ניתוח הסתיידות כלי דם חוץ-תאית בתיווך שלפוחית באמצעות מודלים In Vitro ו-In Vivo

Summary

מאמר זה מציג את המתודולוגיה להשגת והערכת הסתיידות כלי הדם על ידי בידוד אבי העורקים של מורין ואחריו חילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מסוידות כדי לבחון את פוטנציאל המינרליזציה.

Abstract

מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם, והסתיידות כלי הדם היא המנבא המשמעותי ביותר לאירועים קרדיווסקולריים; עם זאת, אין כיום אפשרויות טיפול או טיפול להסתיידות כלי דם. ההסתיידות מתחילה בשלפוחיות חוץ-תאיות מיוחדות (EVs), המשמשות כמוקדי נוקלציה על ידי צבירת יוני סידן ופוספט. פרוטוקול זה מתאר שיטות להשגה והערכה של הסתיידות באבי העורקים וניתוח כלי הרכב החשמליים שחולצו הקשורים. ראשית, דיסקציה גסה של העכבר מבוצעת כדי לאסוף איברים רלוונטיים, כגון הכליות, הכבד והריאות. לאחר מכן, אבי העורקים מבודד ונכרת מהשורש אבי העורקים לעורק הירך. לאחר מכן שניים עד שלושה אבי עורקים נאגרים ומודגרים בתמיסת עיכול לפני שהם עוברים אולטרה-צנטריפוגה כדי לבודד את כלי הרכב החשמליים המעניינים. לאחר מכן, פוטנציאל המינרליזציה של כלי הרכב החשמליים נקבע באמצעות דגירה בתמיסת פוספט גבוהה ומדידת בליעת האור באורך גל של 340 ננומטר. לבסוף, הידרוג'לים של קולגן משמשים לצפייה בהיווצרות ובהבשלה של מינרלים מסוידים המיוצרים על ידי כלי רכב חשמליים במבחנה.

Introduction

הסתיידות היא המנבא המשמעותי ביותר לתמותה ותחלואה ממחלות לב וכלי דם¹. הסתיידות משנה את מכניקת דופן העורקים עקב הצטברות מינרלים של סידן ופוספט². בטרשת עורקים, הסתיידות עלולה להחמיר את הלחץ המקומי ולגרום לקרע פלאק, שהוא הגורם המוביל להתקפי לב. הסתיידות מדיאלית - הנובעת לעתים קרובות ממחלת כליות כרונית - נפוצה יותר ומובילה להתקשות עורקים משמעותית, תפקוד לקוי ועומס יתר לבבי ^2,3. נכון לעכשיו, אין אפשרויות טיפוליות לטיפול או מניעה של הסתיידות כלי הדם.

תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs) מאמצים פנוטיפ דמוי אוסטאובלסט ומשחררים שלפוחיות חוץ-תאיות מסתיידות (EVs) המעוררות מינרלים מתהווים, ובכך מניעות הסתיידות ^4,5,6. תהליך זה דומה למינרליזציה פיזיולוגית של אוסטאובלסטים בעצם⁷. למרות שנקודת הסיום של מינרליזציה דומה בדופן כלי הדם ובמטריצת העצם, המנגנונים שבאמצעותם נוצרים כלי הרכב החשמליים המסוידים שונים בשתי הרקמות⁸. ישנם סוגים רבים של מודלים המשמשים לחקר הסתיידות כלי הדם. במבחנה, מודלים של תרביות תאים מחקים את המעבר האוסטאוגני של VSMCs והיווצרות מינרלים לאחר מכן עם מדיה מיוחדת.

כאשר לומדים הסתיידות in vivo, המודל המשמש תלוי בסוג ההסתיידות הנחקרת. מודלים של עכברים היפרליפידמיים משמשים לעתים קרובות לחקר הסתיידות טרשת עורקים, אשר נראית ממוקדת יותר בתוך רבדים עשירים בשומנים⁹. לעומת זאת, הסתיידות מדיאלית נפוצה יותר בכל כלי הדם ונחקרת לעתים קרובות באמצעות מודלים של מחלת כליות כרונית המשתמשים במשטר תזונה עשיר באדנין כדי לגרום לאי ספיקת כליות או טכניקות כירורגיות להסרת חלקים משמעותיים של הכליות^10,11. מודלים אגרסיביים של הסתיידות כלי דם השתמשו בשילוב של מודלים של מחלת כליות היפרליפידמית וכרונית¹². פרוטוקול זה מספק שיטה להערכת הסתיידות כלי הדם באבי העורקים המוריני עבור הסתיידות מדיאלית וטרשת עורקים, חילוץ EVs מדופן אבי העורקים, וצפייה בפוטנציאל המינרליזציה ברכבים חשמליים המתקבלים ממודלים של תרביות תאים במבחנה. מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בפרוצדורות אלה בניתוחים מכניסטיים של הסתיידות כלי דם ולהעריך התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

