Hücre Dışı Vezikül Aracılı Vasküler Kalsifikasyonun In Vitro ve In Vivo Modeller Kullanılarak Analizi

Özet

Bu yazıda, murin aortlarının izole edilmesi, ardından mineralizasyon potansiyelini gözlemlemek için kalsifiye hücre dışı veziküllerin ekstraksiyonu ile vasküler kalsifikasyonun elde edilmesi ve değerlendirilmesi için metodoloji sunulmaktadır.

Özet

Kardiyovasküler hastalık dünyada önde gelen ölüm nedenidir ve vasküler kalsifikasyon kardiyovasküler olayların en önemli belirleyicisidir; Bununla birlikte, şu anda vasküler kalsifikasyon için herhangi bir tedavi veya terapötik seçenek bulunmamaktadır. Kalsifikasyon, kalsiyum ve fosfat iyonlarını toplayarak çekirdeklendirici odaklar olarak işlev gören özel hücre dışı veziküller (EV'ler) içinde başlar. Bu protokol, murin aortlarda kalsifikasyonun elde edilmesi ve değerlendirilmesi ve ilişkili ekstrakte edilen EV'lerin analizi için yöntemleri açıklamaktadır. İlk olarak, farenin brüt diseksiyonu, böbrekler, karaciğer ve akciğerler gibi ilgili organları toplamak için gerçekleştirilir. Daha sonra murin aort izole edilir ve aort kökünden femoral artere eksize edilir. İki ila üç aort daha sonra, ilgilenilen EV'leri izole etmek için ultrasantrifüjlemeye tabi tutulmadan önce bir sindirim çözeltisinde toplanır ve inkübe edilir. Daha sonra, EV'lerin mineralizasyon potansiyeli, yüksek fosfatlı bir çözeltide inkübasyon ve ışık emiciliğinin 340 nm dalga boyunda ölçülmesi yoluyla belirlenir. Son olarak, kollajen hidrojelleri, EV'ler tarafından in vitro olarak üretilen kalsifiye mineral oluşumunu ve olgunlaşmasını gözlemlemek için kullanılır.

Giriş

Kalsifikasyon kardiyovasküler hastalık mortalite ve morbiditesinin en önemli belirleyicisidir¹. Kalsifikasyon, kalsiyum ve fosfat minerallerinin birikmesi nedeniyle arteriyel duvar mekaniğini değiştirir². Aterosklerozda, kalsifikasyon lokal stresi şiddetlendirebilir ve kalp krizinin önde gelen nedeni olan plak rüptürüne neden olabilir. Genellikle kronik böbrek hastalığından kaynaklanan medial kalsifikasyon daha yaygındır ve önemli arteriyel sertleşme, disfonksiyon ve kardiyak aşırı yüklenmeye yol açar ^2,3. Şu anda, vasküler kalsifikasyonun tedavisi veya önlenmesi için terapötik bir seçenek yoktur.

Vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler) osteoblast benzeri bir fenotip benimser ve yeni ortaya çıkan mineralleri çekirdeklendiren kalsifiye hücre dışı vezikülleri (EV'ler) serbest bırakır, böylece kalsifikasyonu ^{yönlendirir 4,5,6}. Bu süreç, kemik^7'deki osteoblastların fizyolojik mineralizasyonuna benzer. Mineralizasyonun son noktası vasküler duvar ve kemik matrisinde benzer olmasına rağmen, kalsifiye edici EV'lerin ortaya çıktığı mekanizmalar iki dokuda farklılık gösterir⁸. Vasküler kalsifikasyonu incelemek için kullanılan birçok model türü vardır. In vitro, hücre kültürü modelleri, VSMC'lerin osteojenik geçişini ve ardından özel ortamlarla mineral oluşumunu taklit eder.

İn vivo kalsifikasyon çalışırken, kullanılan model çalışılan kalsifikasyon tipine bağlıdır. Hiperlipidemik fare modelleri, lipid bakımından zengin plaklarda daha fokal görünen aterosklerotik kalsifikasyonu incelemek için sıklıkla kullanılır⁹. Buna karşılık, medial kalsifikasyon vaskülatür boyunca daha yaygındır ve sıklıkla böbrek yetmezliğini indüklemek için adenden bakımından zengin bir diyet rejimi veya böbreklerin önemli kısımlarını çıkarmak için cerrahi teknikler kullanan kronik böbrek hastalığı modelleri kullanılarak incelenir^10,11. Agresif vasküler kalsifikasyon modelleri, hem hiperlipidemik hem de kronik böbrek hastalığı modellerinin bir kombinasyonunu kullanmıştır¹². Bu protokol, hem medial hem de aterosklerotik kalsifikasyon için murin aortlarda vasküler kalsifikasyonun değerlendirilmesi, aort duvarından EV'lerin çıkarılması ve in vitro hücre kültürü modellerinden elde edilen EV'lerdeki mineralizasyon potansiyelinin gözlemlenmesi için bir yöntem sağlar. Gelecekteki çalışmalar bu prosedürleri vasküler kalsifikasyonun mekanik analizlerinde ve potansiyel terapötik müdahaleleri değerlendirmek için kullanabilir.

