Ein Modell für Langzeit-Kammerflimmern in isolierten Rattenherzen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein Modell des Langzeit-Kammerflimmerns in Rattenherzen dar, das durch kontinuierliche Stimulation mit Niederspannungswechselstrom induziert wird. Dieses Modell hat eine hohe Erfolgsquote, ist stabil, zuverlässig und reproduzierbar, hat einen geringen Einfluss auf die Herzfunktion und verursacht nur leichte Herzmuskelverletzungen.

Zusammenfassung

Kammerflimmern (VF) ist eine tödliche Arrhythmie mit einer hohen Inzidenz bei Herzpatienten, aber der VF-Stillstand unter Perfusion ist eine vernachlässigte Methode des intraoperativen Stillstands im Bereich der Herzchirurgie. Mit den jüngsten Fortschritten in der Herzchirurgie ist die Nachfrage nach längeren VF-Studien unter Perfusion gestiegen. Es fehlen jedoch einfache, zuverlässige und reproduzierbare Tiermodelle für chronisches Kammerflimmern. Dieses Protokoll induziert eine langfristige VF durch elektrische Stimulation des Epikards mit Wechselstrom (AC). Es wurden verschiedene Bedingungen verwendet, um VF zu induzieren, einschließlich kontinuierlicher Stimulation mit einer niedrigen oder hohen Spannung, um eine langfristige VF zu induzieren, und Stimulation für 5 min mit einer niedrigen oder hohen Spannung, um eine spontane Langzeit-VF zu induzieren. Die Erfolgsraten der verschiedenen Erkrankungen sowie die Raten der Myokardschädigung und der Wiederherstellung der Herzfunktion wurden verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine kontinuierliche Niederspannungsstimulation eine Langzeit-VF induzierte und dass eine 5-minütige Niederspannungsstimulation eine spontane Langzeit-VF mit leichter Myokardschädigung und einer hohen Rate der Wiederherstellung der Herzfunktion induzierte. Das Niederspannungsmodell mit kontinuierlich stimuliertem Langzeit-VF hatte jedoch eine höhere Erfolgsquote. Die Hochspannungsstimulation führte zu einer höheren VF-Induktionsrate, zeigte aber eine geringe Defibrillationserfolgsrate, eine schlechte Wiederherstellung der Herzfunktion und eine schwere Myokardschädigung. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird die kontinuierliche epikardiale AC-Stimulation mit niedriger Spannung aufgrund ihrer hohen Erfolgsrate, Stabilität, Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit, geringen Auswirkungen auf die Herzfunktion und leichten Myokardschädigungen empfohlen.

Einleitung

Herzoperationen werden in der Regel durch Thorakotomie durchgeführt, bei der die Aorta blockiert und mit einer kardioplegischen Lösung durchblutet wird, um das Herz zu stoppen. Wiederholte Herzoperationen können eine größere Herausforderung darstellen als die Erstoperation, mit höheren Komplikations- und Sterblichkeitsraten ^1,2,3. Darüber hinaus kann die konventionelle mediane Sternotomie zu einer Schädigung der Brückengefäße hinter dem Brustbein, der aufsteigenden Aorta, des rechten Ventrikels und anderer wichtiger Strukturen führen. Ausgedehnte Blutungen durch die Durchtrennung des Bindegewebes, eine Infektion der sternalen Wunde und eine sternale Osteomyelitis aufgrund einer Sternotomie sind mögliche Komplikationen. Eine ausgedehnte Dissektion erhöht das Risiko von Läsionen und Blutungen in lebenswichtigen Herzstrukturen.

Mit der Entwicklung der minimalinvasiven Herzchirurgie sind die Schnitte kleiner geworden, und ein Herzstillstand ist manchmal schwer zu erreichen. Eine wiederholte Herzoperation unter Kammerflimmern (VF)^4,5 ist sicher, durchführbar und kann einen besseren Myokardschutz bieten. Daher führt dieses Protokoll die Methode des VF-Herzstillstands in der Chirurgie mit minimalinvasiver extrakorporaler Zirkulation ein. Das Herz verliert während der VF an effektiver Kontraktion, so dass die aufsteigende Aorta während der Operation nicht genäht und blockiert werden muss, was den Eingriff vereinfacht. Doch selbst wenn das Herz kontinuierlich durchblutet wird, kann eine langfristige VF immer noch schädlich für das Herz sein.