Protocol

העבודה in vivo אושרה ופוקחה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטה הבינלאומית של פלורידה ותאמה את ההנחיות הנוכחיות של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). עבור פרוטוקול זה, ההליך אינו שונה בהתאם למתח, משקל, גיל ומין של העכבר. סוג ההסתיידות הנחקר, הדיאטות והטיפולים עשויים לשנות את אורך המחקר ואת משקל העכבר המשמש ועשויים להיות תלויים בזן ומין מסוים של עכבר המשמש במחקר. עבור פרוטוקול זה, עכברים זכרים ונקבות כאחד C57BL/6J שימשו, והם הוזנו בדיאטת הסתיידות. העכברים הוקרבו בין גיל 20 שבועות ל-24 שבועות.

1. בידוד וכריתה של אבי העורקים

1. סמנים פלואורסצנטיים
   1. ארבעים ושמונה שעות לפני המתת חסד, הזריקו לעכברים 20 מיקרומטר OsteoSense 680, חומר הדמיה פלואורסצנטי, במינון המומלץ של 100 μL לכל 25 גרם באמצעות זריקה תוך ורידית.
   2. מתחת למכסה המנוע מניחים לוח קלקר עם ארבעה פינים, דלי מרופד במגבת נייר, צינור 50 מ"ל ממולא במגבת נייר, צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, כלי דיסקציה (ראו טבלת חומרים) ואתנול בבקבוק תרסיס. מניחים כוסות עם PBS על קרח.
2. לקיחת דם
   1. הוסף 2 מ"ל של isoflurane לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ממולא במגבת נייר. מניחים את הצינור בדלי, וסוגרים אותו עם המכסה שלו.
      זהירות: יש לטפל באיזופלורן בחלל מאוורר היטב ללא מחזור מחדש של אוויר פליטה בשל הרעילות של חשיפה לטווח קצר.
   2. העבר עכבר אחד לתוך הדלי בכל פעם. לאחר ההרגעה, הניחו את העכבר על מגבת הנייר במצב גבי. החזקת העכבר בכף היד הלא דומיננטית, הניחו את האוזניים לאחור באמצעות האגודל והאצבע המצביעה.
   3. באמצעות פינצטה, הבלו אחת העיניים. החזק את העכבר מעל צינור 1.5 מ"ל כדי להתחיל באיסוף הדם, שבמהלכו יש לאסוף 1 מ"ל דם. ברגע שהדם מפסיק להתנקז, החזירו את העכבר לדלי להרגעה נוספת.
3. המתת חסד
   1. הניחו מגבת נייר על משטח הנתיחה. לאחר הרגעת העכבר, הניחו את העכבר על המזרן במצב שכיבה. אבטח את העכבר במצב שכיבה באמצעות סיכת T כדי להחזיק כל איבר.
   2. לרסס את הבטן של העכבר עם אלכוהול. באמצעות הפינצטה, להרים את העור באזור החזה. בעזרת המספריים, חותכים את הקו המדיאלי לתוך חלל בית החזה. לאחר חיתוך עצם החזה במרכז, חותכים את הסרעפת משני צדי כלוב הצלעות.
   3. במידת הצורך, לחתוך את החלק הקדמי של כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב והריאות.
4. הסרת איברים
   1. בעזרת פינצטה מרימים את העור ומבצעים חתך לאורך קו האמצע. יש להסיר עודפי עור או שומן. הסר את איברי הרבייה ואת שלפוחית השתן, כמו גם כל שומן מחוץ לקו האמצע.
   2. הזיזו את איברי מערכת העיכול (GI) לצד ימין, ועקבו אחר המעיים בקו האמצע. לאחר שנמצאו, הרימו את קו האמצע, והוציאו את מערכת העיכול עד לקיבה.
   3. הבלו את הכליות על ידי הרמת אותם מקו האמצע. לחתוך קרוב ככל האפשר לכליה.
   4. לאחר מכן, להתחיל את הסרת הכבד על ידי הרמת האונות לחתוך מקו האמצע.
   5. לחורר את הלב ואת אבי העורקים. באמצעות מזרק 10 מ"ל, להזריק PBS קר לתוך החדר הימני. חכו שהריאות יתנפחו ויהפכו ללבנות. הסר את הריאות, כמו גם כל עודף דיאפרגמה או כלוב צלעות.
5. הסרת עצם
