Un modelo de fibrilación ventricular a largo plazo en corazones de rata aislados

Resumen

Este protocolo presenta un modelo de fibrilación ventricular a largo plazo en corazones de rata inducida por estimulación continua con corriente alterna de bajo voltaje. Este modelo tiene una alta tasa de éxito, es estable, confiable y reproducible, tiene un bajo impacto en la función cardíaca y solo causa una lesión miocárdica leve.

Resumen

La fibrilación ventricular (FV) es una arritmia fatal con una alta incidencia en pacientes cardíacos, pero la detención de la FV bajo perfusión es un método descuidado de parada intraoperatoria en el campo de la cirugía cardíaca. Con los recientes avances en cirugía cardíaca, la demanda de estudios prolongados de FV bajo perfusión ha aumentado. Sin embargo, el campo carece de modelos animales simples, confiables y reproducibles de fibrilación ventricular crónica. Este protocolo induce FV a largo plazo a través de la estimulación eléctrica de corriente alterna (CA) del epicardio. Se utilizaron diferentes condiciones para inducir la FV, incluida la estimulación continua con un voltaje bajo o alto para inducir una FV a largo plazo y la estimulación durante 5 min con un voltaje bajo o alto para inducir una FV espontánea a largo plazo. Se compararon las tasas de éxito de las diferentes afecciones, así como las tasas de lesión miocárdica y recuperación de la función cardíaca. Los resultados mostraron que la estimulación continua de bajo voltaje indujo FV a largo plazo y que 5 min de estimulación de bajo voltaje indujo FV espontánea a largo plazo con lesión miocárdica leve y una alta tasa de recuperación de la función cardíaca. Sin embargo, el modelo VF a largo plazo de bajo voltaje y estimulado continuamente tuvo una mayor tasa de éxito. La estimulación de alto voltaje proporcionó una mayor tasa de inducción de FV, pero mostró una baja tasa de éxito de desfibrilación, una recuperación deficiente de la función cardíaca y una lesión miocárdica grave. Sobre la base de estos resultados, se recomienda la estimulación continua de CA epicárdica de bajo voltaje por su alta tasa de éxito, estabilidad, confiabilidad, reproducibilidad, bajo impacto en la función cardíaca y lesión miocárdica leve.

Introducción

La cirugía cardíaca generalmente se realiza mediante toracotomía, con bloqueo de la aorta y perfusión con una solución cardiopléjica para detener el corazón. La repetición de la cirugía cardíaca puede ser más difícil que la cirugía inicial, con mayores tasas de complicaciones y mortalidad ^1,2,3. Además, el enfoque de esternotomía mediana convencional puede causar daño a los vasos puente detrás del esternón, la aorta ascendente, el ventrículo derecho y otras estructuras importantes. El sangrado extenso debido a la separación del tejido conectivo, la infección de la herida esternal y la osteomielitis esternal debido a la esternotomía son todas posibles complicaciones. La disección extensa aumenta el riesgo de lesiones y hemorragias en estructuras cardíacas vitales.

Con el desarrollo de la cirugía cardíaca mínimamente invasiva, las incisiones se han vuelto más pequeñas y el paro cardíaco a veces es difícil de lograr. La repetición de la cirugía cardíaca bajo fibrilación ventricular (FV)^4,5 es segura, factible y puede proporcionar una mejor protección miocárdica. Por lo tanto, este protocolo introduce el método de paro cardíaco de FV en cirugía con circulación extracorpórea mínimamente invasiva. El corazón pierde la contracción efectiva durante la FV y, por lo tanto, no hay necesidad de suturar y bloquear la aorta ascendente durante la cirugía, lo que simplifica el procedimiento. Sin embargo, incluso si el corazón se perfunde continuamente, la fibrilación ventricular a largo plazo puede ser perjudicial para el corazón.

