Análisis de calcificación vascular mediada por vesícula extracelular utilizando modelos in vitro e in vivo

Resumen

Este trabajo presenta la metodología para obtener y evaluar la calcificación vascular mediante el aislamiento de aortas murinas seguido de la extracción de vesículas extracelulares calcificadas para observar el potencial de mineralización.

Resumen

La enfermedad cardiovascular es la principal causa de muerte en el mundo, y la calcificación vascular es el predictor más significativo de eventos cardiovasculares; sin embargo, actualmente no hay tratamiento u opciones terapéuticas para la calcificación vascular. La calcificación comienza dentro de vesículas extracelulares especializadas (EV), que sirven como focos de nucleación al agregar iones de calcio y fosfato. Este protocolo describe métodos para obtener y evaluar la calcificación en aortas murinas y analizar las EV extraídas asociadas. Primero, se realiza una disección macroscópica del ratón para recolectar cualquier órgano relevante, como los riñones, el hígado y los pulmones. Luego, la aorta murina se aísla y se extirpa desde la raíz aórtica hasta la arteria femoral. Dos o tres aortas se agrupan e incuban en una solución digestiva antes de someterse a una ultracentrifugación para aislar los EV de interés. A continuación, el potencial de mineralización de los EV se determina mediante la incubación en una solución con alto contenido de fosfato y la medición de la absorbancia de la luz a una longitud de onda de 340 nm. Finalmente, se utilizan hidrogeles de colágeno para observar la formación y maduración de minerales calcificados producidos por los EV in vitro.

Introducción

La calcificación es el predictor más significativo de mortalidad y morbilidad por enfermedad cardiovascular¹. La calcificación altera la mecánica de la pared arterial debido a la acumulación de minerales de calcio y fosfato². En la aterosclerosis, la calcificación puede exacerbar el estrés local y provocar la ruptura de la placa, que es la principal causa de ataques cardíacos. La calcificación medial, a menudo resultante de la enfermedad renal crónica, está más extendida y conduce a un endurecimiento arterial significativo, disfunción y sobrecarga cardíaca ^2,3. Actualmente, no existen opciones terapéuticas para el tratamiento o la prevención de la calcificación vascular.

Las células del músculo liso vascular (VSMC) adoptan un fenotipo similar a un osteoblasto y liberan vesículas extracelulares calcificantes (EV) que nuclean minerales nacientes, impulsando así la calcificación ^4,5,6. Este proceso se asemeja a la mineralización fisiológica de los osteoblastos en el hueso⁷. Aunque el punto final de mineralización es similar en la pared vascular y la matriz ósea, los mecanismos por los cuales se originan los EV calcificantes difieren en los dos tejidos⁸. Hay muchos tipos de modelos que se utilizan para estudiar la calcificación vascular. In vitro, los modelos de cultivo celular imitan la transición osteogénica de VSMCs y la posterior formación de minerales con medios especializados.

Cuando se estudia la calcificación in vivo, el modelo utilizado depende del tipo de calcificación que se esté estudiando. Los modelos de ratón hiperlipidémicos se utilizan a menudo para estudiar la calcificación aterosclerótica, que parece más focal dentro de las placas ricas en lípidos⁹. Por el contrario, la calcificación medial está más extendida en toda la vasculatura y a menudo se estudia utilizando modelos de enfermedad renal crónica que emplean un régimen de dieta rica en adenina para inducir insuficiencia renal o técnicas quirúrgicas para extirpar porciones significativas de los riñones^10,11. Los modelos agresivos de calcificación vascular han utilizado una combinación de modelos de hiperlipidémica y enfermedad renal crónica¹². Este protocolo proporciona un método para evaluar la calcificación vascular en aortas murinas para la calcificación medial y aterosclerótica, extraer EV de la pared aórtica y observar el potencial de mineralización en las EV obtenidas de modelos de cultivo celular in vitro. Los estudios futuros pueden utilizar estos procedimientos en análisis mecanicistas de la calcificación vascular y para evaluar posibles intervenciones terapéuticas.

Protocolo

El trabajo in vivo fue aprobado y supervisado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Internacional de Florida y se ajustó a las pautas actuales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Para este protocolo, el procedimiento no difiere dependiendo de la cepa, el peso, la edad y el sexo del ratón. El tipo de calcificación que se está estudiando, las dietas y los tratamientos pueden alterar la duración del estudio y el peso del ratón utilizado y pueden depender de una cepa específica y el sexo del ratón utilizado en el estudio. Para este protocolo, se utilizaron ratones machos y hembras C57BL / 6J, y se les alimentó con una dieta de calcificación. Los ratones fueron sacrificados entre las 20 semanas y las 24 semanas de edad.

