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要約

本プロトコルは、NIR-II光学画像化装置を用いたマウスの詳細なリアルタイムNIR-II蛍光画像化動作を記載する。

要約

新しいイメージング技術として、近赤外II(NIR-II、1000-1700 nm)蛍光イメージングは、その高感度、深部組織の浸透、および空間的および時間的解像度による優れたイメージングにより、生物医学分野で大きな可能性を秘めています。しかし、医学や薬学など、緊急に必要な分野でNIR-II蛍光イメージングの実装を容易にする方法は、関連する研究者を困惑させています。このプロトコルでは、D-A-D(ドナー-アクセプター-ドナー)骨格を持つNIR-II蛍光分子プローブHLY1の構築とバイオイメージングアプリケーションについて詳しく説明します。HLY1は良好な光学特性と生体適合性を示した。さらに、マウスにおけるNIR-II血管および腫瘍のイメージングは、NIR-II光学イメージングデバイスを用いて行った。リアルタイムの高解像度NIR-II蛍光画像を取得して、腫瘍や血管疾患の検出をガイドしました。プローブの準備からデータ取得まで、イメージング品質が大幅に向上し、生体内イメージングにおけるデータ記録用のNIR-II分子プローブの信頼性が保証されます。

概要

蛍光イメージングは、基礎研究で一般的に使用される分子イメージングツールであり、クリニックでの外科的腫瘍切除のガイドにもよく使用されます1。蛍光イメージングの本質的な原理は、サンプル(組織、臓器など)の照射後にレーザーによって放出された蛍光を受信するためにカメラを使用することです。2.プロセスは数ミリ秒以内に完了します 3.蛍光イメージング波長は、紫外(200-400 nm)、可視領域(400-700 nm)、近赤外I(NIR-I、700-900 nm)、近赤外II(NIR-II、1000-1700 nm)4,5,6に分けることができます。生体組織内のヘモグロビン、メラニン、デオキシヘモグロビン、ビリルビンなどの内因性分子は、可視領域の光に強い吸収と散乱効果があるため、光の透過と感度が大幅に低下し、可視光波長での蛍光イメージングに悪影響を及ぼします7,8,9。

NIR-II蛍光イメージングは、光子の吸収と散乱が低く、イメージング速度が速く、画像のコントラスト(または感度)が高い10,11。蛍光波長が増加するにつれて、生体組織における蛍光の吸収および散乱は徐々に減少し、NIR-II領域の自己蛍光は極めて低い12。したがって、NIR-IIウィンドウは、組織の浸透深さを大幅に増加させ、より高い解像度と信号対雑音比13,14,15を取得します。NIR-IIウィンドウは、NIR-IIa(1300-1400nm)およびNIR-lIb(1500-1700nm)ウィンドウ16にさらに細分することができる。これまでに、無機材料単層カーボンナノチューブ、希土類ナノ粒子、量子ドット、有機材料半導体ポリマーナノ粒子、低分子色素、凝集誘起発光材料など、いくつかの画期的なNIR-II材料が報告されています。 1,17,18,19,20,21,22。無機ナノ材料は肝臓や脾臓などに蓄積しやすく、長期的な生体毒性の可能性があります23。有機低分子蛍光色素は、代謝が速く、毒性が低く、修飾が容易で、構造が明確であるという利点があり、臨床使用のための最も有望なプローブです24。

NIR-II光学イメージングシステムは、NIR-IIプローブからNIR-II蛍光シグナルを効果的に収集し、正確な機能的、解剖学的、および分子画像をレンダリングできるため、蛍光バイオイメージングの重要なコンポーネントでもあります25,26。NIR-IIイメージングシステムは、主に短波赤外線カメラ、ロングパス(LP)フィルター、レーザー、およびコンピュータープロセッサで構成されています。 生体内NIR-II蛍光イメージングは、疾患のメカニズムと生命の性質を解明するための最も実行可能なイメージングアプローチの1つと考えられています27,28,29。NIR-IIイメージング技術は、癌細胞検出、ダイナミックイメージング、in vivoターゲットトレーシング、標的治療などの生物医学分野で、特に腫瘍学研究で広く使用されています30,31。しかし、イメージングプローブや機器におけるNIR-IIイメージング技術の高い技術的要件を考慮すると、さまざまな分野の研究者の実用化を困惑させ、制限することもできません。そこで、NIR-IIイメージングプローブの作製とNIR-IIイメージングの応用について、本稿で詳しく紹介します。

