Analisi della calcificazione vascolare extracellulare vescicolo-mediata mediante modelli in vitro e in vivo

Riepilogo

Questo articolo presenta la metodologia per ottenere e valutare la calcificazione vascolare isolando le aorte murine seguita dall'estrazione di vescicole extracellulari calcificate per osservare il potenziale di mineralizzazione.

Abstract

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte nel mondo e la calcificazione vascolare è il predittore più significativo di eventi cardiovascolari; Tuttavia, attualmente non ci sono trattamenti o opzioni terapeutiche per la calcificazione vascolare. La calcificazione inizia all'interno di vescicole extracellulari specializzate (EV), che fungono da focolai nucleanti aggregando ioni calcio e fosfato. Questo protocollo descrive i metodi per ottenere e valutare la calcificazione nelle aorte murine e analizzare le EV estratte associate. In primo luogo, la dissezione grossolana del topo viene eseguita per raccogliere tutti gli organi rilevanti, come i reni, il fegato e i polmoni. Quindi, l'aorta murina viene isolata e asportata dalla radice aortica all'arteria femorale. Due o tre aorte vengono quindi raggruppate e incubate in una soluzione digestiva prima di essere sottoposte a ultracentrifugazione per isolare gli EV di interesse. Successivamente, il potenziale di mineralizzazione degli EV viene determinato attraverso l'incubazione in una soluzione ad alto contenuto di fosfato e misurando l'assorbanza della luce a una lunghezza d'onda di 340 nm. Infine, gli idrogel di collagene vengono utilizzati per osservare la formazione e la maturazione dei minerali calcificati prodotti dagli EV in vitro.

Introduzione

La calcificazione è il predittore più significativo della mortalità e della morbilità delle malattie cardiovascolari¹. La calcificazione altera la meccanica della parete arteriosa a causa dell'accumulo di minerali di calcio e fosfato². Nell'aterosclerosi, la calcificazione può esacerbare lo stress locale e provocare la rottura della placca, che è la principale causa di attacchi di cuore. La calcificazione mediale, spesso derivante da malattia renale cronica, è più diffusa e porta a un significativo irrigidimento arterioso, disfunzione e sovraccarico cardiaco ^2,3. Attualmente, non ci sono opzioni terapeutiche per il trattamento o la prevenzione della calcificazione vascolare.

Le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) adottano un fenotipo simile agli osteoblasti e rilasciano vescicole extracellulari calcificanti (EV) che nucleano i minerali nascenti, guidando così la calcificazione ^4,5,6. Questo processo assomiglia alla mineralizzazione fisiologica degli osteoblasti nell'osso⁷. Sebbene l'endpoint della mineralizzazione sia simile nella parete vascolare e nella matrice ossea, i meccanismi con cui hanno origine le EV calcificanti differiscono nei due tessuti⁸. Esistono molti tipi di modelli utilizzati per studiare la calcificazione vascolare. In vitro, i modelli di coltura cellulare imitano la transizione osteogenica dei VSMC e la successiva formazione di minerali con mezzi specializzati.

Quando si studia la calcificazione in vivo, il modello utilizzato dipende dal tipo di calcificazione studiata. I modelli murini iperlipidemici sono spesso usati per studiare la calcificazione aterosclerotica, che appare più focale all'interno delle placche ricche di lipidi⁹. Al contrario, la calcificazione mediale è più diffusa in tutta la vascolarizzazione ed è spesso studiata utilizzando modelli di malattia renale cronica che impiegano un regime dietetico ricco di adenina per indurre insufficienza renale o tecniche chirurgiche per rimuovere porzioni significative dei reni^10,11. I modelli aggressivi di calcificazione vascolare hanno utilizzato una combinazione di modelli di malattia renale iperlipidemica e cronica¹². Questo protocollo fornisce un metodo per valutare la calcificazione vascolare nelle aorte murine sia per la calcificazione mediale che aterosclerotica, estraendo EV dalla parete aortica e osservando il potenziale di mineralizzazione nelle EV ottenute da modelli di coltura cellulare in vitro. Studi futuri possono utilizzare queste procedure nelle analisi meccanicistiche della calcificazione vascolare e per valutare potenziali interventi terapeutici.