Protokol

In vivo çalışma, Florida Uluslararası Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve denetlenmiş ve mevcut Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) kurallarına uygun hale getirilmiştir. Bu protokol için prosedür, farenin gerginliğine, ağırlığına, yaşına ve cinsiyetine bağlı olarak farklılık göstermez. İncelenen kalsifikasyon türü, diyetler ve tedaviler, çalışmanın uzunluğunu ve kullanılan farenin ağırlığını değiştirebilir ve çalışmada kullanılan farenin belirli bir suşuna ve cinsiyetine bağlı olabilir. Bu protokol için hem erkek hem de dişi C57BL/6J fareler kullanıldı ve kalsifikasyon diyetiyle beslendiler. Fareler 20 hafta ile 24 haftalıkken kurban edildi.

1. Aortun izolasyonu ve eksizyonu

1. Floresan işaretleyiciler
   1. Ötanaziden kırk sekiz saat önce, farelere intravenöz enjeksiyon yoluyla 25 g başına önerilen 100 μL dozda floresan bir görüntüleme ajanı olan 20 μM OsteoSense 680 enjekte edin.
   2. Duman başlığının altına, dört t-pimli bir strafor tahtası, kağıt havluyla kaplı bir kova, kağıt havluyla doldurulmuş 50 mL'lik bir tüp, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü, diseksiyon aletleri ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir sprey şişesine etanol yerleştirin. PBS'li beherleri buzun üzerine yerleştirin.
2. Kan alımı
   1. Kağıt havluyla doldurulmuş 50 mL'lik konik bir tüpe 2 mL izofluran ekleyin. Tüpü kovaya yerleştirin ve kapağıyla kapatın.
      DİKKAT: İzoflurane, kısa süreli maruz kalmanın toksisitesi nedeniyle egzoz havasının devridaimi olmayan, iyi havalandırılan bir alanda kullanılmalıdır.
   2. Her seferinde bir fareyi kovaya aktarın. Yatıştırıldıktan sonra, fareyi sırt pozisyonunda kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Fareyi baskın olmayan elin avucuyla tutarak, başparmağınızı ve işaretçi parmağınızı kullanarak kulakları geri yerleştirin.
   3. Cımbızı kullanarak, gözlerden birini tüketin. Kan alımına başlamak için fareyi 1,5 mL tüpün üzerinde tutun, bu sırada 1 mL kan toplanmalıdır. Kan boşalmayı durdurduğunda, daha fazla sedasyon için fareyi kovaya geri yerleştirin.
3. Ötanazi
   1. Diseksiyon paspasının üzerine bir kağıt havlu yerleştirin. Fare yatıştırıldıktan sonra, fareyi paspasın üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Her bir uzuvda basılı tutmak için bir t-pimi kullanarak fareyi sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
   2. Farenin karnına alkolle püskürtün. Cımbızı kullanarak göğüs bölgesindeki cildi kaldırın. Makasla, medial çizgiyi göğüs boşluğuna kesin. Sternum merkezden kesildikten sonra, göğüs kafesinin her iki tarafındaki diyaframı kesin.
   3. Gerekirse, kalbi ve akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs kafesinin ön kısmını kesin.
4. Organ çıkarma
   1. Cımbız kullanarak cildi kaldırın ve orta hatta bir kesi yapın. Fazla deri veya yağları çıkarın. Üreme organlarını ve mesanenin yanı sıra orta hattın dışındaki herhangi bir yağı çıkarın.
   2. Gastrointestinal (GI) organları sağ tarafa taşıyın ve orta hattaki bağırsakları takip edin. Bulunduğunda, orta hattı kaldırın ve GI kanalını mideye kadar tüketin.
   3. Böbrekleri orta hattan uzaklaştırarak tüketin. Böbreğe mümkün olduğunca yakın kesin.
   4. Daha sonra, lobları kaldırarak ve orta hattan keserek karaciğerin çıkarılmasına başlayın.
   5. Kalbi ve aortu perfüze edin. 10 mL'lik bir şırınga kullanarak, sağ ventriküle soğuk PBS enjekte edin. Akciğerlerin şişmesini ve beyaza dönmesini bekleyin. Akciğerlerin yanı sıra fazla diyafram veya göğüs kafesini çıkarın.