プロトコル

NIR-IIイメージング研究のための動物実験は、国際実験動物管理協会(AALAC)を授与された武漢大学動物実験センターで実施されました。すべての動物実験は、実験動物の世話と使用に関する中国動物福祉委員会のガイドラインに従って実施され、武漢大学動物実験センターの動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました。

6週齢の雌のBALB/cヌードマウス(~20g)を本研究に用いた。

1. NIR-IIイメージングの準備

  1. 市販の黒い段ボール( 材料表を参照)をキャリアの中央に置きます。次に、サンプルがキャリアの中央(イメージングデバイスに配置されたステージ)になるように、サンプルを黒い段ボールの上に置きます。
    注意: 白い段ボールと比較して、黒い段ボールはNIR-IIイメージング中のバックグラウンド干渉が少なくなります。
  2. NIR-IIプローブの波長に基づいて適切なフィルターを選択してください。長押し(>2秒)を押して、システムがフィルターを光学イメージングパスに移動したときに、画面インターフェイスのフィルターモデルに対応するボックス領域(900 LPなど)を制御します。
  3. キャリアコンソール制御領域のタッチスクリーンインターフェイスで プラットフォーム を長押しして、キャリアコンソールが起動するようにします。プラットフォームを長押しして、キャリアコンソール を 下げます。
  4. プラットフォームの高さを「0mm」(高さ調整)に調整し、自動フォーカスを使用してNIR-II画像を鮮明にします。

2. 近赤外色素(HLY1)の合成

  1. 合成実験に必要な原料を秤量する。それらが劣化しないようにしてください。
  2. 化合物 1 (200 mg, 0.18 ミリモル)、PdCl 2(dppf)2 CH 2 Cl 2 (28 mg, 0.04 ミリモル)、N-フェニル-N-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)ナフタレン-2-アミン (170 mg, 0.4 ミリモル)、および K 2CO3 (46 mg, 0.34 ミリモル) をテトラヒドロフラン (THF) 溶液に 25 mL ナスフラスコに加えます。混合物をN2雰囲気下75°Cで4時間撹拌する(図1A)。
    注:化合物1およびN-フェニル-N-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)ナフタレン-2-アミンの合成手順については、Liら21を参照してください。化学構造を図1Aに示す。
  3. 周囲温度まで冷却した後、蒸留(DI)水(80 mL)で反応を停止し、DCM(ジクロロメタン)/H2O(30 mL)で混合物を抽出します(3回)。粗生成物をカラムクロマトグラフィー16(石油エーテル:DCM=10 :1)で精製し、HLY1を緑色固体(78mg、収率30%)とした。
  4. 後で使用するために、染料HLY1を冷蔵庫内の窒素保護下に置きます。これは最大6ヶ月間保存できます。

3. 水持続性ナノプローブの作製

  1. HLY1(1 mg)および両親媒性封入材料、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2k(DSPE-PEG2k、10 mg; 材料の表を参照)を計量します。
  2. カプセル化マトリックスとしてDSPE-PEG2kを採用してHLY1ドット20 を作製し(ナノ沈降法12)(図1C)。HLY1をTHF(1mL)に溶解し、25°Cで超音波処理しながらDSPE-PEG2k水溶液(9mL)を含むビーカーにゆっくりと加える。 続いて、透析20により混合物からTHFを除去する。
  3. 上記の溶液を限外ろ過18 (7100 x g で10分間)で遠心的に濃縮し、将来の使用のために4°Cの冷蔵庫に入れます。これは最大1ヶ月間保存できます。
    注意: DSPE-PEG2k によってロードされたナノプローブ水溶液は、0°C以上で保存し、できるだけ早く使用する必要があります。

