I, 700-900 нм) и ближнюю инфракрасную II (NIR-II, 1000-1700 нм)4,5,6. Поскольку эндогенные молекулы, такие как гемоглобин, меланин, дезоксигемоглобин и билирубин в биологических тканях, оказывают сильное поглощающее и рассеивающее действие на свет в видимых областях, проникновение и чувствительность света значительно снижаются, а флуоресцентная визуализация в длинах волн видимого света подвергается неблагоприятному влиянию 7,8,9.

Флуоресцентная визуализация NIR-II имеет низкое поглощение и рассеяние фотонов, высокую скорость визуализации и высокую контрастность (или чувствительность) изображения10,11. По мере увеличения длины волны флуоресценции поглощение и рассеяние флуоресценции в биологических тканях постепенно уменьшаются, а автофлуоресценция в области NIR-II чрезвычайно мала12. Таким образом, окно NIR-II значительно увеличивает глубину проникновения тканей и получает более высокое разрешение и отношение сигнал/шум13,14,15. Окно NIR-II можно разделить на окна NIR-IIa (1300-1400 нм) и NIR-lIb (1500-1700 нм)16. На сегодняшний день сообщалось о нескольких основных материалах NIR-II, включая одностенные углеродные нанотрубки из неорганических материалов, редкоземельные наночастицы, квантовые точки и полупроводниковые полимерные наночастицы из органических материалов, низкомолекулярные красители, люминесцентные материалы, индуцированные агрегацией, и т. д. 1,17,18,19,20,21,22. Неорганические наноматериалы легко накапливаются в печени, селезенке и т. д. и обладают потенциальной долгосрочной биотоксичностью23. Органический низкомолекулярный флуорофор обладает такими преимуществами, как быстрый метаболизм, низкая токсичность, легкая модификация и четкая структура, что является наиболее перспективным зондом для клинического использования24.

Оптическая система визуализации NIR-II также является важнейшим компонентом флуоресцентной биовизуализации, поскольку она может эффективно собирать флуоресцентные сигналы NIR-II от зонда NIR-II, тем самым получая точные функциональные, анатомические и молекулярные изображения25,26. Система визуализации NIR-II в основном включает в себя коротковолновые инфракрасные камеры, фильтры длинных частот (LP), лазеры и компьютерные процессоры. В естественных условиях Флуоресцентная визуализация NIR-II считается одним из наиболее осуществимых подходов к визуализации для выяснения механизмов заболеваний и характера жизни27,28,29. Технология визуализации NIR-II широко используется в биомедицинских областях, таких как обнаружение раковых клеток, динамическая визуализация, целевое отслеживание in vivo и таргетная терапия, особенно в онкологических исследованиях30,31. Однако, учитывая высокие технические требования к технологии визуализации NIR-II к датчикам и инструментам визуализации, это также озадачивает и ограничивает практическое использование исследователей в различных областях. Таким образом, в этой статье подробно рассматривается подготовка датчиков для получения изображений NIR-II и применение изображений NIR-II.

протокол

Эксперименты на животных для визуализационных исследований NIR-II были проведены в Центре экспериментов на животных Уханьского университета, который был удостоен награды Международной ассоциации по уходу за экспериментальными животными (AALAC). Все исследования на животных были проведены в соответствии с Руководящими принципами Китайской комиссии по защите животных по уходу и использованию экспериментальных животных и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Экспериментального центра животных Уханьского университета.

Для настоящего исследования использовались самки обнаженных мышей BALB/c (~ 20 г) в возрасте 6 недель.

1. Подготовка к визуализации NIR-II

  1. Поместите имеющийся в продаже черный картон (см. Таблицу материалов) в центр носителя. Затем поместите образец поверх черного картона так, чтобы образец находился в центре носителя (столика, расположенного в устройстве формирования изображения).
    ПРИМЕЧАНИЕ: По сравнению с белым картоном, черный картон имеет меньше фоновых помех во время визуализации NIR-II.
  2. Выберите подходящий фильтр в зависимости от длины волны зонда NIR-II. Нажмите и удерживайте (>2 с), чтобы управлять областью коробки (например, 900 LP), соответствующей модели фильтра в экранном интерфейсе, когда система перемещает фильтр в оптический тракт изображения.
  3. Нажмите и удерживайте платформу на интерфейсе сенсорного экрана области управления консолью оператора, чтобы консоль оператора поднялась; Нажмите и удерживайте платформу вниз , чтобы несущие консоли опустились.
  4. Отрегулируйте высоту платформы на «0 мм» (регулировка высоты) и используйте автоматическую фокусировку, чтобы сделать изображение NIR-II четким.