Protocollo

Il lavoro in vivo è stato approvato e supervisionato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Florida International University e conforme alle attuali linee guida del National Institutes of Health (NIH). Per questo protocollo, la procedura non differisce a seconda del ceppo, del peso, dell'età e del sesso del topo. Il tipo di calcificazione studiata, le diete e i trattamenti possono alterare la durata dello studio e il peso del topo utilizzato e possono dipendere da un ceppo specifico e dal sesso del topo utilizzato nello studio. Per questo protocollo, sono stati utilizzati topi C57BL / 6J sia maschi che femmine e sono stati alimentati con una dieta di calcificazione. I topi sono stati sacrificati tra le 20 settimane e le 24 settimane di età.

1. Isolamento ed escissione dell'aorta

1. Marcatori fluorescenti
   1. Quarantotto ore prima dell'eutanasia, iniettare nei topi 20 μM OsteoSense 680, un agente di imaging fluorescente, alla dose raccomandata di 100 μL per 25 g tramite iniezione endovenosa.
   2. Sotto la cappa aspirante, posizionare un pannello di polistirolo con quattro perni a T, un secchio rivestito con un tovagliolo di carta, un tubo da 50 ml riempito con un tovagliolo di carta, un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, strumenti di dissezione (vedere la tabella dei materiali) ed etanolo in un flacone spray. Posizionare i bicchieri con PBS sul ghiaccio.
2. Prelievo di sangue
   1. Aggiungere 2 mL di isoflurano in un tubo conico da 50 mL riempito con il tovagliolo di carta. Metti il tubo nel secchio e chiudilo con il coperchio.
      ATTENZIONE: L'isoflurano deve essere maneggiato in uno spazio ben ventilato senza ricircolo dell'aria di scarico a causa della tossicità dell'esposizione a breve termine.
   2. Trasferire un mouse nel secchio alla volta. Una volta sedato, posizionare il mouse sul tovagliolo di carta in posizione dorsale. Tenendo il mouse con il palmo della mano non dominante, posizionare le orecchie indietro usando il pollice e il dito puntatore.
   3. Usando le pinzette, asportare uno degli occhi. Tenere il mouse sopra il tubo da 1,5 ml per iniziare la raccolta del sangue, durante la quale deve essere raccolto 1 ml di sangue. Una volta che il sangue smette di drenare, riposizionare il mouse nel secchio per un'ulteriore sedazione.
3. Eutanasia
   1. Metti un tovagliolo di carta sul tappetino di dissezione. Una volta che il mouse è sedato, posizionalo sul tappetino in posizione supina. Fissare il mouse in posizione supina usando un perno a T per tenere premuto ogni arto.
   2. Spruzzare l'addome del topo con alcool. Usando le pinzette, sollevare la pelle nella regione del torace. Con le forbici, tagliare la linea mediale nella cavità toracica. Una volta che lo sterno è stato tagliato al centro, tagliare il diaframma su entrambi i lati della gabbia toracica.
   3. Se necessario, tagliare via la porzione frontale della gabbia toracica per esporre il cuore e i polmoni.
4. Asportazione di organi
   1. Usando una pinzetta, sollevare la pelle e fare un'incisione lungo la linea mediana. Rimuovere la pelle o il grasso in eccesso. Rimuovere gli organi riproduttivi e la vescica, così come qualsiasi grasso al di fuori della linea mediana.
   2. Spostare gli organi gastrointestinali (GI) sul lato destro e seguire l'intestino nella linea mediana. Una volta trovato, sollevare la linea mediana e asportare il tratto gastrointestinale fino allo stomaco.
   3. Asportare i reni sollevandoli dalla linea mediana. Tagliare il più vicino possibile al rene.
   4. Quindi, iniziare la rimozione del fegato sollevando i lobi e tagliando via dalla linea mediana.
   5. Perfondere il cuore e l'aorta. Utilizzando una siringa da 10 ml, iniettare PBS freddo nel ventricolo destro. Aspetta che i polmoni si gonfino e diventino bianchi. Rimuovere i polmoni, così come qualsiasi diaframma o gabbia toracica in eccesso.
5. Rimozione ossea
