Analyse de la calcification vasculaire extracellulaire à médiation vésiculaire à l’aide de modèles in vitro et in vivo

Résumé

Cet article présente la méthodologie pour obtenir et évaluer la calcification vasculaire en isolant les aortes murines suivie de l’extraction des vésicules extracellulaires calcifiées pour observer le potentiel de minéralisation.

Résumé

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde, et la calcification vasculaire est le prédicteur le plus important des événements cardiovasculaires; Cependant, il n’existe actuellement aucun traitement ou option thérapeutique pour la calcification vasculaire. La calcification commence dans des vésicules extracellulaires spécialisées (VE), qui servent de foyers de nucléation en agrégeant les ions calcium et phosphate. Ce protocole décrit les méthodes permettant d’obtenir et d’évaluer la calcification dans les aortes murines et d’analyser les VE extraites associées. Tout d’abord, la dissection grossière de la souris est effectuée pour collecter tous les organes pertinents, tels que les reins, le foie et les poumons. Ensuite, l’aorte murine est isolée et excisée de la racine aortique à l’artère fémorale. Deux à trois aortes sont ensuite regroupées et incubées dans une solution digestive avant de subir une ultracentrifugation pour isoler les VE d’intérêt. Ensuite, le potentiel de minéralisation des VE est déterminé par incubation dans une solution à haute teneur en phosphate et mesure de l’absorbance de la lumière à une longueur d’onde de 340 nm. Enfin, les hydrogels de collagène sont utilisés pour observer la formation et la maturation des minéraux calcifiés produits par les VE in vitro.

Introduction

La calcification est le prédicteur le plus significatif de la mortalité et de la morbidité par maladie cardiovasculaire¹. La calcification modifie la mécanique de la paroi artérielle en raison de l’accumulation de minéraux de calcium et de phosphate². Dans l’athérosclérose, la calcification peut exacerber le stress local et entraîner la rupture de la plaque, qui est la principale cause de crises cardiaques. La calcification médiale, souvent due à une maladie rénale chronique, est plus répandue et entraîne un raidissement artériel important, un dysfonctionnement et une surcharge cardiaque ^2,3. Actuellement, il n’existe aucune option thérapeutique pour le traitement ou la prévention de la calcification vasculaire.

Les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) adoptent un phénotype semblable à celui des ostéoblastes et libèrent des vésicules extracellulaires calcifiantes (VE) qui nucléent les minéraux naissants, entraînant ainsi la calcification ^4,5,6. Ce processus ressemble à la minéralisation physiologique des ostéoblastes dans l’os⁷. Bien que le critère d’évaluation de la minéralisation soit similaire dans la paroi vasculaire et la matrice osseuse, les mécanismes par lesquels les VE calcifiants proviennent diffèrent dans les deux tissus⁸. Il existe de nombreux types de modèles utilisés pour étudier la calcification vasculaire. In vitro, les modèles de culture cellulaire imitent la transition ostéogénique des VSMC et la formation subséquente de minéraux avec des milieux spécialisés.

Lors de l’étude de la calcification in vivo, le modèle utilisé dépend du type de calcification étudié. Des modèles murins hyperlipidémiques sont souvent utilisés pour étudier la calcification athéroscléreuse, qui apparaît plus focale dans les plaques riches en lipides⁹. En revanche, la calcification médiale est plus répandue dans tout le système vasculaire et est souvent étudiée à l’aide de modèles de maladie rénale chronique qui utilisent un régime riche en adénine pour induire une insuffisance rénale ou des techniques chirurgicales pour enlever des parties importantes des reins^10,11. Les modèles agressifs de calcification vasculaire ont utilisé une combinaison de modèles d’hyperlipidémie et d’insuffisance rénale chronique¹². Ce protocole fournit une méthode pour évaluer la calcification vasculaire dans les aortes murines pour la calcification médiale et athéroscléreuse, extraire les VE de la paroi aortique et observer le potentiel de minéralisation dans les VE obtenus à partir de modèles de culture cellulaire in vitro. Les études futures pourront utiliser ces procédures dans les analyses mécanistes de la calcification vasculaire et pour évaluer les interventions thérapeutiques potentielles.

