Eine helle NIR-II-Fluoreszenzsonde für die Gefäß- und Tumorbildgebung

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine detaillierte Echtzeit-NIR-II-Fluoreszenz-Bildgebungsoperation einer Maus unter Verwendung eines NIR-II-optischen Bildgebungsgeräts.

Zusammenfassung

Als aufstrebende Bildgebungstechnologie hat die Nahinfrarot-II-FLUORESZENZBILDGEBUNG (NIR-II, 1000-1700 nm) aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit, ihrer tiefen Gewebedurchdringung und ihrer überlegenen Bildgebung mit räumlicher und zeitlicher Auflösung ein erhebliches Potenzial im biomedizinischen Bereich. Die Methode zur Erleichterung der Implementierung der NIR-II-Fluoreszenzbildgebung für einige dringend benötigte Bereiche wie Medizin und Pharmazie hat jedoch relevante Forscher verwirrt. Dieses Protokoll beschreibt detailliert den Aufbau und die Bioimaging-Anwendungen einer molekularen NIR-II-Fluoreszenzsonde, HLY1, mit einem D-A-D-Skelett (Donor-Akzeptor-Donor). HLY1 zeigte gute optische Eigenschaften und Biokompatibilität. Darüber hinaus wurde die NIR-II-Gefäß- und Tumorbildgebung bei Mäusen mit einem NIR-II-Optik-Bildgebungsgerät durchgeführt. Es wurden hochauflösende NIR-II-Fluoreszenzbilder in Echtzeit aufgenommen, um die Erkennung von Tumoren und Gefäßerkrankungen zu steuern. Von der Sondenvorbereitung bis zur Datenerfassung wird die Bildqualität erheblich verbessert und die Authentizität der molekularen NIR-II-Sonden für die Datenaufzeichnung in der intravitalen Bildgebung sichergestellt.

Einleitung

Die Fluoreszenzbildgebung ist das am häufigsten verwendete molekulare Bildgebungswerkzeug in der Grundlagenforschung und wird auch häufig zur Steuerung der chirurgischen Tumorresektion in Kliniken^{eingesetzt 1}. Das wesentliche Prinzip der Fluoreszenzbildgebung besteht darin, eine Kamera zu verwenden, um die von einem Laser emittierte Fluoreszenz nach der Bestrahlung von Proben (Gewebe, Organe usw.) zu empfangen. ². Der Vorgang ist innerhalb weniger Millisekunden abgeschlossen³. Die Wellenlängen der Fluoreszenzbildgebung können in ultraviolette (200-400 nm), sichtbare Bereiche (400-700 nm), Nahinfrarot I (NIR-I, 700-900 nm) und Nahinfrarot II (NIR-II, 1000-1700 nm) unterteilt ^werden4,5,6. Da die endogenen Moleküle wie Hämoglobin, Melanin, Desoxyhämoglobin und Bilirubin in biologischen Geweben eine starke Absorption und einen Streueffekt auf das Licht in sichtbaren Bereichen haben, werden das Eindringen und die Empfindlichkeit des Lichts stark reduziert, und die Fluoreszenzbildgebung in Wellenlängen des sichtbaren Lichts wird nachteilig beeinflusst ^7,8,9.

Die NIR-II-Fluoreszenzbildgebung weist eine geringe Photonenabsorption und -streuung, eine hohe Abbildungsgeschwindigkeit und einen hohen Bildkontrast (oder eine hohe Empfindlichkeit) ^auf10,11. Mit zunehmender Fluoreszenzwellenlänge nimmt die Absorption und Streuung von Fluoreszenz in biologischen Geweben allmählich ab, und die Autofluoreszenz in der NIR-II-Region ist extrem niedrig¹². Somit erhöht das NIR-II-Fenster die Eindringtiefe von Geweben signifikant und erhält eine höhere Auflösung und ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis^13,14,15. Das NIR-II-Fenster kann weiter unterteilt werden in die Fenster NIR-IIa (1300-1400 nm) und NIR-lIb (1500-1700 nm)¹⁶. Bisher wurden mehrere Meilensteine von NIR-II-Materialien berichtet, darunter einwandige Kohlenstoffnanoröhren aus anorganischem Material, Seltenerd-Nanopartikel, Quantenpunkte und Halbleiterpolymer-Nanopartikel aus organischem Material, niedermolekulare Farbstoffe, aggregationsinduzierte Lumineszenzmaterialien usw. 1,17,18,19,20,21,22. Anorganische Nanomaterialien reichern sich leicht in Leber, Milz usw. an und haben eine potenzielle langfristige Biotoxizität²³. Organisches niedermolekulares Fluorophor hat die Vorteile eines schnellen Stoffwechsels, einer geringen Toxizität, einer einfachen Modifikation und einer klaren Struktur, die die vielversprechendste Sonde für den klinischen Einsatz ist²⁴.

