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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O presente protocolo descreve uma operação detalhada de imagem de fluorescência NIR-II em tempo real de um rato usando um dispositivo de imagem óptica NIR-II.

Resumo

Como uma tecnologia de imagem emergente, a imagem de fluorescência no infravermelho próximo II (NIR-II, 1000-1700 nm) tem um potencial significativo no campo biomédico, devido à sua alta sensibilidade, penetração de tecidos profundos e imagem superior com resolução espacial e temporal. No entanto, o método para facilitar a implementação de imagens de fluorescência NIR-II para alguns campos urgentemente necessários, como ciência médica e farmácia, tem intrigado pesquisadores relevantes. Este protocolo descreve em detalhes a construção e as aplicações de bioimagem de uma sonda molecular de fluorescência NIR-II, HLY1, com um esqueleto D-A-D (doador-aceitador-doador). O HLY1 apresentou boas propriedades ópticas e biocompatibilidade. Além disso, a imagem vascular e tumoral NIR-II em camundongos foi realizada usando um dispositivo de imagem óptica NIR-II. Imagens de fluorescência NIR-II de alta resolução em tempo real foram adquiridas para orientar a detecção de tumores e doenças vasculares. Desde a preparação da sonda até a aquisição de dados, a qualidade da imagem é muito melhorada e a autenticidade das sondas moleculares NIR-II para registro de dados em imagens intravitais é garantida.

Introdução

A imagem por fluorescência é a ferramenta de imagem molecular comumente utilizada na pesquisa básica, e também é frequentemente utilizada para orientar a ressecção cirúrgica de tumores em clínicas1. O princípio essencial da imagem de fluorescência é empregar uma câmera para receber a fluorescência emitida por um laser após a irradiação de amostras (tecidos, órgãos, etc.) 2. O processo é concluído dentro de alguns milissegundos3. Os comprimentos de onda de imagem de fluorescência podem ser divididos em ultravioleta (200-400 nm), região visível (400-700 nm), infravermelho próximo I (NIR-I, 700-900 nm) e infravermelho próximo II (NIR-II, 1000-1700 nm)4,5,6. Como as moléculas endógenas como hemoglobina, melanina, desoxihemoglobina e bilirrubina nos tecidos biológicos têm forte absorção e um efeito de dispersão sobre a luz nas regiões visíveis, a penetração e a sensibilidade da luz são bastante reduzidas, e a imagem de fluorescência nos comprimentos de onda da luz visível é afetada negativamente 7,8,9.

A imagem de fluorescência NIR-II tem baixa absorção e dispersão de fótons, alta velocidade de imagem e alto contraste (ou sensibilidade) da imagem10,11. À medida que o comprimento de onda da fluorescência aumenta, a absorção e o espalhamento da fluorescência nos tecidos biológicos diminuem gradualmente, e a autofluorescência na região NIR-II é extremamente baixa12. Assim, a janela NIR-II aumenta significativamente a profundidade de penetração dos tecidos e obtém maior resolução e relação sinal-ruído13,14,15. A janela NIR-II pode ser subdividida nas janelas NIR-IIa (1300-1400 nm) e NIR-lIb (1500-1700 nm)16. Até o momento, vários materiais marcantes do NIR-II foram relatados, incluindo nanotubos de carbono de parede única de material inorgânico, nanopartículas de terras raras, pontos quânticos e nanopartículas de polímero semicondutor de material orgânico, corantes de moléculas pequenas, materiais luminescentes induzidos por agregação, etc. 1,17,18,19,20,21,22. Os nanomateriais inorgânicos são facilmente acumulados no fígado, baço, etc., e têm potencial biotoxicidade a longo prazo23. O fluoróforo orgânico de moléculas pequenas tem as vantagens de metabolismo rápido, baixa toxicidade, fácil modificação e estrutura clara, que é a sonda mais promissora para uso clínico24.