Protocole

Le travail in vivo a été approuvé et supervisé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Florida International University et conforme aux directives actuelles des National Institutes of Health (NIH). Pour ce protocole, la procédure ne diffère pas en fonction de la souche, du poids, de l’âge et du sexe de la souris. Le type de calcification étudié, les régimes alimentaires et les traitements peuvent modifier la durée de l’étude et le poids de la souris utilisée et peuvent dépendre d’une souche spécifique et du sexe de la souris utilisée dans l’étude. Pour ce protocole, des souris C57BL / 6J mâles et femelles ont été utilisées, et elles ont été nourries avec un régime de calcification. Les souris ont été sacrifiées entre 20 semaines et 24 semaines.

1. Isolement et excision de l’aorte

1. Marqueurs fluorescents
   1. Quarante-huit heures avant l’euthanasie, injectez aux souris 20 μM d’OsteoSense 680, un agent d’imagerie fluorescent, à la dose recommandée de 100 μL par 25 g par injection intraveineuse.
   2. Sous la hotte, placez un panneau de polystyrène expansé muni de quatre épingles en T, un seau tapissé d’une serviette en papier, un tube de 50 ml rempli d’une serviette en papier, un tube à microcentrifugeuses de 1,5 mL, des outils de dissection (voir le tableau des matières) et de l’éthanol dans un vaporisateur. Placez les béchers avec PBS sur la glace.
2. Prise de sang
   1. Ajouter 2 mL d’isoflurane dans un tube conique de 50 mL bourré avec le papier absorbant. Placez le tube dans le seau et fermez-le avec son couvercle.
      MISE EN GARDE : L’isoflurane doit être manipulé dans un espace bien ventilé sans recirculation de l’air évacué en raison de la toxicité d’une exposition à court terme.
   2. Transférez une souris dans le compartiment à la fois. Une fois sous sédation, placez la souris sur la serviette en papier en position dorsale. En tenant la souris avec la paume de la main non dominante, placez les oreilles en arrière à l’aide du pouce et du doigt pointeur.
   3. À l’aide de la pince à épiler, excisez l’un des yeux. Tenez la souris au-dessus du tube de 1,5 mL pour commencer le prélèvement sanguin, au cours duquel 1 mL de sang doit être prélevé. Une fois que le sang cesse de s’écouler, replacez la souris dans le seau pour une sédation supplémentaire.
3. Euthanasie
   1. Placez une serviette en papier sur le tapis de dissection. Une fois la souris sous sédation, placez-la sur le tapis en décubitus dorsal. Fixez la souris en décubitus dorsal à l’aide d’une broche en T pour maintenir chaque membre enfoncé.
   2. Vaporisez de l’alcool sur l’abdomen de la souris. À l’aide de la pince à épiler, soulevez la peau au niveau de la région thoracique. Avec les ciseaux, coupez la ligne médiale dans la cavité thoracique. Une fois que le sternum a été coupé au centre, coupez le diaphragme de chaque côté de la cage thoracique.
   3. Si nécessaire, coupez la partie frontale de la cage thoracique pour exposer le cœur et les poumons.
4. Prélèvement d’organes
   1. À l’aide d’une pince à épiler, soulevez la peau et faites une incision le long de la ligne médiane. Enlevez tout excès de peau ou de graisse. Retirez les organes reproducteurs et la vessie, ainsi que toute graisse à l’extérieur de la ligne médiane.
   2. Déplacez les organes gastro-intestinaux (GI) vers la droite et suivez les intestins dans la ligne médiane. Une fois trouvé, soulevez la ligne médiane et excisez le tractus gastro-intestinal jusqu’à l’estomac.
   3. Extrayez les reins en les soulevant loin de la ligne médiane. Couper le plus près possible du rein.
   4. Ensuite, commencez l’ablation du foie en soulevant les lobes et en coupant loin de la ligne médiane.
   5. Perfuser le cœur et l’aorte. À l’aide d’une seringue de 10 mL, injecter du PBS froid dans le ventricule droit. Attendez que les poumons se gonflent et deviennent blancs. Retirez les poumons, ainsi que tout excès de diaphragme ou de cage thoracique.
5. Ablation osseuse
