Una sonda di fluorescenza NIR-II luminosa per l'imaging vascolare e tumorale

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un'operazione di imaging a fluorescenza NIR-II dettagliata e in tempo reale di un topo utilizzando un dispositivo di imaging ottico NIR-II.

Abstract

Come tecnologia di imaging emergente, l'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso II (NIR-II, 1000-1700 nm) ha un potenziale significativo nel campo biomedico, grazie alla sua elevata sensibilità, penetrazione dei tessuti profondi e imaging superiore con risoluzione spaziale e temporale. Tuttavia, il metodo per facilitare l'implementazione dell'imaging a fluorescenza NIR-II per alcuni campi urgentemente necessari, come la scienza medica e la farmacia, ha lasciato perplessi i ricercatori pertinenti. Questo protocollo descrive in dettaglio le applicazioni di costruzione e bioimaging di una sonda molecolare a fluorescenza NIR-II, HLY1, con uno scheletro D-A-D (donatore-accettore-donatore). HLY1 ha mostrato buone proprietà ottiche e biocompatibilità. Inoltre, l'imaging vascolare e tumorale NIR-II nei topi è stato eseguito utilizzando un dispositivo di imaging ottico NIR-II. Sono state acquisite immagini di fluorescenza NIR-II ad alta risoluzione in tempo reale per guidare l'individuazione di tumori e malattie vascolari. Dalla preparazione della sonda all'acquisizione dei dati, la qualità dell'imaging è notevolmente migliorata e viene garantita l'autenticità delle sonde molecolari NIR-II per la registrazione dei dati nell'imaging intravitale.

Introduzione

L'imaging a fluorescenza è lo strumento di imaging molecolare comunemente usato nella ricerca di base ed è anche spesso usato per guidare la resezione chirurgica del tumore nelle cliniche¹. Il principio essenziale dell'imaging a fluorescenza è quello di impiegare una telecamera per ricevere la fluorescenza emessa da un laser dopo l'irradiazione di campioni (tessuti, organi, ecc.) ². Il processo è completato in pochi millisecondi³. Le lunghezze d'onda dell'imaging a fluorescenza possono essere suddivise in ultravioletto (200-400 nm), regione visibile (400-700 nm), vicino infrarosso I (NIR-I, 700-900 nm) e vicino infrarosso II (NIR-II, 1000-1700 nm)^4,5,6. Poiché le molecole endogene come l'emoglobina, la melanina, la deossiemoglobina e la bilirubina nei tessuti biologici hanno un forte assorbimento e un effetto di diffusione sulla luce nelle regioni visibili, la penetrazione e la sensibilità della luce sono notevolmente ridotte e l'imaging a fluorescenza nelle lunghezze d'onda della luce visibile è influenzato negativamente ^7,8,9.

L'imaging a fluorescenza NIR-II ha un basso assorbimento e diffusione dei fotoni, un'elevata velocità di imaging e un elevato contrasto (o sensibilità) ^{dell'immagine10,11}. All'aumentare della lunghezza d'onda della fluorescenza, l'assorbimento e la diffusione della fluorescenza nei tessuti biologici diminuiscono gradualmente e l'autofluorescenza nella regione NIR-II è estremamente bassa¹². Pertanto, la finestra NIR-II aumenta significativamente la profondità di penetrazione dei tessuti e ottiene una risoluzione più elevata e un rapporto segnale-rumore 13,14,15. La finestra NIR-II può essere ulteriormente suddivisa in NIR-IIa (1300-1400 nm) e NIR-lIb (1500-1700 nm) windows¹⁶. Ad oggi, sono stati segnalati diversi materiali NIR-II fondamentali, tra cui nanotubi di carbonio a parete singola di materiale inorganico, nanoparticelle di terre rare, punti quantici e nanoparticelle polimeriche semiconduttrici di materiali organici, coloranti a piccole molecole, materiali luminescenti indotti dall'aggregazione, ecc. 1,17,18,19,20,21,22. I nanomateriali inorganici si accumulano facilmente nel fegato, nella milza, ecc. e hanno una potenziale biotossicità a lungo termine²³. Il fluoroforo organico a piccole molecole ha i vantaggi di metabolismo rapido, bassa tossicità, facile modifica e una struttura chiara, che è la sonda più promettente per uso clinico²⁴.