   1. Apri un paio di forbici larghe e posizionale nella regione inferiore del mouse sopra la coda. Taglia verso il basso e inizia a sollevare la colonna vertebrale dalla pelle. Rimuovere il grasso dai lati della linea mediana. Una volta che la pelle è staccata, asportare la colonna vertebrale e gli organi intatti tagliando proprio sopra il cuore. Se si trasporta su uno stereoscopio, posizionare la colonna vertebrale e gli organi intatti in un becher di PBS nel secchiello del ghiaccio.
   2. Spostare la colonna vertebrale e gli organi nel piatto di dissezione. Riempi con PBS ghiacciato. Appuntare la colonna vertebrale e la gabbia toracica usando gli aghi.
   3. Sotto il microscopio a dissezione, utilizzare una pinzetta per sollevare il cuore con attenzione e iniziare a tagliare sopra la colonna vertebrale e sotto l'aorta. Continuare fino a raggiungere la parte inferiore della colonna vertebrale. Rimuovere la colonna vertebrale dal piatto di dissezione e fissare il cuore e qualsiasi grasso o muscolo estraneo.
6. Microdissection
   1. Partendo dalla zona appena sotto il cuore, identificare le tre strutture tubolari: l'esofago, la vena cava e l'aorta. Rimuovere l'esofago e la vena cava per avere un campo visivo chiaro dell'aorta.
   2. Usando la pinza da microdissezione e le forbici, inizia a sollevare il tessuto adiposo e tagliare il più vicino possibile all'aorta. Assicurati di non tagliare l'aorta. Continuare questo lungo la linea mediale fino a quando tutta l'aorta e le arterie femorali sono esposte.
   3. Al cuore, rimuovere tutto il tessuto adiposo, esponendo i tre rami all'arco aortico. Rimuovere la radice aortica dal ventricolo sinistro inserendo le forbici di microdissezione nel ventricolo sinistro e tagliando il muscolo che circonda l'aorta.
   4. Una volta che l'aorta è isolata e pulita, visualizzare l'aorta utilizzando uno scanner nel vicino infrarosso per visualizzare la calcificazione vascolare.
   5. Utilizza lo script MATLAB personalizzato (Supplemental File 1) per quantificare il segnale totale del tracciante di calcio, che viene normalizzato all'area totale dell'aorta scansionata. Lo script MATLAB funziona utilizzando il componente aggiuntivo Bioinformatics toolbox. MATLAB viene prima indirizzato alla posizione dei file TIFF dalla scansione nel vicino infrarosso delle aorte, i singoli file vengono quindi aperti e i valori di intensità dei pixel vengono estratti dai file TIFF.
      1. Una volta che l'immagine viene presentata all'utente con una mappa a colori, selezionare l'aorta con la maggiore calcificazione come scala massima.
      2. Quando MATLAB chiede "Quanti campioni ci sono nell'immagine?" nella finestra di comando, inserisci il numero di aorte nell'immagine corrente e seleziona ciascuna aorta una per una. Una volta selezionata un'aorta, MATLAB creerà un'immagine binaria con una maschera dell'area totale dell'aorta e un'altra immagine binaria con una maschera dell'area calcificata dell'aorta. I valori di queste immagini mascherate vengono quindi utilizzati per determinare l'area calcificata totale, l'area totale dell'aorta, l'area percentuale positiva per la calcificazione e l'intensità media dell'area calcificata.
      3. Per selezionare un'aorta, crea una casella attorno all'aorta di interesse sulla figura più recente sullo schermo selezionando quattro angoli con un clic sinistro e creando una casella intorno all'immagine. Per chiudere la casella, fare doppio clic sul primo angolo.
         NOTA: La soglia può essere diversa a seconda del modello di calcificazione utilizzato. Spetta all'utente determinare quale valore determina un segnale positivo per la calcificazione vascolare. Una volta impostata la soglia per un esperimento, deve rimanere la stessa per tutta la durata dell'esperimento.
   6. Una volta estratti i dati quantitativi, eseguire un ANOVA unidirezionale con il test post-hoc di Tukey per mostrare la significatività tra i gruppi.