Das optische Bildgebungssystem NIR-II ist auch eine wichtige Komponente der Fluoreszenz-Biobildgebung, da es NIR-II-Fluoreszenzsignale von der NIR-II-Sonde effizient erfassen und so präzise funktionelle, anatomische und molekulare Bilder liefern^{kann 25,26}. Das NIR-II-Bildgebungssystem besteht hauptsächlich aus Kurzwellen-Infrarotkameras, Langpassfiltern, Lasern und Computerprozessoren. Im lebenden Organismus Die NIR-II-Fluoreszenzbildgebung gilt als einer der praktikabelsten bildgebenden Ansätze zur Aufklärung der Mechanismen von Krankheiten und der Natur des Lebens^27,28,29. Die NIR-II-Bildgebungstechnologie ist in biomedizinischen Bereichen wie der Erkennung von Krebszellen, der dynamischen Bildgebung, der gezielten In-vivo-Verfolgung und der gezielten Therapie, insbesondere in der onkologischen Forschung, weit verbreitet^30,31. Angesichts der hohen technischen Anforderungen der NIR-II-Bildgebungstechnologie an bildgebende Sonden und Instrumente verwirrt und schränkt sie jedoch auch den praktischen Einsatz von Forschern in verschiedenen Bereichen ein. Daher werden in diesem Artikel die Herstellung von NIR-II-Bildgebungssonden und die Anwendungen der NIR-II-Bildgebung ausführlich vorgestellt.

Protokoll

Tierversuche für NIR-II-Bildgebungsstudien wurden am Tierversuchszentrum der Universität Wuhan durchgeführt, das mit der International Association for Experimental Animal Care (AALAC) ausgezeichnet wurde. Alle Tierstudien wurden gemäß den Richtlinien der China Animal Welfare Commission für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee (IACUC) des Animal Experimental Center der Universität Wuhan genehmigt.

Für die vorliegende Studie wurden weibliche BALB/c-Nacktmäuse (~20 g) im Alter von 6 Wochen verwendet.

1. NIR-II-Bildgebungsvorbereitung

1. Legen Sie handelsüblichen schwarzen Karton (siehe Materialtabelle) in die Mitte des Trägers. Legen Sie dann die Probe auf den schwarzen Karton, so dass sich die Probe in der Mitte des Trägers befindet (eine Stufe, die sich im Bildgebungsgerät befindet).
   HINWEIS: Im Vergleich zu weißem Karton weist schwarzer Karton während der NIR-II-Bildgebung weniger Hintergrundinterferenzen auf.
2. Wählen Sie einen geeigneten Filter basierend auf der Wellenlänge der NIR-II-Sonde. Drücken Sie lange (>2 s), um den Boxbereich (z. B. 900 LP) entsprechend dem Filtermodell in der Bildschirmoberfläche zu steuern, wenn das System den Filter in den optischen Abbildungspfad bewegt.
3. Drücken Sie die Plattform lange auf die Touchscreen-Oberfläche des Bedienbereichs der Trägerkonsole, so dass die Trägerkonsole nach oben gerichtet ist. Drücken Sie die Plattform lange nach unten, damit sich der Träger nach unten konsoliert.
4. Stellen Sie die Plattformhöhe auf "0 mm" (Höhenverstellung) ein und verwenden Sie die automatische Fokussierung, um das NIR-II-Bild klar zu machen.

