Une sonde de fluorescence NIR-II brillante pour l’imagerie vasculaire et tumorale

Résumé

Le présent protocole décrit une opération détaillée d’imagerie par fluorescence NIR-II en temps réel d’une souris à l’aide d’un dispositif d’imagerie optique NIR-II.

Résumé

En tant que technologie d’imagerie émergente, l’imagerie par fluorescence proche infrarouge II (NIR-II, 1000-1700 nm) présente un potentiel important dans le domaine biomédical, en raison de sa sensibilité élevée, de sa pénétration des tissus profonds et de son imagerie supérieure avec une résolution spatiale et temporelle. Cependant, la méthode visant à faciliter la mise en œuvre de l’imagerie par fluorescence NIR-II pour certains domaines urgents, tels que les sciences médicales et la pharmacie, a intrigué les chercheurs concernés. Ce protocole décrit en détail les applications de construction et de bioimagerie d’une sonde moléculaire de fluorescence NIR-II, HLY1, avec un squelette D-A-D (donneur-accepteur-donneur). HLY1 a montré de bonnes propriétés optiques et biocompatibilité. De plus, l’imagerie vasculaire et tumorale NIR-II chez la souris a été réalisée à l’aide d’un dispositif d’imagerie optique NIR-II. Des images de fluorescence NIR-II haute résolution en temps réel ont été acquises pour guider la détection des tumeurs et des maladies vasculaires. De la préparation de la sonde à l’acquisition des données, la qualité de l’imagerie est grandement améliorée et l’authenticité des sondes moléculaires NIR-II pour l’enregistrement des données en imagerie intravitale est assurée.

Introduction

L’imagerie par fluorescence est l’outil d’imagerie moléculaire couramment utilisé en recherche fondamentale, et est également souvent utilisée pour guider la résection chirurgicale de la tumeur dans les cliniques¹. Le principe essentiel de l’imagerie par fluorescence est d’utiliser une caméra pour recevoir la fluorescence émise par un laser après l’irradiation d’échantillons (tissus, organes, etc.) ². Le processus est terminé en quelques millisecondes³. Les longueurs d’onde d’imagerie de fluorescence peuvent être divisées en ultraviolet (200-400 nm), région visible (400-700 nm), proche infrarouge I (NIR-I, 700-900 nm) et proche infrarouge II (NIR-II, 1000-1700 nm)^4,5,6. Parce que les molécules endogènes telles que l’hémoglobine, la mélanine, la désoxyhémoglobine et la bilirubine dans les tissus biologiques ont une forte absorption et un effet de diffusion sur la lumière dans les régions visibles, la pénétration et la sensibilité de la lumière sont considérablement réduites, et l’imagerie de fluorescence dans les longueurs d’onde de la lumière visible est affectée^{négativement} 7,8,9.

L’imagerie par fluorescence NIR-II présente une faible absorption et diffusion des photons, une vitesse d’imagerie élevée et un contraste (ou une sensibilité) d’image ^élevé10,11. À mesure que la longueur d’onde de fluorescence augmente, l’absorption et la diffusion de la fluorescence dans les tissus biologiques diminuent progressivement, et l’autofluorescence dans la région NIR-II est extrêmement faible¹². Ainsi, la fenêtre NIR-II augmente considérablement la profondeur de pénétration des tissus et obtient une résolution et un rapport signal sur bruit plus élevés^13,14,15. La fenêtre NIR-II peut être subdivisée en fenêtres NIR-IIa (1300-1400 nm) et NIR-lIb (1500-1700 nm)¹⁶. À ce jour, plusieurs matériaux NIR-II importants ont été signalés, notamment des nanotubes de carbone à paroi simple en matériaux inorganiques, des nanoparticules de terres rares, des points quantiques et des nanoparticules de polymères semi-conducteurs de matériaux organiques, des colorants à petites molécules, des matériaux luminescents induits par agrégation, etc. 1,17,18,19,20,21,22. Les nanomatériaux inorganiques s’accumulent facilement dans le foie, la rate, etc., et peuvent être biotoxiques à long terme²³. Le fluorophore organique à petites molécules présente les avantages d’un métabolisme rapide, d’une faible toxicité, d’une modification facile et d’une structure claire, ce qui en fait la sonde la plus prometteuse pour un usage clinique²⁴.

Le système d’imagerie optique NIR-II est également un élément essentiel de la bioimagerie par fluorescence, car il peut collecter efficacement les signaux de fluorescence NIR-II de la sonde NIR-II, produisant ainsi des images fonctionnelles, anatomiques et moléculaires précises^25,26. Le système d’imagerie NIR-II comprend principalement des caméras infrarouges à ondes courtes, des filtres passe-long (LP), des lasers et des processeurs informatiques. In vivo L’imagerie fluorescente NIR-II est considérée comme l’une des approches d’imagerie les plus réalisables pour élucider les mécanismes des maladies et la nature de la vie^27,28,29. La technologie d’imagerie NIR-II a été largement utilisée dans des domaines biomédicaux tels que la détection des cellules cancéreuses, l’imagerie dynamique, le traçage ciblé in vivo et la thérapie ciblée, en particulier dans la recherche en oncologie^30,31. Cependant, compte tenu des exigences techniques élevées de la technologie d’imagerie NIR-II sur les sondes et les instruments d’imagerie, elle laisse également perplexe et restreint l’utilisation pratique des chercheurs dans différents domaines. Par conséquent, la préparation des sondes d’imagerie NIR-II et les applications de l’imagerie NIR-II sont présentées en détail dans cet article.