O sistema de imagem óptica NIR-II também é um componente crítico da bioimagem por fluorescência, pois pode coletar de forma eficaz os sinais de fluorescência NIR-II da sonda NIR-II, tornando assim imagens funcionais, anatômicas e moleculares precisas25,26. O sistema de imagem NIR-II compreende principalmente câmeras infravermelhas de ondas curtas, filtros de passagem longa (LP), lasers e processadores de computador. In vivo A imagem fluorescente NIR-II é considerada uma das abordagens de imagem mais viáveis para elucidar os mecanismos das doenças e a natureza da vida27,28,29. A tecnologia de imagem NIR-II tem sido amplamente utilizada em campos biomédicos, como detecção de células cancerígenas, imagens dinâmicas, rastreamento direcionado in vivo e terapia direcionada, especialmente em pesquisas oncológicas30,31. No entanto, considerando os altos requisitos técnicos da tecnologia de imagem NIR-II em sondas e instrumentos de imagem, também confunde e restringe o uso prático de pesquisadores em diferentes campos. Portanto, a preparação de sondas de imagem NIR-II e as aplicações de imagens NIR-II são introduzidas em detalhes neste artigo.

Protocolo

Experimentos em animais para estudos de imagem NIR-II foram conduzidos no Centro de Experimentos Animais da Universidade de Wuhan, que recebeu a Associação Internacional de Cuidados com Animais Experimentais (AALAC). Todos os estudos em animais foram conduzidos seguindo as Diretrizes da Comissão de Bem-Estar Animal da China para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal (IACUC) do Centro Experimental Animal da Universidade de Wuhan.

Camundongos fêmeas BALB/c nus (~20 g) com 6 semanas de idade foram utilizados para o presente estudo.

1. Preparação de imagem NIR-II

  1. Coloque o papelão preto comercialmente disponível (consulte Tabela de Materiais) no centro da transportadora. Em seguida, coloque a amostra em cima do papelão preto, de modo que a amostra esteja no centro da transportadora (um estágio localizado no dispositivo de imagem).
    NOTA: Em comparação com o papelão branco, o papelão preto tem menos interferência de fundo durante a imagem NIR-II.
  2. Selecione um filtro adequado com base no comprimento de onda da sonda NIR-II. Pressione long (>2 s) para controlar a área da caixa (como 900 LP) correspondente ao modelo de filtro na interface da tela quando o sistema mover o filtro para o caminho de imagem óptica.
  3. Plataforma de pressão longa na interface da tela sensível ao toque da área de controle do console da operadora para que a operadora se console; plataforma de pressão longa para baixo para que a operadora consoles para baixo .
  4. Ajuste a altura da plataforma para "0 mm" (ajuste de altura) e use o foco automático para tornar a imagem NIR-II clara.

2. Síntese do corante NIR-II (HLY1)

  1. Pesar as matérias-primas necessárias para o experimento de síntese. Certifique-se de que eles não se deteriorem.
  2. Adicionar o composto 1 (200 mg, 0,18 mmol), PdCl 2(dppf)2 CH 2 Cl 2 (28 mg, 0,04 mmol), N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano-2-il)fenil)naftaleno-2-amina (170 mg, 0,4 mmol) e K 2 CO3 (46 mg, 0,34 mmol) à solução de tetraidrofurano (THF) num balão de fundo redondo de 25 ml. Agitar a mistura durante 4 h a 75 °C sob atmosfera N2 (figura 1A).
    NOTA: Para o procedimento de síntese do composto 1 e N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano-2-il)fenil)naftaleno-2-amina, consulte Li et al21. As estruturas químicas são mostradas na Figura 1A.
  3. Após o resfriamento à temperatura ambiente, extinguir a reação com água destilada (DI) (80 mL) e extrair a mistura com DCM (diclorometano)/H2O (30 mL) (três vezes). Purificar o produto bruto por cromatografia em coluna16 (éter de petróleo:DCM = 10:1) para tornar o HLY1 um sólido verde (78 mg, rendimento de 30%).
  4. Coloque o corante HLY1 sob a proteção de nitrogênio na geladeira para uso posterior. Isso pode ser armazenado por até 6 meses.