2. Synthese des NIR-II-Farbstoffs (HLY1)

1. Wiegen Sie die für das Syntheseexperiment benötigten Rohstoffe. Stellen Sie sicher, dass sie sich nicht verschlechtern.
2. Verbindung 1 (200 mg, 0,18 mmol), PdCl 2(dppf)2_CH2Cl2 (28 mg, 0,04 mmol), N-Phenyl-N-(4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)phenyl)naphthalin-2-amin (170 mg, 0,4 mmol) und K ₂ CO₃ (46 mg, 0,34 mmol) zu Tetrahydrofuran (THF) -Lösung in einen 25 ml Rundkolben geben. Das Gemisch wird 4 h lang bei 75 °C unter_{N2-Atmosphäre} gerührt (Abbildung 1A).
   ANMERKUNG: Für das Syntheseverfahren von Verbindung 1 und N-Phenyl-N-(4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)phenyl)naphthalin-2-amin siehe Li et al.²¹. Die chemischen Strukturen sind in Abbildung 1A dargestellt.
3. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur wird die Reaktion mit destilliertem (DI) Wasser (80 ml) abgeschreckt und das Gemisch mit DCM (Dichlormethan)/H₂O (30 ml) (dreimal) extrahiert. Das Rohprodukt wird durch Säulenchromatographie 16 (Petrolether:DCM =¹⁰ :1) gereinigt, um HLY1 zu einem grünen Feststoff (78 mg, 30 % Ausbeute) zu machen.
4. Legen Sie den Farbstoff HLY1 zur späteren Verwendung unter den Schutz von Stickstoff in den Kühlschrank. Diese kann bis zu 6 Monate gelagert werden.

3. Herstellung einer wasserabhängigen Nanosonde

1. Wiegen Sie HLY1 (1 mg) und amphipathische Verkapselungsmaterialien, 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino(polyethylenglykol)-2k (DSPE-PEG2k, 10 mg; siehe Materialtabelle).
2. Bereiten Sie HLY1-Punkte²⁰ vor, indem Sie DSPE-PEG2k als Verkapselungsmatrix verwenden (Nanopräzipitationsmethode¹²) (Abbildung 1C). HLY1 wird in THF (1 ml) gelöst und langsam in ein Becherglas gegeben, das die wässrige Lösung DSPE-PEG2k (9 ml) mit Beschallung bei 25 °C enthält. Anschließend wird THF durch Dialyse²⁰ aus dem Gemisch entfernt.
3. Konzentrieren Sie die obige Lösung zentrifugal mit Ultrafiltration 18 (7100 x g für¹⁰ min) und stellen Sie sie dann zur zukünftigen Verwendung in einen Kühlschrank bei 4 °C. Diese kann bis zu 1 Monat gelagert werden.
   HINWEIS: Die mit DSPE-PEG_2k beladene wässrige Nanosondenlösung sollte über 0 °C gelagert und so schnell wie möglich verwendet werden.

4. Konstruktion tumortragender Mäuse

1. Kultivieren Sie 4T1-Brustkrebszellen der Maus (4T1) in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin (siehe Materialtabelle) und halten Sie sie in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C.
2. Für das NIR-II-Fluoreszenzbildgebungsexperiment werden 4T1-Zellen (5 x 10⁷) 24 h lang kultiviert, mit Trypsin (1 ml) verdaut und zweimal mit serumfreiem DMEM (4 ml) gewaschen.
3. Betäuben Sie die Mäuse durch Behandlung mit Isofluran (2%). Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie, indem Sie die Zehen oder Fußsohlen der Mäuse stimulieren, und beobachten Sie, ob die Mäuse reagieren. Wenn es keine Reaktion gibt, bedeutet dies, dass die Anästhesie ausreichend ist³².
4. Dann injizieren Sie mit einer Insulininjektionsnadel die 4T1-Zellmischung durch subkutane Injektion (100 μl) in die Mäuse.
   HINWEIS: NIR-II-Bildgebungsstudien wurden ~2 Wochen nach der Inokulation durchgeführt, als der Tumor auf ein Volumen von ~100 mm³ angewachsen war. Bitte bestätigen Sie vor der NIR-II-Tumorbildgebung die Tumorgröße. Die Tumorgröße wurde für die vorliegende Studie mit einem elektronischen Messschieber geschätzt¹¹.