Mit der zunehmenden Verbreitung dieser Methode wird die Frage, wie das Herz während der VF geschützt werden kann, immer relevanter. Dies erfordert umfangreiche und eingehende Studien mit Tiermodellen von Langzeit-VF. In der Vergangenheit wurden in der Forschung auf diesem Gebiet meist große Tiere^{verwendet 6,7} und die Zusammenarbeit zwischen Chirurgen, Anästhesisten^, Kardiotechnikern und anderen Forschern erfordert. Diese Studien dauerten zu lange, die Stichprobengrößen waren oft klein, und die Studien konzentrierten sich im Allgemeinen auf die Herzfunktion und weniger auf mechanistische und molekulare Bewertungen. Bis heute gibt es keine Studie, die über ein detailliertes Protokoll zur Etablierung eines langfristigen VF-Modells berichtet hat.

Dieses Protokoll liefert somit die Details, die für die Entwicklung eines Langzeitmodells der VF-Ratte unter Verwendung der Langendorff-Apparatur erforderlich sind. Das Protokoll ist einfach, wirtschaftlich, wiederholbar und stabil.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren und Protokolle, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, wurden vom Animal Care and Use Committee des PLA General Hospital überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung des Langendorff-Apparates

1. Bereiten Sie den Krebs-Henseleit-Puffer (K-H) vor. Zur Herstellung des K-H-Puffers wird destilliertem Wasser Folgendes zugegeben: 118,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM_MgSO4, 1,2 mM_NaH2PO4, 1,8 mM CaCl2, 25,0 mM NaHCO₃, 11,1 mM Glucose und_0,5 mM EDTA.
2. Bereiten Sie das modifizierte Langendorff-Perfusionssystem vor.
   1. Der Kolben mit K-H-Puffer wird kontinuierlich mit 95 % O2 + 5 %_CO2 bei einem Druck von ca. 80 mmHg begast. Legen Sie ein Ende des Perfusionsschlauchs in den K-H-Puffer, führen Sie die Mitte des Perfusionsschlauchs durch das Wasserbad und befestigen Sie eine stumpfe 20-G-Nadel am anderen Ende des Perfusionsschlauchs.
   2. Hängen Sie die Nadel an einem Drahtständer auf. Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades so ein, dass die Temperatur des K-H-Puffers vom Ende des Perfusionssystems 37,0 °C ± 1,0 °C beträgt.

2. Vorbereitung der Hard- und Software

1. Hardware
   1. Verwenden Sie einen physiologischen Signalrekorder, um alle analogen Signale zu digitalisieren und aufzuzeichnen. Verwenden Sie zwei Nadelelektroden aus Edelstahl, um ein bipolares Elektrokardiogramm (EKG) aufzuzeichnen, und verwenden Sie zwei Nadelelektroden aus Edelstahl für die elektrische Stimulation.
   2. Schließen Sie ein Ende der vier Elektroden an den physiologischen Signalschreiber an und das andere Ende in der Nähe des Bereichs, in dem das Herz nach dem Anbringen an das Gerät positioniert wird.
2. Software
   1. Verwenden Sie die Laptop-Software, um das bipolare EKG und die hämodynamischen Parameter automatisch zu erkennen, anzupassen und aufzuzeichnen. Zu den Parametern gehören die linksventrikuläre Druckdifferenz (LVPD), die Differenz zwischen dem linksventrikulären Entwicklungsdruck (LVDP) und dem linksventrikulären enddiastolischen Druck (LVEDP) sowie die Herzfrequenz (HR).
   2. Stellen Sie die Parameter des elektrischen Stimulators auf 30 Hz AC ein, wobei die Niederspannungsgruppe 2 V und die Hochspannungsgruppe 6 V empfängt.