2. Isolare ed estrarre EV dalle aorte

NOTA: Una volta che le aorte sono state isolate e rimosse, gli EV possono essere estratti dal tessuto. Utilizzando una soluzione digestiva e più cicli di centrifuga, gli EV possono essere raccolti e utilizzati per molte tecniche diverse, tra cui saggi di calcificazione, elettroforesi su gel e immunoblotting¹³. Il protocollo per l'isolamento e l'estrazione dei veicoli elettrici è il seguente:

1. Immediatamente dopo la scansione delle aorte, raggruppare da due a tre aorte per produrre una concentrazione proteica sufficiente.
2. Preparare una soluzione digestiva contenente 0,25 M di saccarosio, 0,12 M di cloruro di sodio (NaCl), 0,01 M di cloruro di potassio (KCl), 0,02 M di Tris cloridrato e 600 U/mL di collagenasi¹³.
3. Incubare da due a tre aorte raggruppate in 1,5 ml di soluzione digestiva per 2 ore a 37 °C. Raccogliere la soluzione. Centrifugare la soluzione a 1.000 × g per 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari.
4. Centrifugare il surnatante per altri 30 minuti a 33.000 × g per rimuovere le microvescicole. Raccogliere e valutare il surnatante per il potenziale di calcificazione (vedere paragrafo 3).
   NOTA: Seguire i passaggi successivi se devono essere eseguiti l'elettroforesi su gel e l'immunoblotting proteico delle EV.
5. Ultracentrifugare il surnatante a 100.000 × g per 1 h per isolare i veicoli elettrici di interesse.
6. Mentre il surnatante è sottoposto ad ultracentrifugazione, preparare il tampone di lisi ed estrazione di RIPA (vedere la Tabella dei Materiali) aggiungendo l'inibitore della proteasi e vortice fino alla dissoluzione.
7. Una volta completata l'ultracentrifugazione, aspirare il surnatante, lasciando il pellet, che contiene i veicoli elettrici. Sospendere il pellet nella miscela preparata di lisi e inibitore della proteasi RIPA. I campioni sono pronti per l'elettroforesi su gel e il western blotting.

3. Valutazione del potenziale di calcificazione di vescicole extracellulari con assorbimento della diffusione della luce

NOTA: Per misurare la formazione minerale in tempo reale delle EV, abbiamo utilizzato un saggio originariamente sviluppato per studiare la formazione di minerali da EV di cartilagine a piastre di crescita da colture cellulari¹⁴. Poiché la deposizione di fosfato di calcio è il segno distintivo della calcificazione, un aumento dell'assorbanza di diffusione della luce come risultato della formazione di composti di fosfato di calcio è indicativo del potenziale di calcificazione¹⁴. In vitro I modelli VSMC sono convenienti per misurare il potenziale di calcificazione dei veicoli elettrici. In questa tecnica, un lettore di piastre con un filtro a lunghezza d'onda corta può quantificare la calcificazione in vitro delle EV. La lettura dell'assorbenza è registrata a 340 nm e una maggiore assorbanza è indicativa di una maggiore formazione di minerali fosfato di calcio. Il protocollo per il saggio di assorbanza della diffusione della luce è il seguente:

1. Centrifugare il mezzo raccolto condizionato di VSMC a 1.000 × g per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari¹⁴.
2. Centrifugare il surnatante a 33.000 × g per 30 minuti, raccogliere il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta.
   NOTA: La presenza di EV nel surnatante raccolto può essere confermata attraverso la diffusione dinamica della luce (DLS) o l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
3. Preparare una soluzione sterile monobasica di fosfato di sodio (NaH₂PO₄) da 300 mM. Filtrare la soluzione per garantire condizioni sterili, se necessario.
4. Aggiungere l'1% (v/v) di 300 mM NaH₂PO₄ ai campioni EV e pipettare delicatamente la soluzione per miscelare bene. Trasferire 200 μL della soluzione di miscela in una piastra da 96 pozzetti. Incubare la piastra a 96 pozzetti nel lettore di micropiastre a 37 °C.
5. Impostare il lettore di piastre per registrare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 340 nm ogni 1 minuto.