   1. Ouvrez une paire de ciseaux en grand et placez-les dans la partie inférieure de la souris au-dessus de la queue. Coupez vers le bas et commencez à soulever la colonne vertébrale de la peau. Enlevez la graisse des côtés de la ligne médiane. Une fois que la peau est détachée, excisez la colonne vertébrale et les organes intacts en coupant juste au-dessus du cœur. Si vous transportez vers un stéréoscope, placez la colonne vertébrale et les organes intacts dans un bécher de PBS dans le seau à glace.
   2. Déplacez la colonne vertébrale et les organes dans le plat de dissection. Remplir de PBS glacé. Épinglez la colonne vertébrale et la cage thoracique à l’aide d’aiguilles.
   3. Sous le microscope à dissection, utilisez une pince à épiler pour soulever le cœur avec précaution et commencez à couper au-dessus de la colonne vertébrale et sous l’aorte. Continuez jusqu’à ce que le bas de la colonne vertébrale soit atteint. Retirez la colonne vertébrale du plat de dissection et épinglez le cœur et toute graisse ou muscle étranger.
6. Microdissection
   1. En partant de la zone située juste en dessous du cœur, identifiez les trois structures tubulaires: l’œsophage, la veine cave et l’aorte. Retirez l’œsophage et la veine cave pour avoir un champ visuel clair de l’aorte.
   2. À l’aide de la pince à microdissection et des ciseaux, commencez à soulever le tissu adipeux et à couper le plus près possible de l’aorte. Assurez-vous de ne pas couper l’aorte. Continuez ceci le long de la ligne médiale jusqu’à ce que toutes les artères de l’aorte ainsi que les artères fémorales soient exposées.
   3. Au cœur, retirez tout le tissu adipeux, exposant les trois branches de l’arc aortique. Retirez la racine aortique du ventricule gauche en insérant les ciseaux de microdissection dans le ventricule gauche et en coupant le muscle entourant l’aorte.
   4. Une fois l’aorte isolée et nettoyée, imagez l’aorte à l’aide d’un scanner proche infrarouge pour visualiser la calcification vasculaire.
   5. Utilisez le script MATLAB personnalisé (fichier supplémentaire 1) pour quantifier le signal total du traceur de calcium, qui est normalisé à la surface totale de l’aorte scannée. Le script MATLAB fonctionne à l’aide du complément de la boîte à outils Bioinformatics. MATLAB est d’abord dirigé vers l’emplacement des fichiers TIFF à partir de l’analyse proche infrarouge des aortes, les fichiers individuels sont ensuite ouverts et les valeurs d’intensité en pixels sont extraites des fichiers TIFF.
      1. Une fois l’image présentée à l’utilisateur avec une carte de couleurs, sélectionnez l’aorte avec la plus grande calcification comme échelle maximale.
      2. Lorsque MATLAB demande « Combien de spécimens y a-t-il dans l’image ? » dans la fenêtre de commande, saisissez le nombre d’aortes dans l’image actuelle et sélectionnez chaque aorte une par une. Une fois l’aorte sélectionnée, MATLAB crée une image binaire avec un masque de la surface totale de l’aorte et une autre image binaire avec un masque de la zone calcifiée de l’aorte. Les valeurs de ces images masquées sont ensuite utilisées pour déterminer la surface calcifiée totale, la surface totale de l’aorte, le pourcentage de surface positive pour la calcification et l’intensité moyenne de la zone calcifiée.
      3. Pour sélectionner une aorte, créez une boîte autour de l’aorte d’intérêt sur la figure la plus récente à l’écran en sélectionnant quatre coins avec un clic gauche et en créant une boîte autour de l’image. Pour fermer la boîte, double-cliquez sur le premier coin.
         NOTE: Le seuil peut être différent selon le modèle de calcification utilisé. Il appartient à l’utilisateur de déterminer quelle valeur détermine un signal positif pour la calcification vasculaire. Une fois le seuil fixé pour une expérience, il doit rester le même pendant toute la durée de l’expérience.
   6. Une fois les données quantitatives extraites, effectuez une ANOVA unidirectionnelle avec le test post-hoc de Tukey pour montrer l’importance entre les groupes.