   1. פתח זוג מספריים לרוחב, והנח אותם באזור התחתון של העכבר מעל הזנב. חתכו כלפי מטה, והתחילו להרים את עמוד השדרה מהעור. מוציאים את השומן מצידי קו האמצע. ברגע שהעור מנותק, הבלו את עמוד השדרה ואת האיברים השלמים על ידי חיתוך ממש מעל הלב. אם אתם מעבירים לסטריאוסקופ, הניחו את עמוד השדרה ואת האיברים השלמים בתוך של PBS בדלי הקרח.
   2. העבירו את עמוד השדרה והאיברים לתוך צלחת הניתוח. מלאו PBS קר כקרח. הצמידו את עמוד השדרה וכלוב הצלעות באמצעות מחטים.
   3. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בפינצטה כדי להרים את הלב בזהירות, והתחילו לחתוך מעל עמוד השדרה ומתחת לאבי העורקים. המשיכו בכך עד שמגיעים לתחתית עמוד השדרה. הסר את עמוד השדרה מצלחת הניתוח, ונעץ את הלב וכל שומן או שריר חיצוני.
6. מיקרודיסקציה
   1. החל מהאזור ממש מתחת ללב, זהה את שלושת המבנים הצינוריים: הוושט, הווריד הנבוב ואבי העורקים. הסר את הוושט ואת נבוב הווריד כדי לקבל שדה ראייה ברור של אבי העורקים.
   2. בעזרת מלקחיים מיקרודיסקציה ומספריים, מתחילים להרים את רקמת השומן ולחתוך קרוב ככל האפשר לאבי העורקים. הקפד לא לחתוך את אבי העורקים. המשיכו בקו המדיאלי עד לחשיפת כל אבי העורקים וכן עורקי הירך.
   3. בלב, להסיר את כל רקמת השומן, לחשוף את שלושת הענפים בקשת אבי העורקים. הסר את שורש אבי העורקים מהחדר השמאלי על ידי החדרת מספריים microdissection לתוך החדר השמאלי וחיתוך השריר סביב אבי העורקים.
   4. לאחר בידוד וניקוי אבי העורקים, דמיינו את אבי העורקים באמצעות סורק אינפרא אדום קרוב כדי להמחיש הסתיידות כלי דם.
   5. השתמש בסקריפט MATLAB מותאם אישית (קובץ משלים 1) כדי לכמת את האות הכולל של עוקב הסידן, המנורמל לאזור אבי העורקים הסרוק הכולל. סקריפט MATLAB פועל באמצעות התוספת 'ארגז כלים לביואינפורמטיקה'. MATLAB מופנית תחילה למיקום קובצי TIFF מסריקת כמעט אינפרא-אדום של אבי העורקים, הקבצים הבודדים נפתחים לאחר מכן וערכי עוצמת הפיקסלים מחולצים מקובצי TIFF.
      1. לאחר הצגת התמונה למשתמש עם מפת צבע, בחר את אבי העורקים עם ההסתיידות הגדולה ביותר כקנה המידה המרבי.
      2. כאשר MATLAB שואלת "כמה דגימות יש בתמונה?" בחלון הפקודה, הזינו את מספר אבי העורקים בתמונה הנוכחית ובחרו כל אבי עורקים בזו אחר זו. לאחר בחירת אבי העורקים, MATLAB תיצור תמונה בינארית עם מסיכה של השטח הכולל של אבי העורקים ותמונה בינארית נוספת עם מסיכה של האזור המסויד של אבי העורקים. הערכים מתמונות מסיכות אלה משמשים לאחר מכן לקביעת השטח הכולל המסויד, השטח הכולל של אבי העורקים, אזור האחוזים החיוביים להסתיידות והעוצמה הממוצעת של האזור המסויד.
      3. כדי לבחור אבי עורקים, צור תיבה סביב אבי העורקים המעניין את הדמות האחרונה על המסך על ידי בחירת ארבע פינות בלחיצה שמאלית אחת ויצירת תיבה מסביב לתמונה. כדי לסגור את התיבה, לחץ פעמיים על הפינה הראשונה.
         הערה: הסף עשוי להיות שונה בהתאם למודל ההסתיידות שבו נעשה שימוש. זה תלוי במשתמש לקבוע איזה ערך קובע אות חיובי עבור הסתיידות כלי הדם. ברגע שהסף נקבע לניסוי, הוא חייב להישאר זהה לאורך כל תקופת הניסוי.
   6. לאחר חילוץ הנתונים הכמותיים, בצע ANOVA חד כיווני עם מבחן פוסט-הוק של Tukey כדי להראות מובהקות בין הקבוצות.