3. Preparação de nanossonda suspensível à água

  1. Pesar HLY1 (1 mg) e materiais de encapsulamento anfipático, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenoglicol)-2k (DSPE-PEG2k, 10 mg; ver Tabela de Materiais).
  2. Prepare os pontos20 do HLY1 empregando o DSPE-PEG2k como matriz de encapsulamento (método de nanoprecipitação12) (Figura 1C). Dissolver HLY1 em THF (1 mL) e adicionar lentamente em um copo contendo solução aquosa DSPE-PEG2k (9 mL) com sonicação a 25 °C. Posteriormente, retirar o THF da mistura por diálise20.
  3. Concentrar a solução acima referida centrífugamente com ultrafiltração 18 (7100 x g durante10 min) e, em seguida, colocá-la num frigorífico a 4 °C para utilização futura. Isso pode ser armazenado por até 1 mês.
    NOTA: A solução aquosa de nanossonda carregada pelo DSPE-PEG2k deve ser armazenada acima de 0 °C e utilizada o mais rapidamente possível.

4. Construção de camundongos portadores de tumor

  1. Cultivar células de cancro da mama de ratinhos 4T1 (4T1) no meio Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina (ver Tabela de Materiais), e manter numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 °C.
  2. Para o experimento de imagem fluorescente NIR-II, cultura de células 4T1 (5 x 107) por 24 h, digestão com tripsina (1 mL) e lavagem duas vezes com DMEM livre de soro (4 mL).
  3. Anestesiar os camundongos tratando com isoflurano (2%). Confirme a anestesia adequada estimulando os dedos dos pés ou as solas dos pés dos ratos e observe se os ratos respondem. Se não houver resposta, significa que a anestesia é suficiente32.
  4. Em seguida, usando uma agulha de injeção de insulina, injete a mistura de células 4T1 nos camundongos através de injeção subcutânea (100 μL).
    Nota: Os estudos de imagem do NIR-II foram realizados ~2 semanas após a inoculação, quando o tumor cresceu para um volume de ~100 mm3. Antes da imagem do tumor NIR-II, confirme o tamanho do tumor. O tamanho do tumor foi estimado por um paquímetro vernier eletrônico para o presente estudo11.

5. Imagem de fluorescência NIR-II in vivo

  1. Anestesiar os camundongos tratando com isoflurano (2%) e realizar imagens NIR-II de todo o corpo dos camundongos usando um sistema de imagem óptico NIR-II (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Preste atenção à dosagem de anestésico para evitar a morte de ratos. Geralmente, a anestesia dura de 5 a 10 minutos. Estimule os dedos dos pés ou as solas dos pés dos ratos e observe se os ratos respondem. Se não houver resposta, isso significa que a anestesia é suficiente.
  2. Tome uma solução de pontos HLY1 (0,8 mg/ml, 200 μL). Injete os pontos HLY1 por via intravenosa nos camundongos anestesiados e, 3 minutos depois, realize imagens de fluorescência NIR-II dos vasos sanguíneos de todo o corpo de camundongos usando um sistema de imagem NIR-II. Concentre-se ainda mais na cabeça do rato para coletar imagens vasculares cerebrais.
    NOTA: Use luvas experimentais limpas durante a imagem, o que ajudará a obter imagens NIR-II limpas.
  3. Colete as imagens 5 min após a injeção de pontos HLY1 em camundongos e processe os dados usando o software ImageJ. Os parâmetros do instrumento do sistema óptico de imagem NIR-II são 90 mW/cm2 (laser de 808 nm).
  4. Após a conclusão do experimento, eutanasiar os animais seguindo protocolos institucionalmente aprovados.
    NOTA: Para o presente estudo, os animais foram eutanasiados expondo-os ao excesso deisoflurano 32.

Resultados

A intensidade fluorescente e o brilho dos pontos HLY1 suspensáveis à água foram determinados por um instrumento de imagem NIR-II. A intensidade fluorescente de HLY1 na mistura de 90% fwTHF/H2O foi cinco vezes maior que na solução de THF, o que indicou uma característica AIE proeminente de HLY1 (Figura 1B). Além disso, os pontos HLY1 emitiram fortes sinais fluorescentes sob um filtro LP de 1.500 nm, mostrando que os pontos HLY1 podem ser usados para image...