4. 担がんマウスの作製

  1. 4T1マウス乳がん細胞(4T1)をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養し、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)および1%(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシンを添加し( 材料の表を参照)、5%CO2 を含む加湿インキュベーター内で37°Cで維持します。
  2. NIR-II蛍光イメージング実験では、4T1細胞(5 x 107)を24時間培養し、トリプシン(1 mL)で消化し、無血清DMEM(4 mL)で2回洗浄します。
  3. イソフルラン(2%)で処理することによりマウスを麻酔する。マウスの足の指や足の裏を刺激して適切な麻酔を確認し、マウスが反応するかどうかを観察します。反応がない場合は、麻酔が十分であることを意味します32。
  4. 次いで、インスリン注射針を用いて、4T1細胞混合物を皮下注射(100μL)を通してマウスに注入する。
    注:NIR-II画像検査は、接種後~2週間、腫瘍が~100mm3の体積に成長したときに実施されました。NIR-II腫瘍イメージングの前に、腫瘍の大きさを確認してください。腫瘍サイズは、本研究11のために電子ノギスによって推定されました。

5. 生体内 近赤外蛍光イメージング

  1. イソフルラン(2%)で処理してマウスを麻酔し、光学NIR-IIイメージングシステムを使用してマウスの全身のNIR-IIイメージングを実行します( 材料の表を参照)。
    注:マウスの死を避けるために、麻酔薬の投与量に注意してください。一般的に、麻酔は5〜10分間続きます。マウスのつま先や足の裏を刺激し、マウスが反応するかどうかを観察します。反応がない場合は、麻酔で十分であることを意味します。
  2. HLY1ドット(0.8 mg/mL、200 μL)の溶液を服用します。HLY1ドットを麻酔をかけたマウスに静脈内注射し、3分後に、NIR-IIイメージングシステムを用いてマウスの全身の血管のNIR-II蛍光イメージングを行う。マウスの頭にさらに焦点を合わせて、脳血管イメージングを収集します。
    注意: イメージング中は清潔な実験用手袋を使用すると、きれいなNIR-II画像を取得できます。
  3. マウスにHLY1ドットを注入してから5分後に画像を収集し、ImageJソフトウェアを使用してデータを処理します。光学NIR-IIイメージングシステムの機器パラメータは、90mW/cm2 (808nmレーザー)です。
  4. 実験が完了したら、制度的に承認されたプロトコルに従って動物を安楽死させます。.
    注:本研究では、動物を過剰なイソフルラン32にさらすことによって安楽死させました。

結果

水に使用可能なHLY1ドットの蛍光強度と明るさは、NIR-IIイメージング装置によって決定されました。90% fwTHF/H2O混合物中のHLY1の蛍光強度はTHF溶液中の5倍であり、HLY1の顕著なAIE特徴を示した(図1B)。さらに、HLY1ドットは1,500 nm LPフィルター下で強い蛍光シグナルを発し、HLY1ドットがNIR-IIbイメージングに使用できることを示しています(...