2. בידוד וחילוץ כלי רכב חשמליים מאבי העורקים

הערה: לאחר בידוד והסרת אבי העורקים, ניתן לחלץ כלי רכב חשמליים מהרקמה. באמצעות תמיסת עיכול ומחזורי צנטריפוגות מרובים, ניתן לאסוף כלי רכב חשמליים ולהשתמש בהם לטכניקות רבות ושונות, כולל בדיקות הסתיידות, אלקטרופורזה בג'ל ואימונובלוטינג¹³. להלן פרוטוקול הבידוד והחילוץ של כלי רכב חשמליים:

1. מיד לאחר סריקת אבי העורקים, אגרו שניים עד שלושה אבי עורקים כדי להניב ריכוז חלבון מספיק.
2. הכינו תמיסת עיכול המכילה 0.25 M סוכרוז, 0.12 M נתרן כלורי (NaCl), 0.01 M אשלגן כלורי (KCl), 0.02 M Tris hydrochloride, ו 600 U / mL collagenase¹³.
3. יש לדגור על שניים עד שלושה אבי עורקים מאוגמים ב-1.5 מ"ל של תמיסת עיכול למשך שעתיים ב-37°C. אסוף את הפתרון. צנטריפוגה את התמיסה במהירות של 1,000 × גרם למשך 15 דקות כדי להסיר פסולת תאים.
4. צנטריפוגו את הסופרנאטנט למשך 30 דקות נוספות ב-33,000 × גרם כדי להסיר מיקרו-שלפוחיות. לאסוף ולהעריך את הסופרנאטנט לפוטנציאל הסתיידות (ראה סעיף 3).
   הערה: בצע את השלבים הבאים אם אלקטרופורזה בג'ל ואימונובלוטציה של חלבונים של כלי רכב חשמליים מבוצעים.
5. אולטרה-צנטריפוגה של הסופרנאטנט במהירות של 100,000 × גרם למשך שעה אחת כדי לבודד את כלי הרכב החשמליים המעניינים.
6. בזמן שהסופרנאטנט עובר אולטרה-צנטריפוגה, הכינו את RIPA lysis ואת חיץ המיצוי (ראו טבלת החומרים) על ידי הוספת מעכב הפרוטאז ומערבולות עד להמסה.
7. לאחר השלמת האולטרה-צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט, והשאירו את הכדור, המכיל את הרכבים החשמליים. משעים את הגלולה בליזיס RIPA מוכן ותערובת מעכבי פרוטאז. הדגימות מוכנות לאלקטרופורזה בג'ל ולכתמים מערביים.

3. הערכת פוטנציאל ההסתיידות של בועיות חוץ-תאיות עם ספיגת פיזור אור

הערה: כדי למדוד את היווצרות המינרלים בזמן אמת של כלי רכב חשמליים, השתמשנו בבדיקה שפותחה במקור כדי לחקור היווצרות מינרלים מסחוס לוחית גדילה מתרבית תאים¹⁴. מכיוון שקיעת סידן פוספט היא סימן ההיכר של הסתיידות, עלייה בספיגת פיזור האור כתוצאה מהיווצרות תרכובת סידן פוספט מעידה על פוטנציאל ההסתיידות¹⁴. במבחנה דגמי VSMC נוחים למדידת פוטנציאל ההסתיידות של כלי רכב חשמליים. בטכניקה זו, קורא לוחות עם מסנן אורך גל קצר יכול לכמת את הסתיידות החוץ גופית של כלי רכב חשמליים. קריאת הספיגה נרשמת ב 340 ננומטר, וספיגה גבוהה יותר מעידה על היווצרות יותר מינרלים של סידן פוספט. הפרוטוקול לבדיקת ספיגת פיזור האור הוא כדלקמן:

1. צנטריפוגה התווך המותנה שנאסף של VSMCs ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת תאים¹⁴.
2. צנטריפוגו את הסופרנאטנט ב-33,000 × גרם למשך 30 דקות, אספו את הסופרנאטנט והעבירו אותו לצינור חדש.
   הערה: ניתן לאשר את נוכחותם של כלי רכב חשמליים בסופרנאטנט שנאסף באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) או ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)
3. הכינו תמיסה סטרילית חד-בסיסית של נתרן פוספט בנפח 300 מילימטר (NaH₂PO₄). סנן את התמיסה כדי להבטיח תנאים סטריליים במידת הצורך.
4. הוסף 1% (v/v) של 300 mM NaH₂PO₄ לדגימות EV, ופפט בעדינות את התמיסה כדי לערבב היטב. מעבירים 200 μL של תמיסת התערובת לצלחת של 96 בארות. לדגור את צלחת 96 בארות בקורא microplate ב 37 ° C.
5. הגדר את קורא הלוחות להקליט את הבליעה באורך גל של 340 ננומטר כל דקה.