Protocole

Des expériences sur des animaux pour les études d’imagerie NIR-II ont été menées au Centre d’expérimentation animale de l’Université de Wuhan, qui a reçu l’Association internationale pour les soins aux animaux expérimentaux (AALAC). Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément aux directives de la Commission chinoise du bien-être animal pour le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation et approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre d’expérimentation animale de l’Université de Wuhan.

Des souris nues BALB/c femelles (~20 g) à l’âge de 6 semaines ont été utilisées pour la présente étude.

1. Préparation de l’imagerie NIR-II

1. Placez du carton noir disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) au centre du support. Ensuite, placez l’échantillon sur le carton noir, de sorte que l’échantillon soit au centre du support (une étape située dans le dispositif d’imagerie).
   REMARQUE: Par rapport au carton blanc, le carton noir a moins d’interférences d’arrière-plan lors de l’imagerie NIR-II.
2. Sélectionnez un filtre approprié en fonction de la longueur d’onde de la sonde NIR-II. Appuyez longuement (>2 s) pour contrôler la zone du boîtier (par exemple 900 LP) correspondant au modèle de filtre dans l’interface de l’écran lorsque le système déplace le filtre dans le chemin d’imagerie optique.
3. Appuyez longuement sur la plate-forme sur l’interface de l’écran tactile de la zone de commande de la console de l’opérateur afin que la console de l’opérateur se console; Appuyez longuement sur la plate-forme vers le bas pour que le transporteur se console vers le bas.
4. Ajustez la hauteur de la plate-forme à « 0 mm » (réglage de la hauteur) et utilisez la mise au point automatique pour rendre l’image NIR-II claire.

2. Synthèse du colorant NIR-II (HLY1)

1. Peser les matières premières nécessaires à l’expérience de synthèse. Assurez-vous qu’ils ne se détériorent pas.
2. Ajouter le composé 1 (200 mg, 0,18 mmole), PdCl2(dppf)2CH2Cl2 (28 mg, 0,04 mmole), le N-phényl-N-(4-(4,4,5,5-tétraméthyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)phényl)naphtalène-2-amine (170 mg, 0,4 mmole) et le _K2CO3(46 mg, 0,34 mmole) dans une fiole à fond rond de ₂₅mL. Agiter le mélange pendant 4 h à 75 °C sous atmosphère_N2 (figure 1A).
   NOTE: Pour la procédure de synthèse du composé 1 et du N-phényl-N-(4-(4,4,5,5-tétraméthyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)phényl)naphtalène-2-amine, se référer à Li et al²¹. Les structures chimiques sont illustrées à la figure 1A.
3. Après refroidissement à température ambiante, éteindre la réaction avec de l’eau distillée (DI) (80 mL) et extraire le mélange avec du DCM (dichlorométhane)/H₂O (30 mL) (trois fois). Purifier le produit brut par chromatographie sur colonne¹⁶ (éther de pétrole:DCM = 10:1) pour faire de HLY1 un solide vert (78 mg, rendement de 30%).
4. Placez le colorant HLY1 sous la protection de l’azote dans le réfrigérateur pour une utilisation ultérieure. Celui-ci peut être conservé jusqu’à 6 mois.

3. Préparation d’une nanosonde à suspense d’eau

1. Peser HLY1 (1 mg) et les matériaux d’encapsulation amphipathique, 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[amino(polyéthylèneglycol)-2k (DSPE-PEG2k, 10 mg; voir le tableau des matériaux).
2. Préparer les points²⁰ HLY1 en utilisant DSPE-PEG2k comme matrice d’encapsulation (méthode de nanoprécipitation¹²) (Figure 1C). Dissoudre HLY1 dans du THF (1 mL) et ajouter lentement dans un bécher contenant une solution aqueuse DSPE-PEG2k (9 mL) avec sonication à 25 °C. Par la suite, éliminer le THF du mélange par dialyse²⁰.
3. Concentrer la solution ci-dessus par centrifugation avec l’ultrafiltration 18 (7100 x g pendant¹⁰ min), puis la placer dans un réfrigérateur à 4 °C pour une utilisation ultérieure. Cela peut être stocké jusqu’à 1 mois.
   NOTE: La solution aqueuse de nanosonde chargée par DSPE-PEG_2k doit être stockée au-dessus de 0 °C et utilisée dès que possible.