3. Vorbereitung des isolierten Herzens

1. Bereite das Tier vor.
   1. Betäubung von Sprague-Dawley (SD)-Ratten mit 2 % Isofluran nach intraperitonealen Injektionen von 0,05 mg/kg Buprenorphin und 1.000 I.E./kg Heparin-Natrium. Stellen Sie sicher, dass die Ratte aufgehört hat, auf das Kneifen der Zehen zu reagieren.
   2. Übertragen Sie die Ratte auf eine chirurgische Plattform für Kleintiere, legen Sie die Ratte in Rückenlage und sterilisieren Sie den Brustkorb mit 75%igem Ethanol.
2. Schneide das Herz aus.
   1. Wenn die Ratte nach der zervikalen Dissektion und der trachealen Intubation an ein Beatmungsgerät angeschlossen ist, heben Sie die Haut mit einer Zahnzange vom Xipoidfortsatz ab und machen Sie mit einer Gewebeschere einen 3 cm langen Querschnitt in die Haut. Verlängern Sie die Haut- und Rippenschnitte auf beiden Seiten V-förmig bis zu den Achselhöhlen.
   2. Reflektieren Sie das Brustbein kranial mit einer Gewebezange, um Herz und Lunge vollständig freizulegen.
   3. Isolieren und präparieren Sie den Thymus stumpf mit zwei gebogenen Pinzetten. Klemmen Sie das Thymusgewebe ein und lenken Sie es auf beiden Seiten seitlich ab, um die Aorta und ihre Äste freizulegen.
   4. Verwenden Sie eine gekrümmte Pinzette, um eine stumpfe Trennung der Aorta und der Lungenarterie durchzuführen, was die spätere Verwendung einer Augenschere erleichtert, um das Herz zu entfernen und das Herz nach der Entfernung aufzuhängen.
      HINWEIS: Für diejenigen, die mit diesem Verfahren noch nicht vertraut sind, kann Schritt 3.2.4 weggelassen werden.
   5. Verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um den Truncus brachiocephalicus vom umgebenden Gewebe zu trennen. Klemmen Sie dann den Truncus brachiocephalica mit einer gekrümmten Pinzette ein, um die Entfernung des Herzens zu erleichtern. Schnelle Durchtrennung der Aorta zwischen dem Truncus brachiocephalicus und der linken A. carotis communis. Die Ratte stirbt, sobald das Herz entfernt wird.
   6. Schneiden Sie das überflüssige Gewebe ab und tauchen Sie das Herz sofort in eine Petrischale mit K-H-Puffer bei 0-4 °C, um das restliche Blut zu waschen und abzupumpen.
      HINWEIS: Die Durchtrennung der Aorta zwischen dem Truncus brachiocephalicus und der linken Arteria carotis communis wird empfohlen, da die Erhaltung des Truncus die Identifizierung der Aorta und die Abschätzung der Kanülentiefe ermöglicht.
3. Halte das Herz aus.
   1. Übertragen Sie das Herz in eine zweite Petrischale. Identifiziere die Aorta. Heben Sie die Aorta mit zwei Augenzangen an und führen Sie die stumpfe Nadel in den Langendorff-Apparat ein.
   2. Stellen Sie die Aortentiefe auf die entsprechende Position ein. Lassen Sie einen Assistenten einen Knoten mit einem Faden 0 binden. Schalten Sie dann den Perfusionsflussregler ein.
      Anmerkungen: Achten Sie darauf, dass während des gesamten Eingriffs keine Luftblasen in das Herz gelangen. Beachten Sie außerdem, dass die Zeit vom Durchtrennen der Aorta bis zur ersten Perfusion 2 Minuten nicht überschreiten sollte.
   3. Führen Sie einen kleinen modifizierten Latexballon, der mit einem Druckwandler verbunden ist, in den linken Vorhof ein und schieben Sie den Ballon durch die Mitralklappe in die linke Herzkammer. Füllen Sie den Ballon mit destilliertem Wasser, um einen enddiastolischen Druck von 5-10 mmHg zu erreichen.
   4. Schließen Sie das EKG und die Elektrostimulationselektroden an das Herz an. Legen Sie dann das Herz in eine ummantelte Glaskammer, um eine Innentemperatur von 37,0 °C ± 1,0 °C aufrechtzuerhalten.
      HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden Ausschlusskriterien: Herzfrequenz <250 Schläge pro Minute; Koronarer Fluss (ml/min) <10 ml/min oder >25 ml/min. Die Verbindungspositionen des EKGs und der Elektrostimulationselektrode sind in Abbildung 1A und die ummantelte Glaskammer in Abbildung 1B dargestellt.