Discussão

A imagem fluorescente NIR-I pode ser usada até certo ponto para imagens tumorais e vasculares, mas devido ao comprimento de onda máximo limitado de emissão de fluoróforos NIR-I (<900 nm), resulta em baixa penetração tecidual e razão de fundo de sinal tumoral33,34. A baixa e baixa resolução de imagem pode causar um desvio entre o resultado do tratamento de feedback de imagem e o efeito terapêutico real. Além disso, a maioria dos fluoróforos NIR-I tem b...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado por doações da NSFC (82273796, 82111530209), Fundos Especiais para Orientar o Desenvolvimento da Ciência e Tecnologia Local do Governo Central (XZ202202YD0021C, XZ202102YD0033C, XZ202001YD0028C), Projeto Chave de Inovação Científica e Técnica da Província de Hubei (2020BAB058), os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais e os Programas de Prevenção e Controle COVID-19 da Região Autônoma do Tibete para o Desenvolvimento da Ciência e Tecnologia.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Anhydrous pyridinePerimed 110-86-1
Anhydrous sodium sulfateChina national medicines Co.,LtdSY006376
Black cardboardSuzhou Yingrui Optical Technology Co., LtdAO00158
Column chromatographyEnergy ChemicalE080498
Diphenylphosphine palladium dichlorideSigma-AldrichB2161-1g
DSPE-PEG2000PonsurePS-E1
Dulbecco's modified eagle medium Gibco8121587
EGTABiofroxxEZ6789D115
Fetal bovine serumGibco2166090RP
IsofluraneGLPBIOGC45487-1
K2CO3MacklinP816305-5g
N. N '- dimethylformamideChina national medicines Co.,Ltd02-12-1968
NIR-II imaging instrumentSuzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd16011109
N-sulfenanilideEnerry chemical 1250030-5g
PdCl2(dppf)2CH2Cl2TCI B2064-1g
penicillin-streptomycinGibco15140-122
TetrahydrofuranChina national medicines Co.,LtdM005197
Tetratriphenylphosphine palladiumImmochem1021232-5g
Tetratriphenylphosphine palladiumSigma-Aldrich1021232-5g
Tributyltin chlorideImmochemQH004335
TrimethylchlorosilaneChina national medicines Co.,Ltd40060560