4. Construction de souris porteuses de tumeurs

1. Culture de cellules cancéreuses du sein de souris 4T1 (4T1) dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, supplémenté avec 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine (voir le tableau des matières), et conserver dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ à 37 °C.
2. Pour l’expérience d’imagerie fluorescente NIR-II, cultiver des cellules 4T1 (5 x 10⁷) pendant 24 h, les digérer avec de la trypsine (1 mL) et laver deux fois avec du DMEM sans sérum (4 mL).
3. Anesthésier les souris en les traitant à l’isoflurane (2%). Confirmez une anesthésie adéquate en stimulant les orteils ou la plante des pieds des souris et observez si les souris réagissent. S’il n’y a pas de réponse, cela signifie que l’anesthésie est suffisante³².
4. Ensuite, à l’aide d’une aiguille d’injection d’insuline, injecter le mélange de cellules 4T1 dans les souris par injection sous-cutanée (100 μL).
   Remarque: Les études d’imagerie NIR-II ont été effectuées ~ 2 semaines après l’inoculation, lorsque la tumeur avait atteint un volume de ~ 100 mm³. Avant l’imagerie tumorale NIR-II, veuillez confirmer la taille de la tumeur. La taille de la tumeur a été estimée par un étrier vernier électronique pour la présente étude¹¹.

5. Imagerie par fluorescence NIR-II in vivo

1. Anesthésier les souris en les traitant à l’isoflurane (2%) et effectuer une imagerie NIR-II de l’ensemble du corps des souris à l’aide d’un système d’imagerie optique NIR-II (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE: Faites attention à la posologie de l’anesthésique pour éviter la mort des souris. Généralement, l’anesthésie dure de 5 à 10 minutes. Stimulez les orteils ou la plante des pieds des souris et observez si les souris réagissent. S’il n’y a pas de réponse, cela signifie que l’anesthésie est suffisante.
2. Prenez une solution de points HLY1 (0,8 mg/mL, 200 μL). Injectez les points HLY1 par voie intraveineuse dans les souris anesthésiées et, 3 minutes plus tard, effectuez une imagerie par fluorescence NIR-II des vaisseaux sanguins de tout le corps des souris à l’aide d’un système d’imagerie NIR-II. Concentrez-vous davantage sur la tête de la souris pour recueillir l’imagerie vasculaire cérébrale.
   REMARQUE: Utilisez des gants expérimentaux propres pendant l’imagerie, ce qui aidera à obtenir des images NIR-II propres.
3. Collectez les images 5 min après l’injection de points HLY1 chez la souris et traitez les données à l’aide du logiciel ImageJ. Les paramètres de l’instrument du système d’imagerie optique NIR-II sont 90 mW/cm² (laser 808 nm).
4. À la fin de l’expérience, euthanasier les animaux en suivant des protocoles approuvés par l’institution.
   REMARQUE : Pour la présente étude, les animaux ont été euthanasiés en les exposant à un excès d’isoflurane³².

Résultats

L’intensité fluorescente et la luminosité des points HLY1 suspensibles dans l’eau ont été déterminées par un instrument d’imagerie NIR-II. L’intensité fluorescente de HLY1 dans le mélange THF/H₂O à 90 % f w était cinq fois supérieure à celle de la solution de THF, ce qui indiquait une caractéristique AIE importante de HLY1 (figure 1B). De plus, les points HLY1 émettaient de forts signaux fluorescents sous un filtre LP de 1 500 nm, ce qui m...

Discussion

L’imagerie fluorescente NIR-I peut être utilisée dans une certaine mesure pour l’imagerie tumorale et vasculaire, mais en raison de la longueur d’onde d’émission maximale limitée des fluorophores NIR-I (<900 nm), elle entraîne une faible pénétration tissulaire et un rapport de fond du signal tumoral^33,34. Une résolution d’imagerie faible et faible peut entraîner un écart entre le résultat du traitement par rétroaction d’imagerie et l’eff...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous pyridine	Perimed	110-86-1
Anhydrous sodium sulfate	China national medicines Co.,Ltd	SY006376
Black cardboard	Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd	AO00158
Column chromatography	Energy Chemical	E080498
Diphenylphosphine palladium dichloride	Sigma-Aldrich	B2161-1g
DSPE-PEG2000	Ponsure	PS-E1
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	8121587
EGTA	Biofroxx	EZ6789D115
Fetal bovine serum	Gibco	2166090RP
Isoflurane	GLPBIO	GC45487-1
K2CO3	Macklin	P816305-5g
N. N '- dimethylformamide	China national medicines Co.,Ltd	02-12-1968
NIR-II imaging instrument	Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd	16011109
N-sulfenanilide	Enerry chemical	1250030-5g
PdCl2(dppf)2CH2Cl2	TCI	B2064-1g
penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Tetrahydrofuran	China national medicines Co.,Ltd	M005197
Tetratriphenylphosphine palladium	Immochem	1021232-5g
Tetratriphenylphosphine palladium	Sigma-Aldrich	1021232-5g
Tributyltin chloride	Immochem	QH004335
Trimethylchlorosilane	China national medicines Co.,Ltd	40060560