Il sistema di imaging ottico NIR-II è anche un componente critico del bioimaging a fluorescenza perché può raccogliere efficacemente i segnali di fluorescenza NIR-II dalla sonda NIR-II, rendendo così precise immagini funzionali, anatomiche e molecolari^25,26. Il sistema di imaging NIR-II comprende principalmente telecamere a infrarossi a onde corte, filtri passa-lungo (LP), laser e processori per computer. In vivo L'imaging fluorescente NIR-II è considerato uno degli approcci di imaging più fattibili per chiarire i meccanismi delle malattie e la natura della vita^27,28,29. La tecnologia di imaging NIR-II è stata ampiamente utilizzata in campi biomedici come il rilevamento delle cellule tumorali, l'imaging dinamico, il tracciamento mirato in vivo e la terapia mirata, specialmente nella ricerca oncologica^30,31. Tuttavia, considerando gli elevati requisiti tecnici della tecnologia di imaging NIR-II su sonde e strumenti di imaging, lascia anche perplessi e limita l'uso pratico dei ricercatori in diversi campi. Pertanto, la preparazione delle sonde di imaging NIR-II e le applicazioni dell'imaging NIR-II sono introdotte in dettaglio in questo articolo.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali per gli studi di imaging NIR-II sono stati condotti presso l'Animal Experiment Center dell'Università di Wuhan, che è stato premiato con l'International Association for Experimental Animal Care (AALAC). Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti seguendo le linee guida della China Animal Welfare Commission per la cura e l'uso di animali da esperimento e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Centro sperimentale sugli animali dell'Università di Wuhan.

Per il presente studio sono stati utilizzati topi nudi femmina BALB/c (~20 g) a 6 settimane di età.

1. Preparazione dell'imaging NIR-II

1. Posizionare il cartone nero disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) al centro del supporto. Quindi, posizionare il campione sopra il cartone nero, in modo che il campione si trovi al centro del supporto (uno stadio situato nel dispositivo di imaging).
   NOTA: rispetto al cartone bianco, il cartoncino nero ha meno interferenze di fondo durante l'imaging NIR-II.
2. Selezionare un filtro adatto in base alla lunghezza d'onda della sonda NIR-II. Premere a lungo (>2 s) per controllare l'area della scatola (ad esempio 900 LP) corrispondente al modello di filtro nell'interfaccia dello schermo quando il sistema sposta il filtro nel percorso di imaging ottico.
3. Premere a lungo la piattaforma sull'interfaccia touch screen dell'area di controllo della console carrier in modo che la console carrier si alzi; Premere a lungo la piattaforma verso il basso in modo che le console dell'operatore siano abbassate.
4. Regolare l'altezza della piattaforma su "0 mm" (regolazione dell'altezza) e utilizzare la messa a fuoco automatica per rendere chiara l'immagine NIR-II.

2. Sintesi del colorante NIR-II (HLY1)

1. Pesare le materie prime necessarie per l'esperimento di sintesi. Assicurati che non si deteriorino.
2. Aggiungere il composto 1 (200 mg, 0,18 mmol), PdCl 2(dppf)2 CH 2 Cl 2 (28 mg, 0,04 mmol), N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-diossaborolan-2-il)fenil)naftalene-2-ammina (170 mg, 0,4 mmol) e K ₂ CO₃ (46 mg, 0,34 mmol) alla soluzione di tetraidrofurano (THF) in un matraccio a fondo tondo. Agitare la miscela per 4 ore a 75 °C in atmosfera N₂ (figura 1A).
   NOTA: Per la procedura di sintesi del composto 1 e N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-diossaborolan-2-il)fenil)naftalene-2-ammina, fare riferimento a Li et al²¹. Le strutture chimiche sono mostrate nella Figura 1A.
3. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, estinguere la reazione con acqua distillata (DI) (80 ml) ed estrarre la miscela con DCM (diclorometano)/H₂O (30 ml) (tre volte). Purificare il prodotto grezzo mediante cromatografia su colonna¹⁶ (etere di petrolio:DCM = 10:1) per rendere HLY1 un solido verde (78 mg, resa 30%).
4. Posizionare il colorante HLY1 sotto la protezione dell'azoto in frigorifero per un uso successivo. Questo può essere conservato per un massimo di 6 mesi.

3. Preparazione di nanosonda sospendibile in acqua

1. Pesare HLY1 (1 mg) e materiali di incapsulamento anfipatico, 1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[ammino(polietilenglicole)-2k (DSPE-PEG2k, 10 mg; vedere tabella dei materiali).
2. Preparare HLY1 punti²⁰ utilizzando DSPE-PEG2k come matrice di incapsulamento (metodo di nanoprecipitazione¹²) (Figura 1C). Sciogliere HLY1 in THF (1 mL) e aggiungerlo lentamente in un becher contenente la soluzione acquosa DSPE-PEG2k (9 mL) con sonicazione a 25 °C. Successivamente, rimuovere THF dalla miscela mediante dialisi²⁰.
3. Concentrare centrifugamente la soluzione di cui sopra con ultrafiltrazione 18 (7100 x g per¹⁰ min) e quindi metterla in un frigorifero a 4 °C per un uso futuro. Questo può essere conservato per un massimo di 1 mese.
   NOTA: La soluzione acquosa di nanosonda caricata da DSPE-PEG_2k deve essere conservata a temperatura superiore a 0 °C e utilizzata il prima possibile.