2. Isoler et extraire les VE des aortes

REMARQUE: Une fois que les aortes ont été isolées et enlevées, les VE peuvent être extraits du tissu. À l’aide d’une solution digestive et de plusieurs cycles de centrifugeuses, les VE peuvent être collectés et utilisés pour de nombreuses techniques différentes, y compris les tests de calcification, l’électrophorèse sur gel et l’immunoblotting¹³. Le protocole d’isolement et d’extraction des véhicules électriques est le suivant :

1. Immédiatement après avoir scanné les aortes, mettez deux à trois aortes pour obtenir une concentration suffisante en protéines.
2. Préparer une solution digestive contenant 0,25 M de saccharose, 0,12 M de chlorure de sodium (NaCl), 0,01 M de chlorure de potassium (KCl), 0,02 M de chlorhydrate de tris et 600 U/mL de collagénase¹³.
3. Incuber deux à trois aortes regroupées dans 1,5 mL de solution digestive pendant 2 h à 37 °C. Récupérez la solution. Centrifuger la solution à 1 000 × g pendant 15 min pour éliminer les débris cellulaires.
4. Centrifuger le surnageant pendant 30 minutes supplémentaires à 33 000 × g pour enlever les microvésicules. Recueillir et évaluer le potentiel de calcification du surnageant (voir rubrique 3).
   REMARQUE: Suivez les étapes suivantes si l’électrophorèse sur gel et l’immunoblotissement des protéines des VE doivent être effectués.
5. Ultracentrifuger le surnageant à 100 000 × g pendant 1 h pour isoler les VE d’intérêt.
6. Pendant que le surnageant subit une ultracentrifugation, préparer la lyse RIPA et le tampon d’extraction (voir le tableau des matériaux) en ajoutant l’inhibiteur de protéase et en tourbillonnant jusqu’à dissolution.
7. Une fois l’ultracentrifugation terminée, aspirer le surnageant, en laissant la pastille, qui contient les VE. Suspendre la pastille dans le mélange préparé de lyse RIPA et d’inhibiteur de protéase. Les échantillons sont prêts pour l’électrophorèse sur gel et le Western blotting.

3. Évaluation du potentiel de calcification des vésicules extracellulaires avec absorbance de diffusion de la lumière

REMARQUE: Pour mesurer la formation minérale en temps réel des VE, nous avons utilisé un test développé à l’origine pour étudier la formation de minéraux à partir de VE de cartilage sur plaque de croissance à partir de culture cellulaire¹⁴. Étant donné que le dépôt de phosphate de calcium est la caractéristique de la calcification, une augmentation de l’absorbance de diffusion de la lumière résultant de la formation de composés de phosphate de calcium est indicative du potentiel de calcification¹⁴. In vitro Les modèles VSMC sont pratiques pour mesurer le potentiel de calcification des véhicules électriques. Dans cette technique, un lecteur de plaques avec un filtre à courte longueur d’onde peut quantifier la calcification in vitro des véhicules électriques. La valeur absorbante est enregistrée à 340 nm, et une absorbance plus élevée indique une formation minérale de phosphate de calcium plus importante. Le protocole du test d’absorbance par diffusion de la lumière est le suivant :

1. Centrifuger le milieu collecté conditionné des VSMC à 1 000 × g pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires¹⁴.
2. Centrifuger le surnageant à 33 000 × g pendant 30 min, recueillir le surnageant et le transférer dans un nouveau tube.
   REMARQUE: La présence de VE dans le surnageant collecté peut être confirmée par diffusion dynamique de la lumière (DLS) ou analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
3. Préparer une solution stérile de phosphate de sodium monobasique de 300 mM (_NaH2PO4). Filtrer la solution pour assurer des conditions stériles si nécessaire.
4. Ajouter 1 % (v/v) de 300 mM NaH₂PO₄ aux échantillons de VE et pipeter doucement la solution pour bien mélanger. Transférer 200 μL de la solution de mélange dans une plaque de 96 puits. Incuber la plaque de 96 puits dans le lecteur de microplaques à 37 °C.
5. Réglez le lecteur de plaques pour enregistrer l’absorbance à une longueur d’onde de 340 nm toutes les 1 min.