1. Aislamiento y escisión de la aorta

1. Marcadores fluorescentes
   1. Cuarenta y ocho horas antes de la eutanasia, inyecte a los ratones 20 μM OsteoSense 680, un agente de imagen fluorescente, a la dosis recomendada de 100 μL por 25 g a través de una inyección intravenosa.
   2. Debajo de la campana extractora, coloque una tabla de espuma de poliestireno con cuatro clavijas en T, un cubo forrado con una toalla de papel, un tubo de 50 ml relleno con una toalla de papel, un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, herramientas de disección (consulte la Tabla de materiales) y etanol en una botella de spray. Coloque vasos de precipitados con PBS sobre hielo.
2. Extracción de sangre
   1. Agregue 2 ml de isoflurano en un tubo cónico de 50 ml relleno con la toalla de papel. Coloque el tubo en el cubo y ciérrelo con su tapa.
      PRECAUCIÓN: El isoflurano debe manipularse en un espacio bien ventilado sin recirculación del aire de escape debido a la toxicidad de la exposición a corto plazo.
   2. Transfiera un ratón al cubo a la vez. Una vez sedado, coloque el ratón sobre la toalla de papel en posición dorsal. Sosteniendo el mouse con la palma de la mano no dominante, coloque las orejas hacia atrás con el pulgar y el dedo índice.
   3. Usando las pinzas, extirpe uno de los ojos. Sostenga el ratón por encima del tubo de 1,5 ml para comenzar la extracción de sangre, durante la cual se debe recolectar 1 ml de sangre. Una vez que la sangre deje de drenar, coloque el ratón de nuevo en el cubo para una mayor sedación.
3. Eutanasia
   1. Coloque una toalla de papel sobre el tapete de disección. Una vez que el ratón esté sedado, coloque el ratón en la colchoneta en posición supina. Asegure el ratón en posición supina usando un pasador en T para sujetar cada extremidad.
   2. Rocíe el abdomen del ratón con alcohol. Usando las pinzas, levante la piel en la región del pecho. Con las tijeras, corte la línea medial en la cavidad torácica. Una vez que el esternón se haya cortado por el centro, corte el diafragma a cada lado de la caja torácica.
   3. Si es necesario, corte la porción frontal de la caja torácica para exponer el corazón y los pulmones.
4. Extirpación de órganos
   1. Con unas pinzas, levante la piel y haga una incisión por la línea media. Elimine cualquier exceso de piel o grasa. Retire los órganos reproductivos y la vejiga, así como cualquier grasa fuera de la línea media.
   2. Mueva los órganos gastrointestinales (GI) hacia el lado derecho y siga los intestinos en la línea media. Una vez encontrado, levante la línea media y extirpe el tracto gastrointestinal hasta el estómago.
   3. Extirpe los riñones levantándolos de la línea media. Corte lo más cerca posible del riñón.
   4. A continuación, comience la extirpación del hígado levantando los lóbulos y cortando lejos de la línea media.
   5. Perfundir el corazón y la aorta. Con una jeringa de 10 ml, inyecte PBS frío en el ventrículo derecho. Espere a que los pulmones se inflen y se vuelvan blancos. Extirpe los pulmones, así como cualquier exceso de diafragma o caja torácica.
5. Extirpación ósea
   1. Abra un par de tijeras de par en par y colóquelas en la región inferior del mouse sobre la cola. Corte hacia abajo y comience a levantar la columna vertebral de la piel. Retire la grasa de los lados de la línea media. Una vez que la piel se desprende, extirpe la columna vertebral y los órganos intactos cortando justo por encima del corazón. Si se transporta a un estereoscopio, coloque la columna vertebral y los órganos intactos en un vaso de precipitados de PBS en el cubo de hielo.
   2. Mueva la columna vertebral y los órganos en el plato de disección. Llene con PBS helado. Fije la columna vertebral y la caja torácica con agujas.
   3. Bajo el microscopio de disección, use pinzas para levantar el corazón con cuidado y comience a cortar por encima de la columna vertebral y debajo de la aorta. Continúe esto hasta que se alcance la parte inferior de la columna vertebral. Retire la columna vertebral del plato de disección y fije el corazón y cualquier grasa o músculo extraño.
6. Microdissection
   1. Comenzando desde el área justo debajo del corazón, identifique las tres estructuras tubulares: el esófago, la vena cava y la aorta. Extirpar el esófago y la vena cava para tener un campo visual claro de la aorta.
   2. Usando las pinzas de microdisección y las tijeras, comience a levantar el tejido adiposo y cortar lo más cerca posible de la aorta. Asegúrese de no cortar la aorta. Continúe esto por la línea medial hasta que toda la aorta, así como las arterias femorales estén expuestas.
   3. En el corazón, retire todo el tejido adiposo, exponiendo las tres ramas en el arco aórtico. Retire la raíz aórtica del ventrículo izquierdo insertando las tijeras de microdisección en el ventrículo izquierdo y cortando el músculo que rodea la aorta.
   4. Una vez que la aorta está aislada y limpiada, obtenga imágenes de la aorta usando un escáner de infrarrojo cercano para visualizar la calcificación vascular.
   5. Utilice el script personalizado de MATLAB (archivo complementario 1) para cuantificar la señal total del marcador de calcio, que se normaliza al área total de la aorta explorada. El script de MATLAB funciona mediante el complemento Bioinformatics toolbox. MATLAB se dirige primero a la ubicación de los archivos TIFF desde el escaneo de infrarrojo cercano de las aortas, los archivos individuales se abren y los valores de intensidad de píxeles se extraen de los archivos TIFF.
      1. Una vez presentada la imagen al usuario con un mapa de color, seleccione la aorta con mayor calcificación como máximo de escala.
      2. Cuando MATLAB pregunte "¿Cuántas muestras hay en la imagen?" en la ventana de comandos, introduzca el número de aortas en la imagen actual y seleccione cada aorta una por una. Una vez seleccionada una aorta, MATLAB creará una imagen binaria con una máscara del área total de la aorta y otra imagen binaria con una máscara del área calcificada de la aorta. Los valores de estas imágenes enmascaradas se utilizan para determinar el área calcificada total, el área total de la aorta, el área porcentual positiva para calcificación y la intensidad media del área calcificada.
      3. Para seleccionar una aorta, haga un cuadro alrededor de la aorta de interés en la figura más reciente de la pantalla seleccionando cuatro esquinas con un clic izquierdo y creando un cuadro alrededor de la imagen. Para cerrar el cuadro, haga doble clic en la primera esquina.
         NOTA: El umbral puede ser diferente dependiendo del modelo de calcificación utilizado. Depende del usuario determinar qué valor determina una señal positiva para la calcificación vascular. Una vez que se establece el umbral para un experimento, debe permanecer igual durante toda la duración del experimento.
   6. Una vez extraídos los datos cuantitativos, realice un ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Tukey para mostrar la significación entre los grupos.