4. Valutazione della formazione minerale di calcificazione di vescicole extracellulari con idrogel di collagene

NOTA: L'aggregazione di EV e la formazione di microcalcificazioni sono osservate attraverso idrogel di collagene. Questi idrogel agiscono come un'impalcatura che imita la densità del collagene osservata in vivo¹⁵. Questo dimostra l'effetto del collagene sulla crescita della calcificazione. Il protocollo per valutare la formazione minerale di EV negli idrogel è il seguente:

1. Giorno 1
   1. Preparare una soluzione di collagene da 2,5 mg/ml in DMEM. Aggiungere lentamente 5 M idrossido di sodio alla miscela collagene / DMEM fino a quando il colore diventa rosso. Verificare che il pH della soluzione sia approssimativamente 7.
      Nota : se la soluzione diventa viola e diventa troppo semplice, riavviare il processo.
   2. Pipettare 300 μL della soluzione di collagene da 2,5 mg/mL con pH 7 in ciascun pozzetto di un vetro a 8 pozzetti. Incubare a 37 °C e umidità controllata al 5% di CO₂ per 72 ore.
2. Giorno 4
   1. Aggiungere 300 μL di DMEM come controllo nei pozzetti.
   2. Aggiungere 300 μL dei campioni di terreno EV raccolti in precedenza ai pozzetti rimanenti.
   3. Incubare a 37 °C e 5% di umidità controllata di CO₂ per 6 giorni.
3. Giorno 10
   1. Preparare 2,5 μL di Osteosense 680EX con 22,5 μL di DMEM.
   2. Pipettare 2,5 μL della miscela Osteosense e DMEM in ciascun pozzetto. Incubare a 37 °C e 5% di umidità controllata di CO₂ per 24 ore.
4. Giorno 11
   1. Immagina gli idrogel con filtri appropriati per la fluorescenza Osteosense. Immaginateli attraverso il fondo di una camera di vetro di copertura usando un microscopio invertito o dall'alto con un obiettivo a lunga distanza di lavoro.
   2. Valutare il numero di calcificazioni e la dimensione della calcificazione nelle immagini raccolte utilizzando le opzioni di analisi delle particelle disponibili in ImageJ.
      1. Usa l'immagine | Regola | Comando di soglia per binarizzare le immagini in modo tale che solo il segnale Osteosense appaia bianco. Utilizzare il comando Analizza | Comando Analizza particelle per ottenere informazioni per ogni calcificazione nell'immagine. Assicurati di utilizzare gli stessi parametri di soglia per ogni immagine analizzata per coerenza.

Risultati

Una volta estratte le aorte, l'imaging utilizzando uno scanner ottico nel vicino infrarosso mostra una rappresentazione visiva dell'aorta e della calcificazione vascolare (Figura 1). I valori di intensità dei pixel all'interno dell'immagine fluorescente scansionata rappresentano la distribuzione della calcificazione e vengono mostrati qui utilizzando una mappa di calore colorata. I metodi di quantificazione includono l'identificazione di una soglia positiva e la segnalazione dell'area perce...

Discussione

Quando si esegue il protocollo, è importante notare i passaggi critici per ottenere risultati positivi. Durante l'isolamento dell'aorta murina, è fondamentale che la perfusione venga eseguita correttamente. Quando si inietta il PBS, bisogna fare attenzione a non perforare il ventricolo destro. Ciò causerebbe la fuoriuscita del liquido direttamente dal ventricolo e non riuscirebbe a circolare attraverso i polmoni, lasciando sangue all'interno dell'aorta. Una volta che la perfusione è stata condotta correttamente e la ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153