4. הערכת היווצרות מינרלים הסתיידות של שלפוחיות חוץ תאיות עם הידרוג'ל קולגן

הערה: צבירה של כלי רכב חשמליים והיווצרות מיקרו-הסתיידויות נצפות באמצעות הידרוג'ל קולגן. הידרוג'לים אלה פועלים כפיגום המחקה את צפיפות הקולגן שנצפתה in vivo¹⁵. זה מדגים את ההשפעה של קולגן על צמיחת הסתיידות. הפרוטוקול להערכת היווצרות מינרלים של כלי רכב חשמליים בהידרוג'לים הוא כדלקמן:

1. יום 1
   1. הכינו תמיסת קולגן במינון 2.5 מ"ג/מ"ל ב-DMEM. הוסיפו באיטיות 5M נתרן הידרוקסידי לתערובת קולגן/DMEM עד שהצבע משתנה לאדום. בדוק כי ה- pH של הפתרון הוא כ 7.
      הערה: אם הפתרון הופך לסגול והופך לבסיסי מדי, הפעל מחדש את התהליך.
   2. פיפטה 300 μL של תמיסת קולגן 2.5 מ"ג / מ"ל עם pH של 7 לתוך כל באר של זכוכית 8 באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ לחות מבוקרת למשך 72 שעות.
2. יום 4
   1. הוסף 300 μL של DMEM כבקרה לתוך הבארות.
   2. הוסף 300 μL של דגימות בינוניות EV שנאספו בעבר לבארות הנותרות.
   3. יש לדגור בלחות מבוקרת של 37°C ו-5% CO₂ למשך 6 ימים.
3. יום 10
   1. הכינו 2.5 μL של Osteosense 680EX עם 22.5 μL של DMEM.
   2. פיפטה 2.5 μL של תערובת Osteosense ו- DMEM לכל באר. יש לדגור בלחות מבוקרת של 37°C ו-5% CO₂ למשך 24 שעות.
4. יום 11
   1. דמיינו את ההידרוג'לים עם פילטרים המתאימים לפלואורסצנטיות של אוסטאוסנס. דמיינו אותם דרך החלק התחתון של תא זכוכית באמצעות מיקרוסקופ הפוך או מלמעלה עם מטרה למרחק עבודה ארוך.
   2. הערך את מספר ההסתיידויות ואת גודל ההסתיידות בתמונות שנאספו באמצעות אפשרויות ניתוח החלקיקים הזמינות ב- ImageJ.
      1. השתמש בתמונה | התאמה | הפקודה 'סף' לבינאריזציה של התמונות כך שרק אות Osteosense יופיע לבן. השתמש בניתוח | הפקודה 'נתח חלקיקים ' לקבלת מידע לכל הסתיידות בתמונה. הקפד להשתמש באותם פרמטרי סף עבור כל תמונה שנותחה לקבלת עקביות.

תוצאות

לאחר חילוץ אבי העורקים, הדמיה באמצעות סורק אופטי אינפרא-אדום קרוב מראה ייצוג חזותי של אבי העורקים כמו גם של הסתיידות כלי הדם (איור 1). ערכי עוצמת הפיקסלים בתמונה הפלואורסצנטית הסרוקה מייצגים את התפלגות ההסתיידות ומוצגים כאן באמצעות מפת חום צבעונית. שיטות הכימות כוללות זיהו...

Discussion

בעת ביצוע הפרוטוקול, חשוב לציין את השלבים הקריטיים להשגת תוצאות מוצלחות. במהלך הבידוד של אבי העורקים murine, זה חיוני כי זילוח מבוצע כראוי. בעת הזרקת PBS, יש להקפיד לא לנקב את החדר הימני. זה יגרום לנוזל לדלוף ישירות מהחדר ולא לזרום דרך הריאות, מה שמשאיר דם בתוך אבי העורקים. לאחר שהזילוח בוצע כראו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153