2. Aislar y extraer EVs de las aortas

NOTA: Una vez que las aortas han sido aisladas y eliminadas, las EV se pueden extraer del tejido. Usando una solución digestiva y múltiples ciclos de centrífuga, los EV se pueden recolectar y usar para muchas técnicas diferentes, incluidos los ensayos de calcificación, la electroforesis en gel y la inmunotransferencia¹³. El protocolo para aislar y extraer vehículos eléctricos es el siguiente:

1. Inmediatamente después de escanear las aortas, agrupe de dos a tres aortas para producir una concentración suficiente de proteínas.
2. Prepare una solución digestiva que contenga 0,25 M de sacarosa, 0,12 M de cloruro de sodio (NaCl), 0,01 M de cloruro de potasio (KCl), 0,02 M de clorhidrato de Tris y 600 U/ml de colagenasa¹³.
3. Incubar de dos a tres aortas agrupadas en 1,5 ml de solución digestiva durante 2 h a 37 °C. Recoja la solución. Centrifugar la solución a 1.000 × g durante 15 minutos para eliminar los restos celulares.
4. Centrifugar el sobrenadante durante 30 minutos adicionales a 33.000 × g para eliminar las microvesículas. Recoger y evaluar el sobrenadante para determinar el potencial de calcificación (ver sección 3).
   NOTA: Siga los pasos siguientes si se va a realizar electroforesis en gel e inmunotransferencia de proteínas de los EV.
5. Ultracentrifugar el sobrenadante a 100.000 × g durante 1 h para aislar los EV de interés.
6. Mientras el sobrenadante está sometido a ultracentrifugación, prepare la lisis RIPA y el tampón de extracción (consulte la Tabla de materiales) agregando el inhibidor de la proteasa y vórtice hasta que se disuelva.
7. Una vez completada la ultracentrifugación, aspirar el sobrenadante, dejando el pellet, que contiene los EVs. Suspender el pellet en la mezcla preparada de lisis RIPA e inhibidor de la proteasa. Las muestras están listas para electroforesis en gel y western blotting.