ディスカッション

NIR-I蛍光イメージングは、腫瘍および血管イメージングにある程度使用できますが、NIR-I蛍光色素の最大発光波長(<900 nm)が制限されているため、組織浸透性および腫瘍シグナルバックグラウンド比が不十分になります33,34。画像解像度が低く低いと、画像フィードバック治療の結果と実際の治療効果との間に偏差が生じる可能性があります。さらに?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この作業の一部は、NSFC(82273796、82111530209)、中央政府の地方科学技術開発を指導するための特別基金(XZ202202YD0021C、XZ202102YD0033C、XZ202001YD0028C)、湖北省科学技術イノベーション重点プロジェクト(2020BAB058)、中央大学の基礎研究基金、およびチベット自治区科学技術開発のためのCOVID-19予防および管理プログラムからの助成金によって部分的に支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anhydrous pyridinePerimed 110-86-1
Anhydrous sodium sulfateChina national medicines Co.,LtdSY006376
Black cardboardSuzhou Yingrui Optical Technology Co., LtdAO00158
Column chromatographyEnergy ChemicalE080498
Diphenylphosphine palladium dichlorideSigma-AldrichB2161-1g
DSPE-PEG2000PonsurePS-E1
Dulbecco's modified eagle medium Gibco8121587
EGTABiofroxxEZ6789D115
Fetal bovine serumGibco2166090RP
IsofluraneGLPBIOGC45487-1
K2CO3MacklinP816305-5g
N. N '- dimethylformamideChina national medicines Co.,Ltd02-12-1968
NIR-II imaging instrumentSuzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd16011109
N-sulfenanilideEnerry chemical 1250030-5g
PdCl2(dppf)2CH2Cl2TCI B2064-1g
penicillin-streptomycinGibco15140-122
TetrahydrofuranChina national medicines Co.,LtdM005197
Tetratriphenylphosphine palladiumImmochem1021232-5g
Tetratriphenylphosphine palladiumSigma-Aldrich1021232-5g
Tributyltin chlorideImmochemQH004335
TrimethylchlorosilaneChina national medicines Co.,Ltd40060560