Referências

  1. Liu, Y., et al. Versatile types of inorganic/organic NIR-IIa/IIb fluorophores: from strategic design toward molecular imaging and theranostics. Chemical Reviews. 122 (1), 209-268 (2022).
  2. Zhou, H., et al. Mn-loaded apolactoferrin dots for in vivo MRI and NIR-II cancer imaging. Journal of Materials Chemistry C. 7 (31), 9448-9454 (2019).
  3. Zhang, F., Tang, B. Z. Near-infrared luminescent probes for bioimaging and biosensing. Chemical Science. 12 (10), 3377-3378 (2021).
  4. Yao, C., et al. A bright, renal-clearable NIR-II brush macromolecular probe with long blood circulation time for kidney disease bioimaging. Angewandte Chemie International Edition. 61 (5), 202114273 (2022).
  5. Gao, S., et al. Molecular engineering of near-infrared-II photosensitizers with steric-hindrance effect for image-guided cancer photodynamic therapy. Advanced Functional Materials. 31 (14), 2008356 (2021).
  6. Ding, F., Fan, Y., Sun, Y., Zhang, F. Beyond 1000 nm emission wavelength: recent advances in organic and inorganic emitters for deep-tissue molecular imaging. Advanced Healthcare Materials. 8 (14), 1900260 (2019).
  7. Yang, Y., Zhang, F. Molecular fluorophores for in vivo bioimaging in the second near-infrared window. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (9), 3226-3246 (2022).
  8. Ding, B., et al. Polymethine thiopyrylium fluorophores with absorption beyond 1000 nm for biological imaging in the second near-infrared subwindow. Journal of Medicinal Chemistry. 62 (4), 2049-2059 (2019).
  9. Cheng, X., et al. Novel diketopyrrolopyrrole Nir-Ii fluorophores and Ddr inhibitors for in vivo chemo-photodynamic therapy of osteosarcoma. Chemical Engineering Journal. , 136929 (2022).
  10. Yang, Y., et al. Nir-Ii chemiluminescence molecular sensor for in vivo high-contrast inflammation imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59 (42), 18380-18385 (2020).
  11. Liu, Y., et al. A second near-infrared Ru(Ii) polypyridyl complex for synergistic chemo-photothermal therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (3), 2225-2237 (2022).
  12. Xu, Y., et al. Long wavelength-emissive Ru(Ii) metallacycle-based photosensitizer assisting in vivo bacterial diagnosis and antibacterial treatment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (32), 2209904119 (2022).
  13. Xu, Y., et al. Construction of emissive Ruthenium(II) metallacycle over 1000 nm wavelength for in vivo biomedical applications. Nature Communications. 13 (1), 2009 (2022).
  14. Wang, S., Li, B., Zhang, F. Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging. ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).
  15. Sun, Y., Sun, P., Li, Z., Qu, L., Guo, W. Natural flavylium-inspired far-red to NIR-II dyes and their applications as fluorescent probes for biomedical sensing. Chemical Society Reviews. 51 (16), 7170-7205 (2022).
  16. Shen, H., et al. Rational design of NIR-II AIEgens with ultrahigh quantum yields for photo- and chemiluminescence imaging. Journal of the American Chemical Society. 144 (33), 15391-15402 (2022).
  17. Mu, J., et al. The chemistry of organic contrast agents in the NIR-II window. Angewandte Chemie International Edition. 61 (14), 202114722 (2022).
  18. Lu, S., et al. NIR-II fluorescence/photoacoustic imaging of ovarian cancer and peritoneal metastasis. Nano Research. 15 (10), 9183-9191 (2022).
  19. Liu, Y., et al. Novel Cd-Mof NIR-II fluorophores for gastric ulcer imaging. Chinese Chemical Letters. 32 (10), 3061-3065 (2021).
  20. Lin, J., et al. Novel near-infrared II aggregation-induced emission dots for in vivo bioimaging. Chemical Science. 10 (4), 1219-1226 (2018).
  21. Li, Y., et al. Small-molecule fluorophores for near-infrared IIb imaging and image-guided therapy of vascular diseases. CCS Chemistry. 4 (12), 3735-3750 (2022).
  22. Li, Y., et al. Novel NIR-II organic fluorophores for bioimaging beyond 1550 nm. Chemical Science. 11 (10), 2621-2626 (2020).
  23. Li, Y., et al. Organic NIR-II dyes with ultralong circulation persistence for image-guided delivery and therapy. Journal of Controlled Release. 342, 157-169 (2022).
  24. Li, Y., et al. Self-assembled NIR-II fluorophores with ultralong blood circulation for cancer imaging and image-guided surgery. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (3), 2078-2090 (2022).
  25. Li, Q., et al. Novel small-molecule fluorophores for in vivo NIR-IIa and NIR-IIb imaging. Chemical Communications. 56 (22), 3289-3292 (2020).
  26. Li, J., et al. Recent advances in the development of NIR-II organic emitters for biomedicine. Coordination Chemistry Reviews. 415, 213318 (2020).
  27. Li, J., et al. long-fluorescence-lifetime dyes for deep-near-infrared bioimaging. Journal of the American Chemical Society. 144 (31), 14351-14362 (2022).
  28. Li, C., Chen, G., Zhang, Y., Wu, F., Wang, Q. Advanced fluorescence imaging technology in the near-infrared-II window for biomedical applications. Journal of the American Chemical Society. 142 (35), 14789-14804 (2020).
  29. Li, B., Lin, J., Huang, P., Chen, X. Near-infrared probes for luminescence lifetime imaging. Nanotheranostics. 6 (1), 91-102 (2022).
  30. Lei, Z., Zhang, F. Molecular engineering of NIR-II fluorophores for improved biomedical detection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (30), 16294-16308 (2021).
  31. He, S., Song, J., Qu, J., Cheng, Z. Crucial breakthrough of second near-infrared biological window fluorophores: design and synthesis toward multimodal imaging and theranostics. Chemical Society Reviews. 47 (12), 4258-4278 (2018).
  32. Guo, P., et al. Standardized rat coronary ring preparation and real-time recording of dynamic tension changes along vessel diameter. Journal of Visualized Experiments. (184), e64121 (2022).
  33. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/P53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
  34. Ji, A., et al. Acceptor engineering for NIR-II dyes with high photochemical and biomedical performance. Nature Communications. 13 (1), 3815 (2022).
  35. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged Ht22 cells by stimulating Pi3k-Akt-Mapk signaling pathway. Phytomedicine. , (2022).
  36. Jiang, Y., Pu, K. Molecular probes for autofluorescence-free optical imaging. Chemical Reviews. 121 (21), 13086-13131 (2021).

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