2. Синтез красителя NIR-II (HLY1)

  1. Взвесьте сырье, необходимое для эксперимента по синтезу. Следите за тем, чтобы они не испортились.
  2. Добавьте соединение 1 (200 мг, 0,18 ммоль), PdCl 2 (dppf) 2 CH 2 Cl 2 (28 мг, 0,04 ммоль), N-фенил-N- (4- (4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил) фенил) нафталин-2-амин (170 мг, 0,4 ммоль) и K 2 CO3 (46 мг, 0,34 ммоль) в раствор тетрагидрофурана (ТГФ) в колбе с круглым дном 25 мл. Перемешивайте смесь в течение 4 ч при 75 °C в атмосфере N2 (рис. 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедуры синтеза соединения 1 и N-фенил-N-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)нафталина-2-амина см. Li et al21. Химические структуры показаны на рисунке 1А.
  3. После охлаждения до температуры окружающей среды погасите реакцию дистиллированной (DI) водой (80 мл) и извлеките смесь DCM (дихлорметаном)/H2O (30 мл) (три раза). Очистите сырой продукт с помощью колоночной хроматографии16 (петролейный эфир: DCM = 10: 1), чтобы сделать HLY1 зеленым твердым веществом (78 мг, выход 30%).
  4. Поместите краситель HLY1 под защиту азота в холодильник для последующего использования. Это может храниться до 6 месяцев.

3. Приготовление водонастойки нанозонда

  1. Взвесьте HLY1 (1 мг) и амфипатические инкапсуляционные материалы, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино (полиэтиленгликоль)-2k (DSPE-PEG2k, 10 мг; см. Таблицу материалов).
  2. Подготовьте точкиHLY1 20 , используя DSPE-PEG2k в качестве матрицы инкапсуляции (метод наноосаждения12) (рис. 1C). Растворите HLY1 в ТГФ (1 мл) и медленно добавьте в стакан, содержащий водный раствор DSPE-PEG2k (9 мл) с ультразвуком при 25 ° C. Затем удаляют ТГФ из смеси с помощью диализа20.
  3. Концентратируйте вышеуказанный раствор центробежно с помощью ультрафильтрации 18 (7100 x g в течение10 мин), а затем поместите его в холодильник с температурой 4 °C для будущего использования. Это может храниться до 1 месяца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Водный раствор нанозонда, загруженный DSPE-PEG2k , следует хранить при температуре выше 0 °C и использовать как можно скорее.

4. Строительство мышей с опухолями

  1. Культивируйте клетки рака молочной железы мышей 4T1 (4T1) в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (DMEM), дополненную 10% (v/v) фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% (v/v) пенициллин-стрептомицином (см. Таблицу материалов), и храните в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 при 37 ° C.
  2. Для эксперимента по флуоресцентной визуализации NIR-II культивируют клетки 4T1 (5 x 107) в течение 24 ч, переваривают трипсином (1 мл) и дважды промывают ДМЭМ без сыворотки (4 мл).
  3. Обезболивают мышей, обрабатывая изофлураном (2%). Подтвердите адекватную анестезию, стимулируя пальцы ног или подошвы ног мышей, и наблюдайте, реагируют ли мыши. Если ответа нет, значит, анестезии достаточно32.
  4. Затем, используя иглу для инъекции инсулина, введите мышам клеточную смесь 4T1 путем подкожной инъекции (100 мкл).
    Примечание: Визуализирующие исследования NIR-II проводились через ~2 недели после инокуляции, когда опухоль выросла до объема ~100мм3. Перед визуализацией опухоли NIR-II подтвердите размер опухоли. Размер опухоли оценивали с помощью электронного штангенциркуля для настоящего исследования11.

5. Флуоресцентная визуализация in vivo NIR-II

  1. Обезболивают мышей, обрабатывая изофлураном (2%), и выполняют визуализацию NIR-II всего тела мышей с использованием оптической системы визуализации NIR-II (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на дозировку анестетика, чтобы избежать гибели мышей. Как правило, анестезия длится 5-10 минут. Стимулируйте пальцы ног или подошвы ног мышей и наблюдайте, реагируют ли мыши. Если ответа нет, значит, анестезии достаточно.
  2. Возьмите раствор HLY1 dots (0,8 мг/мл, 200 мкл). Введите точки HLY1 внутривенно анестезированным мышам, а через 3 минуты выполните флуоресцентную визуализацию кровеносных сосудов всего тела мышей NIR-II с помощью системы визуализации NIR-II. Сосредоточьтесь на голове мыши, чтобы получить сосудистую визуализацию мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время визуализации используйте чистые экспериментальные перчатки, которые помогут получить чистые изображения NIR-II.
  3. Соберите изображения через 5 минут после инъекции точек HLY1 мышам и обработайте данные с помощью программного обеспечения ImageJ. Параметры прибора оптической системы визуализации NIR-II составляют 90 мВт/см2 (лазер 808 нм).
  4. По завершении эксперимента усыпьте животных в соответствии с институционально утвержденными протоколами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования животных усыпляли, подвергая их воздействию избытка изофлурана32.