A medida que este método se usa más ampliamente, la cuestión de cómo proteger el corazón durante la FV se vuelve cada vez más relevante. Esto requerirá estudios extensos y en profundidad utilizando modelos animales de FV a largo plazo. En el pasado, la investigación en este campo ha utilizado principalmente animales grandes^6,7 y ha requerido la cooperación entre cirujanos^, anestesiólogos, perfusionistas y otros investigadores. Estos estudios tomaron demasiado tiempo, los tamaños de la muestra a menudo fueron pequeños y los estudios generalmente se centraron en la función cardíaca y menos en las evaluaciones mecanicistas y moleculares. Hasta la fecha, ningún estudio ha informado un protocolo detallado para establecer un modelo de FV a largo plazo.

Este protocolo, por lo tanto, proporciona los detalles necesarios para desarrollar un modelo de rata FV a largo plazo utilizando el aparato de Langendorff. El protocolo es simple, económico, repetible y estable.

Protocolo

Todos los procedimientos y protocolos experimentales utilizados en esta investigación fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital General del PLA.

1. Preparación del aparato de Langendorff

1. Prepare el tampón de Krebs-Henseleit (K-H). Para preparar el tampón K-H, agregue lo siguiente al agua destilada: 118.0 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4, 1.2 mM NaH 2 PO₄, 1.8 mM CaCl₂, 25.0 mM NaHCO₃, 11.1 mM glucosa y 0.5 mM EDTA.
2. Preparar el sistema de perfusión Langendorff modificado.
   1. Gasificar continuamente el matraz que contiene tampón K-H con 95%_O2 + 5% CO₂ a una presión de aproximadamente 80 mmHg. Coloque un extremo del tubo de perfusión en el tampón K-H, pase el centro del tubo de perfusión a través del baño de agua y conecte una aguja roma de 20 G al otro extremo del tubo de perfusión.
   2. Suspenda la aguja en un soporte de alambre. Ajuste la temperatura del baño de agua para que la temperatura del tampón K-H desde el final del sistema de perfusión sea de 37.0 °C ± 1.0 °C.

2. Preparación del hardware y software

1. Hardware
   1. Utilice un registrador de señales fisiológicas para digitalizar y registrar todas las señales analógicas. Use dos electrodos de aguja de acero inoxidable para registrar un electrocardiograma bipolar (ECG) y use dos electrodos de aguja de acero inoxidable para la estimulación eléctrica.
   2. Conecte un extremo de los cuatro electrodos al registrador de señales fisiológicas y el otro extremo cerca del área donde se colocará el corazón después de la fijación al aparato.
2. Software
   1. Utilice el software del portátil para reconocer, ajustar y registrar automáticamente el ECG bipolar y los parámetros hemodinámicos. Los parámetros incluyen la diferencia de presión ventricular izquierda (DPVI), la diferencia entre la presión desarrollada del ventrículo izquierdo (DLVI) y la presión diastólica final del ventrículo izquierdo (DLVI), y la frecuencia cardíaca (FC).
   2. Ajuste los parámetros del estimulador eléctrico a 30 Hz CA, con el grupo de baja tensión recibiendo 2 V y el grupo de alta tensión recibiendo 6 V.