3. Evaluación del potencial de calcificación de vesículas extracelulares con absorbancia de dispersión ligera

NOTA: Para medir la formación mineral en tiempo real de EVs, utilizamos un ensayo desarrollado originalmente para estudiar la formación de minerales a partir de EVs de cartílago en placa de crecimiento a partir de cultivo celular¹⁴. Dado que la deposición de fosfato de calcio es el sello distintivo de la calcificación, un aumento en la absorbancia de dispersión de la luz como resultado de la formación de compuestos de fosfato de calcio es indicativo del potencial de calcificación¹⁴. In vitro Los modelos VSMC son convenientes para medir el potencial de calcificación de los vehículos eléctricos. En esta técnica, un lector de placas con un filtro de longitud de onda corta puede cuantificar la calcificación in vitro de los EV. La lectura de absorbencia se registra a 340 nm, y una mayor absorbancia es indicativa de una mayor formación de mineral de fosfato de calcio. El protocolo para el ensayo de absorbancia de dispersión de luz es el siguiente:

1. Centrifugar el medio recogido acondicionado de los VSMC a 1.000 × g durante 5 min para eliminar los restos celulares¹⁴.
2. Centrifugar el sobrenadante a 33.000 × g durante 30 minutos, recoger el sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo.
   NOTA: La presencia de EV en el sobrenadante recolectado se puede confirmar mediante dispersión dinámica de luz (DLS) o análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
3. Preparar una solución estéril monobásica de fosfato sódico (NaH₂PO₄) de 300 mM. Filtre la solución para garantizar condiciones estériles si es necesario.
4. Añadir 1% (v/v) de 300 mM NaH₂PO₄ a las muestras EV y pipetear suavemente la solución para mezclar bien. Transfiera 200 μL de la solución de mezcla a una placa de 96 pocillos. Incubar la placa de 96 pocillos en el lector de microplacas a 37 °C.
5. Configure el lector de placas para registrar la absorbancia a una longitud de onda de 340 nm cada 1 minuto.

4. Evaluación de la formación mineral de calcificación de vesículas extracelulares con hidrogeles de colágeno

NOTA: La agregación de EVs y la formación de microcalcificaciones se observan a través de hidrogeles de colágeno. Estos hidrogeles actúan como un andamio que imita la densidad de colágeno observada in vivo¹⁵. Esto demuestra el efecto del colágeno en el crecimiento de la calcificación. El protocolo para evaluar la formación mineral de EVs en hidrogeles es el siguiente:

1. Día 1
   1. Prepare una solución de colágeno de 2,5 mg/ml en DMEM. Agregue lentamente 5 M de hidróxido de sodio a la mezcla de colágeno / DMEM hasta que el color cambie a rojo. Compruebe que el pH de la solución es de aproximadamente 7.
      NOTA: Si la solución se vuelve púrpura y se vuelve demasiado básica, reinicie el proceso.
   2. Pipetear 300 μL de la solución de colágeno de 2,5 mg/ml con un pH de 7 en cada pocillo de un vidrio de cámara de 8 pocillos. Incubar a 37 °C y 5% de CO2 con humedad controlada durante₇₂ h.
2. Día 4
   1. Agregue 300 μL de DMEM como control en los pocillos.
   2. Agregue 300 μL de las muestras de medio EV recolectadas previamente a los pocillos restantes.
   3. Incubar a 37 °C y 5% de_CO2 con humedad controlada durante 6 días.
3. Día 10
   1. Preparar 2,5 μL de Osteosense 680EX con 22,5 μL de DMEM.
   2. Pipetear 2,5 μL de la mezcla Osteosense y DMEM en cada pocillo. Incubar a 37 °C y 5% de_CO2 con humedad controlada durante 24 h.
4. Día 11
   1. Imagen de los hidrogeles con filtros apropiados para la fluorescencia Osteosense. Visualícelos a través de la parte inferior de una cámara de vidrio de cubierta usando un microscopio invertido o desde la parte superior con un objetivo de larga distancia de trabajo.
   2. Evalúe el número de calcificaciones y el tamaño de calcificación en las imágenes recopiladas utilizando las opciones de análisis de partículas disponibles en ImageJ.
      1. Usar la imagen | Ajustar | Comando de umbral para binarizar las imágenes de tal manera que sólo la señal Osteosense aparezca blanca. Utilice el archivo Analyze | Comando Analizar partículas para obtener información para cada calcificación en la imagen. Asegúrese de utilizar los mismos parámetros de umbral para cada imagen analizada para garantizar su coherencia.

Resultados

Una vez que se extraen las aortas, las imágenes con un escáner óptico de infrarrojo cercano muestran una representación visual de la aorta, así como la calcificación vascular (Figura 1). Los valores de intensidad de píxeles dentro de la imagen fluorescente escaneada representan la distribución de la calcificación y se muestran aquí utilizando un mapa de calor en color. Los métodos de cuantificación incluyen identificar un umbral positivo e informar el área porcentual de la aorta...

Discusión

Al realizar el protocolo, es importante tener en cuenta los pasos críticos para obtener resultados exitosos. Durante el aislamiento de la aorta murina, es vital que la perfusión se realice correctamente. Al inyectar el PBS, se debe tener cuidado de no perforar el ventrículo derecho. Esto causaría que el líquido se filtre directamente del ventrículo y no circule a través de los pulmones, dejando sangre dentro de la aorta. Una vez que la perfusión se ha realizado correctamente y la microdisección ha comenzado, tod...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153