5. Kemik çıkarılması
   1. Geniş bir çift makas açın ve bunları kuyruğun üstündeki farenin alt bölgesine yerleştirin. Aşağı doğru kesin ve omurgayı deriden kaldırmaya başlayın. Yağı orta hattın yanlarından çıkarın. Cilt ayrıldıktan sonra, kalbin hemen üzerinde keserek omurgayı ve sağlam organları çıkarın. Bir stereoskoba taşınıyorsa, omurgayı ve sağlam organları buz kovasındaki bir PBS kabına yerleştirin.
   2. Omurgayı ve organları diseksiyon kabına taşıyın. Buz gibi PBS ile doldurun. İğneleri kullanarak omurgayı ve göğüs kafesini sabitleyin.
   3. Diseksiyon mikroskobu altında, kalbi dikkatlice kaldırmak için cımbız kullanın ve omurganın üstünde ve aortun altında kesmeye başlayın. Omurganın dibine ulaşana kadar buna devam edin. Omurgayı diseksiyon kabından çıkarın ve kalbi ve herhangi bir yabancı yağ veya kası sabitleyin.
6. Mikrodiseksiyon
   1. Kalbin hemen altındaki bölgeden başlayarak, üç boru şeklindeki yapıyı tanımlayın: yemek borusu, vena kava ve aort. Aortun net bir görme alanına sahip olmak için yemek borusunu ve vena kavayı çıkarın.
   2. Mikrodiseksiyon forseps ve makas kullanarak, yağ dokusunu kaldırmaya ve aort mümkün olduğunca yakın kesmeye başlayın. Aortu kesmediğinizden emin olun. Tüm aort ve femoral arterler açığa çıkana kadar bunu medial çizgiden aşağı doğru devam ettirin.
   3. Kalpte, tüm yağ dokusunu çıkarın ve aort arkındaki üç dalı açığa çıkarın. Mikrodiseksiyon makasını sol ventriküle sokarak ve aortu çevreleyen kası keserek aort kökünü sol ventrikülden çıkarın.
   4. Aort izole edildikten ve temizlendikten sonra, vasküler kalsifikasyonu görselleştirmek için yakın kızılötesi bir tarayıcı kullanarak aortu görüntüleyin.
   5. Toplam taranan aort alanına normalleştirilen kalsiyum izleyicinin toplam sinyalini ölçmek için özel MATLAB komut dosyasını (Ek Dosya 1) kullanın. MATLAB komut dosyası, Bioinformatics araç kutusu eklentisini kullanarak işlev görür. MATLAB, önce aortların yakın kızılötesi taramasından TIFF dosyalarının konumuna yönlendirilir, daha sonra tek tek dosyalar açılır ve piksel yoğunluğu değerleri TIFF dosyalarından çıkarılır.
      1. Görüntü kullanıcıya bir renk haritası ile sunulduktan sonra, ölçek maksimum olarak en büyük kireçlenmeye sahip aortu seçin.
      2. MATLAB, komut penceresinde "Görüntüde kaç örnek var?" diye sorduğunda, geçerli görüntüdeki aort sayısını girin ve her bir aortu tek tek seçin. Bir aort seçildikten sonra, MATLAB, aortun toplam alanının maskesi ile ikili bir görüntü ve aortun kalsifiye alanının maskesi ile başka bir ikili görüntü oluşturacaktır. Bu maskelenmiş görüntülerden elde edilen değerler daha sonra toplam kalsifiye alanı, aortun toplam alanını, kalsifikasyon için pozitif olan yüzde alanını ve kalsifiye alanın ortalama yoğunluğunu belirlemek için kullanılır.
      3. Bir aort seçmek için, tek bir sol tıklama ile dört köşeyi seçip görüntünün etrafında bir kutu oluşturarak ekrandaki en son figürde ilgilendiğiniz aortun etrafında bir kutu oluşturun. Kutuyu kapatmak için, ilk köşeyi çift tıklatın.
         NOT: Eşik, kullanılan kireçlenme modeline bağlı olarak farklı olabilir. Hangi değerin vasküler kalsifikasyon için pozitif bir sinyal belirlediğini belirlemek kullanıcıya kalmıştır. Bir deneme için eşik ayarlandıktan sonra, deneme süresi boyunca aynı kalmalıdır.
   6. Kantitatif veriler çıkarıldıktan sonra, gruplar arasındaki önemi göstermek için Tukey'in post-hoc testi ile tek yönlü bir ANOVA gerçekleştirin.