3. Preparación del corazón aislado

1. Prepara al animal.
   1. Anestesiar ratas Sprague-Dawley (SD) con isoflurano al 2% después de inyecciones intraperitoneales de 0,05 mg/kg de buprenorfina y 1.000 UI/kg de heparina sódica. Asegúrese de que la rata haya dejado de responder al pellizco del dedo del pie.
   2. Transfiera la rata a una plataforma quirúrgica de animales pequeños, coloque a la rata en posición supina y esterilice el tórax con etanol al 75%.
2. Extirpar el corazón.
   1. Con la rata conectada a un ventilador después de la disección cervical y la intubación traqueal, levante la piel del proceso xifoide con fórceps dentados y haga una incisión transversal de 3 cm en la piel con tijeras de tejido. Extienda las incisiones de la piel y las costillas a las axilas de ambos lados en forma de V.
   2. Refleje el esternón cranealmente con pinzas de tejido para exponer completamente el corazón y los pulmones.
   3. Aísle y disecte sin rodeos el timo usando dos pinzas curvas. Sujete el tejido tímico y desvíelo lateralmente en ambos lados para exponer la aorta y sus ramas.
   4. Utilice fórceps curvos para realizar una separación contundente de la aorta y la arteria pulmonar, facilitando el uso posterior de tijeras oftálmicas para extraer el corazón y suspender el corazón una vez que se ha retirado.
      NOTA: Para aquellos que son nuevos en este procedimiento, se puede omitir el paso 3.2.4.
   5. Use la disección roma para separar el tronco braquiocefálico del tejido circundante. Luego, sujete el tronco braquiocefálico con fórceps curvos para facilitar la extirpación del corazón. Cortar rápidamente la aorta entre el tronco braquiocefálico y la arteria carótida común izquierda. La rata muere tan pronto como se extrae el corazón.
   6. Corte el tejido redundante e inmediatamente sumerja el corazón en una placa de Petri con tampón K-H a 0-4 °C para lavar y bombear la sangre residual.
      NOTA: Se recomienda la transección de la aorta entre el tronco braquiocefálico y la arteria carótida común izquierda porque preservar el tronco permite la identificación de la aorta y la estimación de la profundidad de la canulación .
3. Suspender el corazón.
   1. Transfiera el corazón a una segunda placa de Petri. Identificar la aorta. Use dos pinzas oftálmicas para levantar la aorta e inserte la aguja roma en el aparato de Langendorff.
   2. Ajuste la profundidad aórtica a la posición adecuada. Haga que un asistente ate un nudo con un hilo de sutura 0. Luego, encienda el regulador de flujo de perfusión.
      NOTA: Tenga cuidado de evitar que entren burbujas de aire en el corazón durante todo el procedimiento. Además, tenga en cuenta que el tiempo desde el corte de la aorta hasta la perfusión inicial no debe exceder los 2 minutos.
   3. Inserte un pequeño globo de látex modificado conectado a un transductor de presión en la aurícula izquierda y empuje el globo a través de la válvula mitral hacia el ventrículo izquierdo. Llene el globo con agua destilada para lograr una presión diastólica final de 5-10 mmHg.
   4. Conecte el ECG y los electrodos de estimulación eléctrica al corazón. Luego, coloque el corazón en una cámara de vidrio con camisa para mantener una temperatura interna de 37.0 ° C ± 1.0 ° C.
      NOTA: Utilice los siguientes criterios de exclusión: frecuencia cardíaca <250 latidos por minuto; flujo coronario (ml/min) <10 mL/min o >25 mL/min. Las posiciones de conexión del ECG y del electrodo de estimulación eléctrica se muestran en la Figura 1A, y la cámara de vidrio encamisada se muestra en la Figura 1B.

4. Perfundir y estimular eléctricamente el corazón (Figura 2)

1. Etapa de equilibrio (0-30 min)
   1. Iniciar la perfusión y mantener una temperatura de aproximadamente 37 °C hasta que el corazón lata espontáneamente; Luego, permita que el corazón se equilibre durante 20 minutos.
   2. Ajuste la temperatura del baño de agua para mantener la temperatura dentro de la cámara de vidrio encamisada a aproximadamente 30 ° C.
      NOTA: Todo el proceso de enfriamiento debe durar aproximadamente 10 minutos.
2. Etapa de estimulación eléctrica (30-120 min)
   1. Después de que la temperatura haya alcanzado el nivel deseado, active el interruptor de estimulación eléctrica en el software de la computadora portátil.
      NOTA: El ECG bipolar y la presión ventricular izquierda (LVP) al comienzo de la estimulación eléctrica se muestran en la Figura 3A.
   2. Si el animal es parte del grupo de FV a largo plazo estimulado continuamente, permita 90 minutos de estimulación eléctrica. Si el animal está en el grupo de FV espontánea inducida a largo plazo, permita 5 minutos de estimulación eléctrica, luego apague la estimulación eléctrica y espere 90 minutos para la FV espontánea a largo plazo, como se muestra en la Figura 3B.
      NOTA: Para los corazones en el grupo de FV espontánea a largo plazo que no desarrollan FV espontánea dentro de los 90 minutos después de la estimulación eléctrica, la estimulación eléctrica se apaga ya que no cumplen con los criterios de inclusión.
3. Etapa de recalentamiento, desfibrilación y latido (120-180 min)
   1. Después de 90 min de FV, use electrodos para dar 0.1 J de desfibrilación de corriente continua, como se muestra en la Figura 3C.
   2. Regular simultáneamente la temperatura del baño de agua para permitir que la temperatura aumente lentamente dentro de la cámara de vidrio encamisada a aproximadamente 37 ° C. Continúe el proceso de calentamiento durante aproximadamente 10 minutos.
   3. Después de la desfibrilación, deje que el corazón lata durante 60 minutos y luego detenga los latidos por perfusión lenta con 10% de KCl a aproximadamente 37 °C. Extirpar el corazón para su posterior análisis.
      NOTA: Los corazones que no laten después de la desfibrilación no cumplen con los criterios de inclusión. Además, es importante recoger el derrame coronario antes del enfriamiento (a los 20 min), después de la desfibrilación (a los 120 min) y al final del experimento (a los 180 min).