4. Évaluation de la formation minérale de calcification des vésicules extracellulaires avec des hydrogels de collagène

NOTE: L’agrégation des VE et la formation de microcalcifications sont observées à travers les hydrogels de collagène. Ces hydrogels agissent comme un échafaudage qui imite la densité de collagène observée in vivo¹⁵. Cela démontre l’effet du collagène sur la croissance de la calcification. Le protocole d’évaluation de la formation minérale de VE dans les hydrogels est le suivant:

1. Jour 1
   1. Préparer une solution de collagène à 2,5 mg/mL dans du DMEM. Ajouter lentement l’hydroxyde de sodium 5 M au mélange collagène/DMEM jusqu’à ce que la couleur passe au rouge. Vérifiez que le pH de la solution est d’environ 7.
      REMARQUE: Si la solution devient violette et devient trop basique, redémarrez le processus.
   2. Pipeter 300 μL de la solution de collagène à 2,5 mg/mL avec un pH de 7 dans chaque puits d’un verre de chambre à 8 puits. Incuber à 37 °C et 5% CO₂ humidité contrôlée pendant 72 h.
2. Jour 4
   1. Ajouter 300 μL de DMEM comme témoin dans les puits.
   2. Ajouter 300 μL des échantillons de milieu EV prélevés précédemment dans les puits restants.
   3. Incuber à 37 °C et 5% CO₂ d’humidité contrôlée pendant 6 jours.
3. Jour 10
   1. Préparer 2,5 μL d’Osteosense 680EX avec 22,5 μL de DMEM.
   2. Pipeter 2,5 μL du mélange Osteosense et DMEM dans chaque puits. Incuber à 37 °C et 5% CO₂ humidité contrôlée pendant 24 h.
4. Jour 11
   1. Imagez les hydrogels avec des filtres appropriés pour la fluorescence Osteosense. Imagez-les à travers le bas d’une chambre de verre à l’aide d’un microscope inversé ou à partir du haut avec un objectif à longue distance de travail.
   2. Évaluez le nombre de calcifications et la taille de calcification dans les images collectées à l’aide des options d’analyse des particules disponibles dans ImageJ.
      1. Utiliser l’image | Ajuster | Commande de seuil pour binariser les images de sorte que seul le signal Osteosense apparaisse blanc. Utiliser l’analyse | Commande d’analyse des particules pour obtenir des informations pour chaque calcification dans l’image. Veillez à utiliser les mêmes paramètres de seuil pour chaque image analysée à des fins de cohérence.

Résultats

Une fois les aortes extraites, l’imagerie à l’aide d’un scanner optique proche infrarouge montre une représentation visuelle de l’aorte ainsi que de la calcification vasculaire (Figure 1). Les valeurs d’intensité en pixels dans l’image fluorescente numérisée représentent la distribution de la calcification et sont affichées ici à l’aide d’une carte thermique colorée. Les méthodes de quantification comprennent l’identification d’un seuil positif et la déclaratio...

Discussion

Lors de l’exécution du protocole, il est important de noter les étapes critiques pour obtenir des résultats positifs. Lors de l’isolement de l’aorte murine, il est essentiel que la perfusion soit effectuée correctement. Lors de l’injection du PBS, il faut veiller à ne pas percer le ventricule droit. Cela provoquerait une fuite du liquide directement hors du ventricule et ne parviendrait pas à circuler dans les poumons, laissant du sang dans l’aorte. Une fois que la perfusion a été effectuée correctemen...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153