2. EV'lerin aortlardan izole edilmesi ve çıkarılması

NOT: Aortlar izole edildikten ve çıkarıldıktan sonra, EV'ler dokudan çıkarılabilir. Bir sindirim çözeltisi ve çoklu santrifüj döngüleri kullanarak, EV'ler toplanabilir ve kalsifikasyon testleri, jel elektroforezi ve immünoblotlama¹³ dahil olmak üzere birçok farklı teknik için kullanılabilir. EV'leri izole etmek ve çıkarmak için protokol aşağıdaki gibidir:

1. Aortları taradıktan hemen sonra, yeterli protein konsantrasyonu elde etmek için iki ila üç aort toplayın.
2. 0.25 M sakaroz, 0.12 M sodyum klorür (NaCl), 0.01 M potasyum klorür (KCl), 0.02 M Tris hidroklorür ve 600 U / mL kollajenaz¹³ içeren bir sindirim çözeltisi hazırlayın.
3. İki ila üç havuzlanmış aortu 1.5 mL sindirim çözeltisinde 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin. Çözümü toplayın. Hücre kalıntılarını gidermek için çözeltiyi 15 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüj yapın.
4. Mikro-parçacıkları çıkarmak için süpernatantı 33.000 × g'de 30 dakika daha santrifüj yapın. Kalsifikasyon potansiyeli için süpernatantı toplayın ve değerlendirin (bkz. bölüm 3).
   NOT: EV'lerin jel elektroforezi ve protein immünoblotlaması yapılacaksa sonraki adımları izleyin.
5. İlgilenilen EV'leri izole etmek için süpernatantı 1 saat boyunca 100.000 × g'de ultrasantrifüj yapın.
6. Süpernatant ultrasantrifüjlemeye tabi tutulurken, proteaz inhibitörü ve vorteksyen eklenerek çözünene kadar RIPA lizis ve ekstraksiyon tamponu hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
7. Ultrasantrifüjleme tamamlandıktan sonra, EV'leri içeren peleti bırakarak süpernatanı aspire edin. Pelet, hazırlanan RIPA lizis ve proteaz inhibitörü karışımında askıya alın. Numuneler jel elektroforezi ve batı lekelenmesi için hazırdır.

3. Işık saçılma absorbansı ile hücre dışı veziküllerin kalsifikasyon potansiyelinin değerlendirilmesi

NOT: EV'lerin gerçek zamanlı mineral oluşumunu ölçmek için, başlangıçta hücre kültürü^14'ten büyüme plakası kıkırdak EV'lerinden mineral oluşumunu incelemek için geliştirilen bir tahlil kullandık. Kalsiyum fosfat birikimi kalsifikasyonun ayırt edici özelliği olduğundan, kalsiyum fosfat bileşiği oluşumunun sonucu olarak ışık saçılma emilimindeki artış, kalsifikasyon potansiyelinin göstergesidir¹⁴. İn vitro VSMC modelleri, EV'lerin kireçlenme potansiyelini ölçmek için uygundur. Bu teknikte, kısa dalga boyu filtreli bir plaka okuyucu, EV'lerin in vitro kalsifikasyonunu ölçebilir. Emicilik okuması 340 nm'de kaydedilir ve daha yüksek bir emilim daha fazla kalsiyum fosfat mineral oluşumunun göstergesidir. Işık saçılma absorbans testi için protokol aşağıdaki gibidir:

1. Hücre kalıntılarını çıkarmak için VSMC'lerin şartlandırılmış toplanan ortamını 1.000 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj^{edin 14}.
2. Süpernatantı 30 dakika boyunca 33.000 × g'de santrifüj edin, süpernatanı toplayın ve yeni bir tüpe aktarın.
   NOT: Toplanan süpernatanttaki EV'lerin varlığı, dinamik ışık saçılması (DLS) veya nanopartikül izleme analizi (NTA) ile doğrulanabilir.
3. 300 mM sodyum fosfat monobazik (NaH₂PO₄) steril çözelti hazırlayın. Gerekirse steril koşulları sağlamak için çözeltiyi filtreleyin.
4. EV numunelerine 300 mM NaH₂PO_4'ün %1'ini (v/d) ekleyin ve iyice karıştırmak için çözeltiyi nazikçe pipetleyin. Karışım çözeltisinin 200 μL'sini 96 delikli bir plakaya aktarın. 96 delikli plakayı mikroplaka okuyucusunda 37 °C'de inkübe edin.
5. Plaka okuyucuyu, absorbansı her 1 dakikada bir 340 nm dalga boyunda kaydedecek şekilde ayarlayın.