5. Realización del ensayo de creatina quinasa-MB (CK-MB) y análisis histológico

1. Ensayo CK-MB
   1. Utilice un analizador bioquímico automático y un kit de ensayo comercial de CK-MB para determinar el nivel de CK-MB en el líquido de derrame coronario recogido⁸.
2. Análisis histológico
   1. Fije el corazón en formalina tamponada al 10%, deshidrate el corazón e insértelo en parafina.
   2. Use un micrótomo para cortar el tejido incrustado en parafina en secciones de 5 μm; Luego, monte las secciones en portaobjetos de vidrio y tiñe con hematoxilina y eosina⁹.

Resultados

Un total de 57 ratas fueron utilizadas en los experimentos, de las cuales 30 cumplieron con los criterios de inclusión. Los animales incluidos se dividieron en cinco grupos, con seis animales en cada grupo: el grupo control (Grupo C), el grupo de FV a largo plazo estimulado continuamente de bajo voltaje (Grupo LC), el grupo de FV a largo plazo estimulado continuamente de alto voltaje (Grupo HC), el grupo de FV espontánea a largo plazo inducida por bajo voltaje (Grupo LI) y el grupo de FV espontánea a largo plazo induc...

Discusión

Este protocolo establece un modelo animal de FV a largo plazo en corazones de rata aislados que no se ha informado previamente. Además, se compararon diferentes condiciones de estimulación eléctrica en este estudio. Este estudio proporciona un modelo para estudios relacionados con la detención de la fibrilación ventricular durante la cirugía cardíaca.

La tasa de éxito del modelo es un indicador muy importante que está relacionado con el personal, el tiempo y los costos económicos. En...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Non-absorbable suture	Ethicon, Inc.		Preparation of the isolated heart
95% O2 + 5% CO2	Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd.		K-H buffer
AcqKnowledge software	BIOPAC Systems Inc.	Version 4.2.1	Software
Automatic biochemistry analyzer	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	Chemray 800	CK-MB assay
BIOPAC research systems	BIOPAC Systems Inc.	MP150	Hardware
Blunt needle (20 G, TWLB)	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10005861	K-H buffer
CK-MB assay kits	Changchun Huili Biotech Co., Ltd.	C060	CK-MB assay
Curved forcep	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
EDTA	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10009717	K-H buffer
Electrical stimulator	BIOPAC Systems Inc.	STEMISOC	Hardware
Filter	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	63005518	K-H buffer
Heparin sodium	Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd.	H120200505	Preparation of the isolated heart
Isoflurane	RWD Life Science Co.,LTD	21082201	Preparation of the isolated heart
Magnesium sulfate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20025118	K-H buffer
Needle electrodes	BIOPAC Systems Inc.	EL452	Hardware
Ophthalmic clamp	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Perfusion tube	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Potassium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318	K-H buffer
Sodium bicarbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10018960	K-H buffer
Sodium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10019318	K-H buffer
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20040718	K-H buffer
Sprague-Dawley (SD) rats	SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd.	Male, 300-350g	Preparation of the isolated heart
Thermometer	Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd.	GSP-6	Modified Langendorff perfusion system
Tissueforceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Tissue scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Toothed forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ventilator	Chengdu Instrument Factory	DKX-150	Preparation of the isolated heart
Water bath1	Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd.	SC-15	Modified Langendorff perfusion system
Water bath2	Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Modified Langendorff perfusion system