参考文献

  1. Liu, Y., et al. Versatile types of inorganic/organic NIR-IIa/IIb fluorophores: from strategic design toward molecular imaging and theranostics. Chemical Reviews. 122 (1), 209-268 (2022).
  2. Zhou, H., et al. Mn-loaded apolactoferrin dots for in vivo MRI and NIR-II cancer imaging. Journal of Materials Chemistry C. 7 (31), 9448-9454 (2019).
  3. Zhang, F., Tang, B. Z. Near-infrared luminescent probes for bioimaging and biosensing. Chemical Science. 12 (10), 3377-3378 (2021).
  4. Yao, C., et al. A bright, renal-clearable NIR-II brush macromolecular probe with long blood circulation time for kidney disease bioimaging. Angewandte Chemie International Edition. 61 (5), 202114273 (2022).
  5. Gao, S., et al. Molecular engineering of near-infrared-II photosensitizers with steric-hindrance effect for image-guided cancer photodynamic therapy. Advanced Functional Materials. 31 (14), 2008356 (2021).
  6. Ding, F., Fan, Y., Sun, Y., Zhang, F. Beyond 1000 nm emission wavelength: recent advances in organic and inorganic emitters for deep-tissue molecular imaging. Advanced Healthcare Materials. 8 (14), 1900260 (2019).
  7. Yang, Y., Zhang, F. Molecular fluorophores for in vivo bioimaging in the second near-infrared window. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (9), 3226-3246 (2022).
  8. Ding, B., et al. Polymethine thiopyrylium fluorophores with absorption beyond 1000 nm for biological imaging in the second near-infrared subwindow. Journal of Medicinal Chemistry. 62 (4), 2049-2059 (2019).
  9. Cheng, X., et al. Novel diketopyrrolopyrrole Nir-Ii fluorophores and Ddr inhibitors for in vivo chemo-photodynamic therapy of osteosarcoma. Chemical Engineering Journal. , 136929 (2022).
  10. Yang, Y., et al. Nir-Ii chemiluminescence molecular sensor for in vivo high-contrast inflammation imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59 (42), 18380-18385 (2020).
  11. Liu, Y., et al. A second near-infrared Ru(Ii) polypyridyl complex for synergistic chemo-photothermal therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (3), 2225-2237 (2022).
  12. Xu, Y., et al. Long wavelength-emissive Ru(Ii) metallacycle-based photosensitizer assisting in vivo bacterial diagnosis and antibacterial treatment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (32), 2209904119 (2022).
  13. Xu, Y., et al. Construction of emissive Ruthenium(II) metallacycle over 1000 nm wavelength for in vivo biomedical applications. Nature Communications. 13 (1), 2009 (2022).
  14. Wang, S., Li, B., Zhang, F. Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging. ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).
  15. Sun, Y., Sun, P., Li, Z., Qu, L., Guo, W. Natural flavylium-inspired far-red to NIR-II dyes and their applications as fluorescent probes for biomedical sensing. Chemical Society Reviews. 51 (16), 7170-7205 (2022).
  16. Shen, H., et al. Rational design of NIR-II AIEgens with ultrahigh quantum yields for photo- and chemiluminescence imaging. Journal of the American Chemical Society. 144 (33), 15391-15402 (2022).
  17. Mu, J., et al. The chemistry of organic contrast agents in the NIR-II window. Angewandte Chemie International Edition. 61 (14), 202114722 (2022).
  18. Lu, S., et al. NIR-II fluorescence/photoacoustic imaging of ovarian cancer and peritoneal metastasis. Nano Research. 15 (10), 9183-9191 (2022).
  19. Liu, Y., et al. Novel Cd-Mof NIR-II fluorophores for gastric ulcer imaging. Chinese Chemical Letters. 32 (10), 3061-3065 (2021).
  20. Lin, J., et al. Novel near-infrared II aggregation-induced emission dots for in vivo bioimaging. Chemical Science. 10 (4), 1219-1226 (2018).
  21. Li, Y., et al. Small-molecule fluorophores for near-infrared IIb imaging and image-guided therapy of vascular diseases. CCS Chemistry. 4 (12), 3735-3750 (2022).
  22. Li, Y., et al. Novel NIR-II organic fluorophores for bioimaging beyond 1550 nm. Chemical Science. 11 (10), 2621-2626 (2020).
  23. Li, Y., et al. Organic NIR-II dyes with ultralong circulation persistence for image-guided delivery and therapy. Journal of Controlled Release. 342, 157-169 (2022).
  24. Li, Y., et al. Self-assembled NIR-II fluorophores with ultralong blood circulation for cancer imaging and image-guided surgery. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (3), 2078-2090 (2022).
  25. Li, Q., et al. Novel small-molecule fluorophores for in vivo NIR-IIa and NIR-IIb imaging. Chemical Communications. 56 (22), 3289-3292 (2020).
  26. Li, J., et al. Recent advances in the development of NIR-II organic emitters for biomedicine. Coordination Chemistry Reviews. 415, 213318 (2020).
  27. Li, J., et al. long-fluorescence-lifetime dyes for deep-near-infrared bioimaging. Journal of the American Chemical Society. 144 (31), 14351-14362 (2022).
  28. Li, C., Chen, G., Zhang, Y., Wu, F., Wang, Q. Advanced fluorescence imaging technology in the near-infrared-II window for biomedical applications. Journal of the American Chemical Society. 142 (35), 14789-14804 (2020).
  29. Li, B., Lin, J., Huang, P., Chen, X. Near-infrared probes for luminescence lifetime imaging. Nanotheranostics. 6 (1), 91-102 (2022).
  30. Lei, Z., Zhang, F. Molecular engineering of NIR-II fluorophores for improved biomedical detection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (30), 16294-16308 (2021).
  31. He, S., Song, J., Qu, J., Cheng, Z. Crucial breakthrough of second near-infrared biological window fluorophores: design and synthesis toward multimodal imaging and theranostics. Chemical Society Reviews. 47 (12), 4258-4278 (2018).
  32. Guo, P., et al. Standardized rat coronary ring preparation and real-time recording of dynamic tension changes along vessel diameter. Journal of Visualized Experiments. (184), e64121 (2022).
  33. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/P53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
  34. Ji, A., et al. Acceptor engineering for NIR-II dyes with high photochemical and biomedical performance. Nature Communications. 13 (1), 3815 (2022).
  35. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged Ht22 cells by stimulating Pi3k-Akt-Mapk signaling pathway. Phytomedicine. , (2022).
  36. Jiang, Y., Pu, K. Molecular probes for autofluorescence-free optical imaging. Chemical Reviews. 121 (21), 13086-13131 (2021).

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