Результаты

Интенсивность флуоресценции и яркость водозависимых точек HLY1 определяли с помощью прибора для визуализации NIR-II. Интенсивность флуоресценции HLY1 в смеси 90%f wTHF/H2O была в пять раз выше, чем в растворе THF, что указывало на заметную особенность AIE HLY1 (рис. 1B). Кр?...

Обсуждение

Флуоресцентная визуализация NIR-I может быть в некоторой степени использована для визуализации опухолей и сосудов, но из-за ограниченной максимальной длины волны излучения флуорофоров NIR-I (<900 нм) это приводит к плохому проникновению в ткани и фоновому отношению сигнала опухоли...

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами NSFC (82273796, 82111530209), Специальными фондами для руководства местным научно-техническим развитием центрального правительства (XZ202202YD0021C, XZ202102YD0033C, XZ202001YD0028C), Ключевым научно-техническим инновационным проектом провинции Хубэй (2020BAB058), Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов и Программами профилактики и контроля COVID-19 Тибетского автономного района для развития науки и технологий.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anhydrous pyridinePerimed 110-86-1
Anhydrous sodium sulfateChina national medicines Co.,LtdSY006376
Black cardboardSuzhou Yingrui Optical Technology Co., LtdAO00158
Column chromatographyEnergy ChemicalE080498
Diphenylphosphine palladium dichlorideSigma-AldrichB2161-1g
DSPE-PEG2000PonsurePS-E1
Dulbecco's modified eagle medium Gibco8121587
EGTABiofroxxEZ6789D115
Fetal bovine serumGibco2166090RP
IsofluraneGLPBIOGC45487-1
K2CO3MacklinP816305-5g
N. N '- dimethylformamideChina national medicines Co.,Ltd02-12-1968
NIR-II imaging instrumentSuzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd16011109
N-sulfenanilideEnerry chemical 1250030-5g
PdCl2(dppf)2CH2Cl2TCI B2064-1g
penicillin-streptomycinGibco15140-122
TetrahydrofuranChina national medicines Co.,LtdM005197
Tetratriphenylphosphine palladiumImmochem1021232-5g
Tetratriphenylphosphine palladiumSigma-Aldrich1021232-5g
Tributyltin chlorideImmochemQH004335
TrimethylchlorosilaneChina national medicines Co.,Ltd40060560