4. Kollajen hidrojelleri ile hücre dışı veziküllerin kalsifikasyon mineral oluşumunun değerlendirilmesi

NOT: EV'lerin toplanması ve mikrokalsifikasyonların oluşumu kollajen hidrojelleri aracılığıyla gözlenir. Bu hidrojeller, in vivo 15'te gözlenen kollajen yoğunluğunu taklit eden bir iskele görevi ^görür. Bu, kollajenin kalsifikasyon büyümesi üzerindeki etkisini göstermektedir. Hidrojellerde EV'lerin mineral oluşumunu değerlendirmek için protokol aşağıdaki gibidir:

1. 1. Gün
   1. DMEM'de 2.5 mg / mL'lik bir kollajen çözeltisi hazırlayın. Renk kırmızıya dönene kadar kollajen/DMEM karışımına yavaşça 5 M sodyum hidroksit ekleyin. Çözeltinin pH'ının yaklaşık 7 olduğunu kontrol edin.
      NOT: Çözüm mora dönerse ve çok basit hale gelirse, işlemi yeniden başlatın.
   2. 8 delikli hazneli camın her bir kuyucuğuna pH 7 olan 2,5 mg/mL kollajen çözeltisinin 300 μL'lik pipeti. 37 °C ve %5 CO 2 kontrollü nemde₇₂ saat boyunca inkübe edin.
2. 4. Gün
   1. Kuyucuklara kontrol olarak 300 μL DMEM ekleyin.
   2. Daha önce toplanan EV ortam örneklerinin 300 μL'sini kalan kuyucuklara ekleyin.
   3. 6 gün boyunca 37 °C ve %5 CO₂ kontrollü nemde inkübe edin.
3. 10. Gün
   1. 22.5 μL DMEM ile 2.5 μL Osteosense 680EX hazırlayın.
   2. Her bir kuyucuğa Osteosense ve DMEM karışımının 2.5 μL'lik pipeti. 37 °C ve %5 CO 2 kontrollü nemde₂₄ saat boyunca inkübe edin.
4. 11. Gün
   1. Hidrojelleri Osteosense floresan için uygun filtrelerle görüntüleyin. Bunları ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak bir kapak camı odasının altından veya uzun bir çalışma mesafesi hedefiyle üstten görüntüleyin.
   2. ImageJ'de bulunan Partikül Analizi seçeneklerini kullanarak toplanan görüntülerdeki kireçlenme sayısını ve kireçlenme boyutunu değerlendirin.
      1. Resmi Kullan | Ayarlama | Görüntüleri yalnızca Osteosense sinyali beyaz görünecek şekilde ikileştirmek için eşik komutu. Analiz'i kullanma | Görüntüdeki her kireçlenme için bilgi edinmek üzere parçacıkları analiz et komutu. Tutarlılık için analiz edilen her görüntü için aynı eşik parametrelerini kullandığınızdan emin olun.

Sonuçlar

Aortlar çıkarıldıktan sonra, yakın kızılötesi optik tarayıcı kullanılarak yapılan görüntüleme, aortun yanı sıra vasküler kalsifikasyonun görsel bir temsilini gösterir (Şekil 1). Taranan floresan görüntüdeki piksel yoğunluğu değerleri, kireçlenmenin dağılımını temsil eder ve burada renkli bir ısı haritası kullanılarak gösterilir. Niceleme yöntemleri, pozitif bir eşik belirlemeyi ve aortun yüzde alanını bu eşik değerinden daha büyük değerlerle ra...

Tartışmalar

Protokolü gerçekleştirirken, başarılı sonuçlar elde etmek için kritik adımları not etmek önemlidir. Murin aortun izolasyonu sırasında, perfüzyonun uygun şekilde yapılması hayati önem taşır. PBS'yi enjekte ederken, sağ ventrikülün delinmemesine dikkat edilmelidir. Bu, sıvının doğrudan ventrikülden sızmasına ve akciğerlerde dolaşamamasına ve aort içinde kan bırakmasına neden olur. Perfüzyon düzgün bir şekilde yapıldıktan ve mikrodiseksiyon başladıktan sonra, tamamlanmadan ve tara...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153