4. Costruzione di topi portatori di tumore

1. Coltura di cellule di carcinoma mammario di topo 4T1 (4T1) nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrate con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS) e l'1% (v/v) di penicillina-streptomicina (vedi tabella dei materiali), e conservate in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ a 37 °C.
2. Per l'esperimento di imaging fluorescente NIR-II, coltura di cellule 4T1 (5 x 10⁷) per 24 ore, digerire con tripsina (1 ml) e lavare due volte con DMEM senza siero (4 ml).
3. Anestetizzare i topi trattando con isoflurano (2%). Confermare un'adeguata anestesia stimolando le dita dei piedi o le piante dei piedi dei topi e osservare se i topi rispondono. Se non c'è risposta, significa che l'anestesia è sufficiente³².
4. Quindi, utilizzando un ago per iniezione di insulina, iniettare la miscela di cellule 4T1 nei topi attraverso iniezione sottocutanea (100 μL).
   Nota: gli studi di imaging NIR-II sono stati eseguiti ~ 2 settimane dopo l'inoculazione, quando il tumore era cresciuto fino a un volume di ~ 100 mm³. Prima dell'imaging tumorale NIR-II, confermare la dimensione del tumore. La dimensione del tumore è stata stimata da un calibro vernier elettronico per il presente studio¹¹.

5. Imaging a fluorescenza NIR-II in vivo

1. Anestetizzare i topi trattandoli con isoflurano (2%) ed eseguire l'imaging NIR-II di tutto il corpo dei topi utilizzando un sistema di imaging ottico NIR-II (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Prestare attenzione al dosaggio dell'anestetico per evitare la morte dei topi. Generalmente, l'anestesia dura 5-10 minuti. Stimola le dita dei piedi o le piante dei piedi dei topi e osserva se i topi rispondono. Se non c'è risposta, significa che l'anestesia è sufficiente.
2. Prendi una soluzione di punti HLY1 (0,8 mg/ml, 200 μL). Iniettare i punti HLY1 per via endovenosa nei topi anestetizzati e, 3 minuti dopo, eseguire l'imaging a fluorescenza NIR-II dei vasi sanguigni di tutto il corpo dei topi utilizzando un sistema di imaging NIR-II. Concentrati ulteriormente sulla testa del topo per raccogliere l'imaging vascolare cerebrale.
   NOTA: Utilizzare guanti sperimentali puliti durante l'imaging, che aiuteranno a ottenere immagini NIR-II pulite.
3. Raccogliere le immagini 5 minuti dopo l'iniezione di punti HLY1 nei topi ed elaborare i dati utilizzando il software ImageJ. I parametri dello strumento del sistema di imaging ottico NIR-II sono 90 mW/cm² (laser 808 nm).
4. Al termine dell'esperimento, eutanasia gli animali seguendo protocolli istituzionalmente approvati.
   NOTA: Per il presente studio, gli animali sono stati eutanizzati esponendoli all'eccesso di isoflurano³².

Risultati

L'intensità fluorescente e la luminosità dei punti HLY1 sensibili all'acqua sono state determinate da uno strumento di imaging NIR-II. L'intensità fluorescente di HLY1 nella miscela 90% f_wTHF/H₂O era cinque volte superiore a quella della soluzione THF, il che indicava una caratteristica AIE prominente di HLY1 (Figura 1B). Inoltre, i punti HLY1 emettevano forti segnali fluorescenti sotto un filtro LP da 1.500 nm, dimostrando che i punti HLY1 possono essere ut...

Discussione

L'imaging fluorescente NIR-I può essere utilizzato in una certa misura per l'imaging tumorale e vascolare, ma a causa della limitata lunghezza d'onda massima di emissione dei fluorofori NIR-I (<900 nm), si traduce in una scarsa penetrazione tissutale e rapporto di fondo del segnale tumorale^33,34. Una risoluzione di imaging scarsa e bassa può causare una deviazione tra l'esito del trattamento di feedback di imaging e l'effettivo effetto terapeutico. Inoltre, la ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous pyridine	Perimed	110-86-1
Anhydrous sodium sulfate	China national medicines Co.,Ltd	SY006376
Black cardboard	Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd	AO00158
Column chromatography	Energy Chemical	E080498
Diphenylphosphine palladium dichloride	Sigma-Aldrich	B2161-1g
DSPE-PEG2000	Ponsure	PS-E1
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	8121587
EGTA	Biofroxx	EZ6789D115
Fetal bovine serum	Gibco	2166090RP
Isoflurane	GLPBIO	GC45487-1
K2CO3	Macklin	P816305-5g
N. N '- dimethylformamide	China national medicines Co.,Ltd	02-12-1968
NIR-II imaging instrument	Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd	16011109
N-sulfenanilide	Enerry chemical	1250030-5g
PdCl2(dppf)2CH2Cl2	TCI	B2064-1g
penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Tetrahydrofuran	China national medicines Co.,Ltd	M005197
Tetratriphenylphosphine palladium	Immochem	1021232-5g
Tetratriphenylphosphine palladium	Sigma-Aldrich	1021232-5g
Tributyltin chloride	Immochem	QH004335
Trimethylchlorosilane	China national medicines Co.,Ltd	40060560