5. In-vivo-NIR-II-Fluoreszenzbildgebung

1. Anästhesieren Sie die Mäuse durch Behandlung mit Isofluran (2%) und führen Sie eine NIR-II-Bildgebung des gesamten Körpers der Mäuse mit einem optischen NIR-II-Bildgebungssystem durch (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Achten Sie auf die Dosierung des Anästhetikums, um den Tod von Mäusen zu vermeiden. Im Allgemeinen dauert die Anästhesie 5-10 Minuten. Stimulieren Sie die Zehen oder Fußsohlen der Mäuse und beobachten Sie, ob die Mäuse reagieren. Wenn es keine Reaktion gibt, bedeutet dies, dass die Anästhesie ausreichend ist.
2. Nehmen Sie eine Lösung von HLY1-Punkten (0,8 mg/ml, 200 μl). Injizieren Sie die HLY1-Punkte intravenös in die anästhesierten Mäuse und führen Sie 3 Minuten später eine NIR-II-Fluoreszenzbildgebung der Blutgefäße des gesamten Körpers von Mäusen mit einem NIR-II-Bildgebungssystem durch. Konzentrieren Sie sich weiter auf den Kopf der Maus, um die Gefäßbildgebung des Gehirns zu erfassen.
   HINWEIS: Verwenden Sie während der Bildgebung saubere experimentelle Handschuhe, um saubere NIR-II-Bilder zu erhalten.
3. Sammeln Sie die Bilder 5 Minuten nach der Injektion von HLY1-Punkten in Mäuse und verarbeiten Sie die Daten mit der ImageJ-Software. Die Geräteparameter des optischen NIR-II-Bildgebungssystems liegen bei 90 mW/^cm2 (808 nm Laser).
4. Nach Abschluss des Experiments werden die Tiere nach institutionell genehmigten Protokollen eingeschläfert.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden die Tiere eingeschläfert, indem sie überschüssigem Isofluran³² ausgesetzt wurden.

Ergebnisse

Die Fluoreszenzintensität und Helligkeit von wasserabhängigen HLY1-Punkten wurde mit einem NIR-II-Bildgebungsgerät bestimmt. Die Fluoreszenzintensität von HLY1 in der 90% _fwTHF/_H2O-Mischungwar fünfmal so hoch wie in der THF-Lösung, was auf ein markantes AIE-Merkmal von HLY1 hindeutete (Abbildung 1B). Darüber hinaus emittierten HLY1-Punkte starke Fluoreszenzsignale unter einem 1.500-nm-LP-Filter, was zeigt, dass HLY1-Punkte für die NIR-IIb-Bildgebung ver...

Diskussion

Die NIR-I-Fluoreszenzbildgebung kann bis zu einem gewissen Grad für die Tumor- und Gefäßbildgebung verwendet werden, führt jedoch aufgrund der begrenzten maximalen Emissionswellenlänge von NIR-I-Fluorophoren (<900 nm) zu einer schlechten Gewebepenetration und einem Tumorsignalhintergrundverhältnis^{von 33,34}. Eine schlechte und niedrige Bildgebungsauflösung kann zu einer Abweichung zwischen dem Ergebnis der bildgebenden Feedbackbehandlung und dem tatsächlic...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous pyridine	Perimed	110-86-1
Anhydrous sodium sulfate	China national medicines Co.,Ltd	SY006376
Black cardboard	Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd	AO00158
Column chromatography	Energy Chemical	E080498
Diphenylphosphine palladium dichloride	Sigma-Aldrich	B2161-1g
DSPE-PEG2000	Ponsure	PS-E1
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	8121587
EGTA	Biofroxx	EZ6789D115
Fetal bovine serum	Gibco	2166090RP
Isoflurane	GLPBIO	GC45487-1
K2CO3	Macklin	P816305-5g
N. N '- dimethylformamide	China national medicines Co.,Ltd	02-12-1968
NIR-II imaging instrument	Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd	16011109
N-sulfenanilide	Enerry chemical	1250030-5g
PdCl2(dppf)2CH2Cl2	TCI	B2064-1g
penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Tetrahydrofuran	China national medicines Co.,Ltd	M005197
Tetratriphenylphosphine palladium	Immochem	1021232-5g
Tetratriphenylphosphine palladium	Sigma-Aldrich	1021232-5g
Tributyltin chloride	Immochem	QH004335
Trimethylchlorosilane	China national medicines Co.,Ltd	40060560