Ссылки

  1. Liu, Y., et al. Versatile types of inorganic/organic NIR-IIa/IIb fluorophores: from strategic design toward molecular imaging and theranostics. Chemical Reviews. 122 (1), 209-268 (2022).
  2. Zhou, H., et al. Mn-loaded apolactoferrin dots for in vivo MRI and NIR-II cancer imaging. Journal of Materials Chemistry C. 7 (31), 9448-9454 (2019).
  3. Zhang, F., Tang, B. Z. Near-infrared luminescent probes for bioimaging and biosensing. Chemical Science. 12 (10), 3377-3378 (2021).
  4. Yao, C., et al. A bright, renal-clearable NIR-II brush macromolecular probe with long blood circulation time for kidney disease bioimaging. Angewandte Chemie International Edition. 61 (5), 202114273 (2022).
  5. Gao, S., et al. Molecular engineering of near-infrared-II photosensitizers with steric-hindrance effect for image-guided cancer photodynamic therapy. Advanced Functional Materials. 31 (14), 2008356 (2021).
  6. Ding, F., Fan, Y., Sun, Y., Zhang, F. Beyond 1000 nm emission wavelength: recent advances in organic and inorganic emitters for deep-tissue molecular imaging. Advanced Healthcare Materials. 8 (14), 1900260 (2019).
  7. Yang, Y., Zhang, F. Molecular fluorophores for in vivo bioimaging in the second near-infrared window. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (9), 3226-3246 (2022).
  8. Ding, B., et al. Polymethine thiopyrylium fluorophores with absorption beyond 1000 nm for biological imaging in the second near-infrared subwindow. Journal of Medicinal Chemistry. 62 (4), 2049-2059 (2019).
  9. Cheng, X., et al. Novel diketopyrrolopyrrole Nir-Ii fluorophores and Ddr inhibitors for in vivo chemo-photodynamic therapy of osteosarcoma. Chemical Engineering Journal. , 136929 (2022).
  10. Yang, Y., et al. Nir-Ii chemiluminescence molecular sensor for in vivo high-contrast inflammation imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59 (42), 18380-18385 (2020).
  11. Liu, Y., et al. A second near-infrared Ru(Ii) polypyridyl complex for synergistic chemo-photothermal therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (3), 2225-2237 (2022).
  12. Xu, Y., et al. Long wavelength-emissive Ru(Ii) metallacycle-based photosensitizer assisting in vivo bacterial diagnosis and antibacterial treatment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (32), 2209904119 (2022).
  13. Xu, Y., et al. Construction of emissive Ruthenium(II) metallacycle over 1000 nm wavelength for in vivo biomedical applications. Nature Communications. 13 (1), 2009 (2022).
  14. Wang, S., Li, B., Zhang, F. Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging. ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).
  15. Sun, Y., Sun, P., Li, Z., Qu, L., Guo, W. Natural flavylium-inspired far-red to NIR-II dyes and their applications as fluorescent probes for biomedical sensing. Chemical Society Reviews. 51 (16), 7170-7205 (2022).
  16. Shen, H., et al. Rational design of NIR-II AIEgens with ultrahigh quantum yields for photo- and chemiluminescence imaging. Journal of the American Chemical Society. 144 (33), 15391-15402 (2022).
  17. Mu, J., et al. The chemistry of organic contrast agents in the NIR-II window. Angewandte Chemie International Edition. 61 (14), 202114722 (2022).
  18. Lu, S., et al. NIR-II fluorescence/photoacoustic imaging of ovarian cancer and peritoneal metastasis. Nano Research. 15 (10), 9183-9191 (2022).
  19. Liu, Y., et al. Novel Cd-Mof NIR-II fluorophores for gastric ulcer imaging. Chinese Chemical Letters. 32 (10), 3061-3065 (2021).
  20. Lin, J., et al. Novel near-infrared II aggregation-induced emission dots for in vivo bioimaging. Chemical Science. 10 (4), 1219-1226 (2018).
  21. Li, Y., et al. Small-molecule fluorophores for near-infrared IIb imaging and image-guided therapy of vascular diseases. CCS Chemistry. 4 (12), 3735-3750 (2022).
  22. Li, Y., et al. Novel NIR-II organic fluorophores for bioimaging beyond 1550 nm. Chemical Science. 11 (10), 2621-2626 (2020).
  23. Li, Y., et al. Organic NIR-II dyes with ultralong circulation persistence for image-guided delivery and therapy. Journal of Controlled Release. 342, 157-169 (2022).
  24. Li, Y., et al. Self-assembled NIR-II fluorophores with ultralong blood circulation for cancer imaging and image-guided surgery. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (3), 2078-2090 (2022).
  25. Li, Q., et al. Novel small-molecule fluorophores for in vivo NIR-IIa and NIR-IIb imaging. Chemical Communications. 56 (22), 3289-3292 (2020).
  26. Li, J., et al. Recent advances in the development of NIR-II organic emitters for biomedicine. Coordination Chemistry Reviews. 415, 213318 (2020).
  27. Li, J., et al. long-fluorescence-lifetime dyes for deep-near-infrared bioimaging. Journal of the American Chemical Society. 144 (31), 14351-14362 (2022).
  28. Li, C., Chen, G., Zhang, Y., Wu, F., Wang, Q. Advanced fluorescence imaging technology in the near-infrared-II window for biomedical applications. Journal of the American Chemical Society. 142 (35), 14789-14804 (2020).
  29. Li, B., Lin, J., Huang, P., Chen, X. Near-infrared probes for luminescence lifetime imaging. Nanotheranostics. 6 (1), 91-102 (2022).
  30. Lei, Z., Zhang, F. Molecular engineering of NIR-II fluorophores for improved biomedical detection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (30), 16294-16308 (2021).
  31. He, S., Song, J., Qu, J., Cheng, Z. Crucial breakthrough of second near-infrared biological window fluorophores: design and synthesis toward multimodal imaging and theranostics. Chemical Society Reviews. 47 (12), 4258-4278 (2018).
  32. Guo, P., et al. Standardized rat coronary ring preparation and real-time recording of dynamic tension changes along vessel diameter. Journal of Visualized Experiments. (184), e64121 (2022).
  33. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/P53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
  34. Ji, A., et al. Acceptor engineering for NIR-II dyes with high photochemical and biomedical performance. Nature Communications. 13 (1), 3815 (2022).
  35. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged Ht22 cells by stimulating Pi3k-Akt-Mapk signaling pathway. Phytomedicine. , (2022).
  36. Jiang, Y., Pu, K. Molecular probes for autofluorescence-free optical imaging. Chemical Reviews. 121 (21), 13086-13131 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены