Анализ внеклеточной везикуло-опосредованной кальцификации сосудов с использованием моделей in vitro и in vivo

Резюме

В данной работе представлена методика получения и оценки кальцификации сосудов путем выделения мышиных аорт с последующим извлечением кальцинированных внеклеточных везикул для наблюдения за потенциалом минерализации.

Аннотация

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти в мире, а кальцификация сосудов является наиболее значимым предиктором сердечно-сосудистых событий; Тем не менее, в настоящее время нет лечения или терапевтических вариантов кальцификации сосудов. Кальцификация начинается в специализированных внеклеточных везикулах (ВВ), которые служат очагами зарождения путем агрегации ионов кальция и фосфата. В этом протоколе описываются методы получения и оценки кальцификации в мышиных аортах и анализа связанных с ними извлеченных ВВ. Во-первых, грубое вскрытие мыши выполняется для сбора любых соответствующих органов, таких как почки, печень и легкие. Затем мышиная аорта изолируется и иссекается от корня аорты до бедренной артерии. Затем две-три аорты объединяют и инкубируют в пищеварительном растворе перед ультрацентрифугированием для выделения интересующих ВВ. Затем потенциал минерализации электромобилей определяют путем инкубации в растворе с высоким содержанием фосфатов и измерения поглощения света на длине волны 340 нм. Наконец, коллагеновые гидрогели используются для наблюдения за образованием и созреванием кальцинированных минералов, производимых EV in vitro.

Введение

Кальцификация является наиболее значимым предиктором смертности и заболеваемости сердечно-сосудистыми заболеваниями¹. Кальцификация изменяет механику артериальной стенки из-за накопления кальциевых и фосфатных минералов². При атеросклерозе кальцификация может усугубить местный стресс и привести к разрыву бляшек, что является основной причиной сердечных приступов. Медиальная кальцификация, часто возникающая в результате хронического заболевания почек, более распространена и приводит к значительной артериальной жесткости, дисфункции и перегрузке сердца ^2,3. В настоящее время не существует терапевтических вариантов лечения или профилактики кальцификации сосудов.

Сосудистые гладкомышечные клетки (VSMC) принимают остеобластоподобный фенотип и высвобождают кальцифицирующие внеклеточные везикулы (EV), которые зарождают зарождающиеся минералы, тем самым вызывая кальцификацию ^4,5,6. Этот процесс напоминает физиологическую минерализацию остеобластов в кости⁷. Хотя конечная точка минерализации одинакова в сосудистой стенке и костном матриксе, механизмы, с помощью которых возникают кальцифицирующие EV, различаются в двух тканях⁸. Существует множество типов моделей, которые используются для изучения кальцификации сосудов. Модели клеточных культур in vitro имитируют остеогенный переход VSMC и последующее образование минералов со специализированными средами.

При изучении кальцификации in vivo используемая модель зависит от типа изучаемой кальцификации. Модели гиперлипидемических мышей часто используются для изучения атеросклеротической кальцификации, которая проявляется более фокальной в богатых липидами бляшках⁹. Напротив, медиальная кальцификация более распространена по всей сосудистой сети и часто изучается с использованием моделей хронической болезни почек, в которых используется режим диеты, богатый аденином, чтобы вызвать почечную недостаточность, или хирургические методы удаления значительных частей почек^10,11. Агрессивные модели кальцификации сосудов использовали комбинацию моделей как гиперлипидемической, так и хронической болезни почек¹². Этот протокол предоставляет метод оценки кальцификации сосудов в мышиных аортах как для медиальной, так и для атеросклеротической кальцификации, извлечения EV из стенки аорты и наблюдения за потенциалом минерализации в EV, полученных из моделей клеточных культур in vitro. Будущие исследования могут использовать эти процедуры в механистическом анализе кальцификации сосудов и для оценки потенциальных терапевтических вмешательств.

протокол

Работа in vivo была одобрена и контролировалась Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Международном университете Флориды и соответствовала текущим рекомендациям Национальных институтов здравоохранения (NIH). Для этого протокола процедура не отличается в зависимости от штамма, веса, возраста и пола мыши. Тип изучаемой кальцификации, диеты и методы лечения могут изменять продолжительность исследования и вес используемой мыши и могут зависеть от конкретного штамма и пола мыши, используемой в исследовании. Для этого протокола использовались как самцы, так и самки мышей C57BL / 6J, и их кормили кальцификационной диетой. Мыши были принесены в жертву в возрасте от 20 до 24 недель.

1. Изоляция и иссечение аорты

1. Флуоресцентные маркеры
   1. За сорок восемь часов до эвтаназии введите мышам 20 мкМ OsteoSense 680, флуоресцентный агент визуализации, в рекомендуемой дозе 100 мкл на 25 г посредством внутривенной инъекции.
   2. Под вытяжной шкаф поместите доску из пенополистирола с четырьмя Т-образными штифтами, ведро, выстланное бумажным полотенцем, пробирку объемом 50 мл, набитую бумажным полотенцем, микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл, инструменты для вскрытия (см. Таблицу материалов) и этанол в пульверизаторе. Поставьте стаканы с PBS на лед.
2. Забор крови
   1. Добавьте 2 мл изофлурана в коническую пробирку объемом 50 мл, набитую бумажным полотенцем. Поместите трубку в ведро и закройте ее крышкой.
      ВНИМАНИЕ: Изофлуран следует обрабатывать в хорошо проветриваемом помещении без рециркуляции отработанного воздуха из-за токсичности кратковременного воздействия.
   2. Переносите по одной мыши в ведро за раз. После успокоения положите мышь на бумажное полотенце в спинном положении. Удерживая мышь ладонью недоминантной руки, отведите уши назад с помощью большого и указательного пальцев.
   3. С помощью пинцета иссеките один из глазков. Держите мышь над пробиркой объемом 1,5 мл, чтобы начать сбор крови, во время которого следует собрать 1 мл крови. Как только кровь перестанет стекать, поместите мышь обратно в ведро для дальнейшего успокоения.
3. Эвтаназия
   1. Положите бумажное полотенце на коврик для рассечения. Как только мышь успокоится, положите мышь на коврик в положение лежа на спине. Закрепите мышь в положении лежа на спине с помощью Т-образного штифта, чтобы удерживать каждую конечность.
   2. Сбрызните живот мыши спиртом. С помощью пинцета поднимите кожу в области груди. Ножницами срежьте медиальную линию в грудную полость. После того, как грудина была срезана по центру, разрежьте диафрагму по обе стороны от грудной клетки.
   3. При необходимости отрежьте лобную часть грудной клетки, чтобы обнажить сердце и легкие.
4. Удаление органа
   1. С помощью пинцета приподнимите кожу и сделайте надрез по средней линии. Удалите лишнюю кожу или жир. Удалите репродуктивные органы и мочевой пузырь, а также любой жир за пределами средней линии.
   2. Переместите органы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) на правую сторону и следуйте за кишечником по средней линии. После обнаружения поднимите среднюю линию и иссеките желудочно-кишечный тракт до живота.
   3. Иссекайте почки, отрывая их от средней линии. Разрежьте как можно ближе к почкам.
   4. Далее приступают к удалению печени, приподнимая доли и отрезая от средней линии.
   5. Перфузия сердца и аорты. Используя шприц объемом 10 мл, введите холодный PBS в правый желудочек. Подождите, пока легкие надуются и побелеют. Удалите легкие, а также любую лишнюю диафрагму или грудную клетку.
5. Удаление кости
   1. Широко раскройте ножницы и поместите их в нижнюю часть мыши над хвостом. Срежьте вниз и начните отрывать позвоночник от кожи. Удалите жир с боков средней линии. Как только кожа отслоится, иссеките позвоночник и неповрежденные органы, разрезав прямо над сердцем. При транспортировке к стереоскопу поместите позвоночник и неповрежденные органы в стакан PBS в ведре со льдом.
   2. Переместите позвоночник и органы в рассекающую посуду. Залейте ледяным PBS. Придавите позвоночник и грудную клетку с помощью игл.
   3. Под микроскопом для вскрытия используйте пинцет, чтобы осторожно поднять сердце, и начните разрезать над позвоночником и под аортой. Продолжайте это до тех пор, пока не достигнете нижней части позвоночника. Удалите позвоночник из рассекающей чашки и прижмите сердце и любой посторонний жир или мышцу.
6. Микродиссекция
   1. Начиная с области прямо под сердцем, определите три трубчатые структуры: пищевод, полую вену и аорту. Удалите пищевод и полую вену, чтобы иметь четкое поле зрения аорты.
   2. Используя щипцы и ножницы для микродиссекции, начните поднимать жировую ткань и резать как можно ближе к аорте. Следите за тем, чтобы не перерезать аорту. Продолжайте это вниз по медиальной линии, пока не обнажится вся аорта, а также бедренные артерии.
   3. В сердце удаляют всю жировую ткань, обнажая три ветви у дуги аорты. Удалите корень аорты из левого желудочка, вставив ножницы для микродиссекции в левый желудочек и разрезав мышцу, окружающую аорту.
   4. После того, как аорта изолирована и очищена, визуализируйте аорту с помощью сканера ближнего инфракрасного диапазона, чтобы визуализировать кальцификацию сосудов.
   5. Используйте пользовательский сценарий MATLAB (дополнительный файл 1) для количественной оценки общего сигнала кальциевого индикатора, который нормализуется к общей просканированной площади аорты. Сценарий MATLAB функционирует с помощью надстройки набора инструментов Bioinformatics. MATLAB сначала направляется к расположению файлов TIFF из ближнего инфракрасного сканирования аорты, затем открываются отдельные файлы, а значения интенсивности пикселей извлекаются из файлов TIFF.
      1. После того, как изображение будет представлено пользователю с помощью цветовой карты, выберите аорту с наибольшей кальцификацией в качестве максимума масштаба.
      2. Когда MATLAB спрашивает «Сколько образцов на изображении?» в командном окне, введите количество аорт на текущем изображении и выберите каждую аорту одну за другой. После выбора аорты MATLAB создаст двоичное изображение с маской общей площади аорты и еще одно двоичное изображение с маской кальцинированной области аорты. Значения из этих замаскированных изображений затем используются для определения общей кальцинированной площади, общей площади аорты, процентной площади, положительной для кальцификации, и средней интенсивности кальцинированной области.
      3. Чтобы выбрать аорту, сделайте рамку вокруг интересующей аорты на самом последнем рисунке на экране, выбрав четыре угла одним щелчком левой кнопки мыши и создав рамку вокруг изображения. Чтобы закрыть поле, дважды щелкните по первому углу.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Порог может отличаться в зависимости от используемой модели кальцификации. Пользователь сам определяет, какое значение определяет положительный сигнал для кальцификации сосудов. После того, как пороговое значение установлено для эксперимента, оно должно оставаться неизменным на протяжении всего эксперимента.
   6. После того, как количественные данные извлечены, выполните одностороннюю ANOVA с помощью постфактум-теста Тьюки, чтобы показать значимость между группами.

2. Выделение и извлечение ЭВ из аорты

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как аорты были изолированы и удалены, EV могут быть извлечены из ткани. Используя пищеварительный раствор и несколько циклов центрифуги, EV можно собирать и использовать для множества различных методов, включая анализы кальцификации, гель-электрофорез и иммуноблоттинг¹³. Протокол изоляции и извлечения электромобилей выглядит следующим образом:

1. Сразу после сканирования аорты объедините две-три аорты, чтобы получить достаточную концентрацию белка.
2. Приготовьте пищеварительный раствор, содержащий 0,25 М сахарозы, 0,12 М хлорида натрия (NaCl), 0,01 М хлорида калия (KCl), 0,02 М гидрохлорида триса и 600 Ед/мл коллагеназы¹³.
3. Инкубируйте две-три объединенные аорты в 1,5 мл пищеварительного раствора в течение 2 ч при 37 ° C. Соберите раствор. Центрифугируют раствор при 1000 × г в течение 15 мин для удаления клеточного мусора.
4. Центрифугируйте надосадочную жидкость в течение дополнительных 30 мин при 33 000 × г для удаления микровезикул. Соберите и оцените надосадочную жидкость на потенциал кальцификации (см. раздел 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги, если необходимо провести гель-электрофорез и белковый иммуноблоттинг ЭВ.
5. Ультрацентрифугируют надосадочную жидкость в дозе 100 000 × г в течение 1 ч, чтобы изолировать интересующие ВВ.
6. В то время как надосадочная жидкость подвергается ультрацентрифугированию, приготовьте буфер для лизиса и экстракции RIPA (см. Таблицу материалов), добавив ингибитор протеазы и вихрь до растворения.
7. После завершения ультрацентрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя гранулу, содержащую электромобили. Суспендируйте гранулу в подготовленной смеси ингибиторов лизиса и протеазы RIPA. Образцы готовы к гель-электрофорезу и вестерн-блоттингу.

3. Оценка потенциала кальцификации внеклеточных везикул с поглощением светорассеивания

ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения минерального образования EV в режиме реального времени мы использовали анализ, первоначально разработанный для изучения образования минералов из EV хряща ростовой пластины из клеточной культуры¹⁴. Поскольку осаждение фосфата кальция является отличительной чертой кальцификации, увеличение поглощения светорассеяния в результате образования соединения фосфата кальция свидетельствует о потенциале кальцификации¹⁴. В пробирке Модели VSMC удобны для измерения потенциала кальцификации электромобилей. В этом методе считыватель пластин с коротковолновым фильтром может количественно оценить кальцификацию электромобилей in vitro . Показания абсорбционной способности регистрируются на длине волны 340 нм, а более высокое поглощение свидетельствует о большем образовании минералов фосфата кальция. Протокол анализа поглощения светорассеяния выглядит следующим образом:

1. Центрифугируют кондиционированную собранную среду VSMCs при 1000 × г в течение 5 мин для удаления клеточного мусора¹⁴.
2. Центрифугируют надосадочную жидкость при 33 000 × г в течение 30 мин, собирают надосадочную жидкость и переносят ее в новую пробирку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие EV в собранном надосадочной жидкости может быть подтверждено с помощью динамического рассеяния света (DLS) или анализа отслеживания наночастиц (NTA)
3. Приготовьте стерильный раствор одноосновного фосфата натрия 300 мМ (₂PO₄). При необходимости отфильтруйте раствор, чтобы обеспечить стерильные условия.
4. Добавьте 1% (об./об.) 300 мМ₂PO₄ к образцам EV и аккуратно пипеткой раствор для хорошего перемешивания. Перелейте 200 мкл раствора смеси на 96-луночную пластину. Инкубируйте 96-луночную пластину в считывателе микропланшетов при температуре 37 °C.
5. Настройте считыватель пластин на запись поглощения на длине волны 340 нм каждые 1 минуту.

4. Оценка кальцификационного минерального образования внеклеточных везикул с помощью гидрогелей коллагена

ПРИМЕЧАНИЕ: Агрегация EV и образование микрокальцификаций наблюдаются через гидрогели коллагена. Эти гидрогели действуют как каркас, имитирующий плотность коллагена, наблюдаемую in vivo¹⁵. Это демонстрирует влияние коллагена на рост кальцификации. Протокол оценки минерального образования ЭВ в гидрогелях выглядит следующим образом:

1. День 1
   1. Приготовьте раствор коллагена 2,5 мг/мл в DMEM. Медленно добавляйте 5 М гидроксида натрия в смесь коллагена и ДМЭМ, пока цвет не изменится на красный. Убедитесь, что рН раствора составляет примерно 7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если решение становится фиолетовым и становится слишком простым, перезапустите процесс.
   2. Пипетка 300 мкл раствора коллагена 2,5 мг/мл с рН 7 в каждую лунку 8-луночного камерного стакана. Инкубировать при 37 °C и контролируемой влажности 5% CO₂ в течение 72 часов.
2. День 4
   1. Добавьте 300 мкл DMEM в качестве контроля в лунки.
   2. Добавьте 300 мкл предварительно собранных образцов среды EV в оставшиеся лунки.
   3. Инкубировать при 37 ° C и контролируемой влажности 5% CO₂ в течение 6 дней.
3. День 10
   1. Приготовьте 2,5 мкл Osteosense 680EX с 22,5 мкл DMEM.
   2. Пипетка 2,5 мкл смеси Osteosense и DMEM в каждую лунку. Инкубировать при 37 °C и контролируемой влажности 5% CO₂ в течение 24 часов.
4. День 11
   1. Изображение гидрогелей с помощью фильтров, подходящих для флуоресценции Osteosense. Визуализируйте их через нижнюю часть камеры из покровного стекла с помощью перевернутого микроскопа или сверху с объективом с большим рабочим расстоянием.
   2. Оцените количество кальцификаций и размер кальцификации на собранных изображениях с помощью опций анализа частиц , доступных в ImageJ.
      1. Используйте изображение | Отрегулируйте | Команда threshold для бинаризации изображений таким образом, чтобы только сигнал Osteosense выглядел белым. Используйте функцию «Анализировать» | Анализировать частицы, чтобы получить информацию для каждой кальцификации на изображении. Обязательно используйте одни и те же пороговые параметры для каждого изображения, анализируемого для согласованности.

Результаты

После извлечения аорты визуализация с использованием оптического сканера ближнего инфракрасного диапазона показывает визуальное представление аорты, а также кальцификации сосудов (рис. 1). Значения интенсивности пикселей в отсканированном флуоресцентном изображени?...

Обсуждение

При выполнении протокола важно отметить критические шаги для получения успешных результатов. Во время изоляции мышиной аорты жизненно важно, чтобы перфузия выполнялась должным образом. При введении PBS необходимо соблюдать осторожность, чтобы не проколоть правый желудочек. Это привед?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153