4. Durchblutung und elektrische Stimulation des Herzens (Abbildung 2)

1. Gleichgewichtsphase (0-30 min)
   1. Beginnen Sie mit der Perfusion und halten Sie eine Temperatur von ca. 37 °C, bis das Herz spontan schlägt. Lassen Sie dann das Herz 20 Minuten lang ausgleichen.
   2. Stellen Sie die Wasserbadtemperatur ein, um die Temperatur in der ummantelten Glaskammer bei ca. 30 °C zu halten.
      Anmerkungen: Der gesamte Kühlvorgang sollte ca. 10 Minuten dauern.
2. Elektrische Stimulationsphase (30-120 min)
   1. Nachdem die Temperatur das gewünschte Niveau erreicht hat, aktivieren Sie den Elektrostimulationsschalter in der Laptop-Software.
      HINWEIS: Das bipolare EKG und der linksventrikuläre Druck (LVP) zu Beginn der elektrischen Stimulation sind in Abbildung 3A dargestellt.
   2. Wenn das Tier Teil der kontinuierlich stimulierten Langzeit-VF-Gruppe ist, lassen Sie 90 Minuten elektrische Stimulation zu. Wenn sich das Tier in der Gruppe der induzierten spontanen Langzeit-VF befindet, lassen Sie 5 Minuten elektrische Stimulation zu, schalten Sie dann die elektrische Stimulation aus und lassen Sie 90 min für spontane Langzeit-VF ein, wie in Abbildung 3B gezeigt.
      HINWEIS: Bei Herzen in der Gruppe der spontanen Langzeit-VF, die innerhalb von 90 min nach der Elektrostimulation keine spontane VF entwickeln, wird die elektrische Stimulation dann abgeschaltet, da sie die Einschlusskriterien nicht erfüllen.
3. Aufwärm-, Defibrillations- und Schlagphase (120-180 min)
   1. Verwenden Sie nach 90 Minuten VF Elektroden, um eine Gleichstromdefibrillation von 0,1 J zu erhalten, wie in Abbildung 3C gezeigt.
   2. Regulieren Sie gleichzeitig die Wasserbadtemperatur, damit die Temperatur in der ummantelten Glaskammer langsam auf ca. 37 °C ansteigt. Setzen Sie den Erwärmungsprozess für ca. 10 Minuten fort.
   3. Lassen Sie das Herz nach der Defibrillation 60 Minuten lang schlagen und stoppen Sie dann den Schlag durch langsame Perfusion mit 10 % KCl bei ca. 37 °C. Entfernen Sie das Herz zur weiteren Analyse.
      HINWEIS: Herzen, die nach der Defibrillation nicht schlagen, erfüllen nicht die Einschlusskriterien. Darüber hinaus ist es wichtig, den Koronarguss vor dem Abkühlen (bei 20 min), nach der Defibrillation (bei 120 min) und am Ende des Experiments (bei 180 min) zu sammeln.

5. Durchführung des Kreatinkinase-MB (CK-MB)-Assays und der histologischen Analyse

1. CK-MB-Assay
   1. Verwenden Sie ein automatisches biochemisches Analysegerät und ein kommerzielles CK-MB-Assay-Kit, um den CK-MB-Spiegel in der entnommenen Koronarfusionsflüssigkeit^{zu bestimmen 8}.
2. Histologische Analyse
   1. Fixieren Sie das Herz in gepuffertem 10%igem Formalin, dehydrieren Sie das Herz und betten Sie es in Paraffin ein.
   2. Verwenden Sie ein Mikrotom, um das in Paraffin eingebettete Gewebe in 5 μm große Abschnitte zu schneiden. Montieren Sie dann die Abschnitte auf Objektträger und färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin⁹.

Ergebnisse

Insgesamt wurden 57 Ratten in den Experimenten verwendet, von denen 30 die Einschlusskriterien erfüllten. Die eingeschlossenen Tiere wurden in fünf Gruppen mit jeweils sechs Tieren eingeteilt: die Kontrollgruppe (Gruppe C), die Niederspannungs-Dauer-VF-Gruppe (Gruppe LC), die Hochspannungs-Dauer-VF-Gruppe (Gruppe HC), die Niederspannungs-induzierte spontane Langzeit-VF-Gruppe (Gruppe LI) und die Hochspannungs-induzierte spontane Langzeit-VF-Gruppe (Gruppe HI). Der experimentelle Prozess für jede Gruppe ist in

Diskussion

Dieses Protokoll etabliert ein Tiermodell für Langzeit-VF in isolierten Rattenherzen, über das bisher noch nicht berichtet wurde. Zusätzlich wurden in dieser Studie verschiedene elektrische Stimulationsbedingungen verglichen. Diese Studie bietet ein Modell für Studien im Zusammenhang mit dem Stillstand von Kammerflimmern während einer Herzoperation.

Die Erfolgsquote des Modells ist ein sehr wichtiger Indikator, der sich auf Personal-, Zeit- und wirtschaftliche Kosten bezieht. Bei VF-Model...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Non-absorbable suture	Ethicon, Inc.		Preparation of the isolated heart
95% O2 + 5% CO2	Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd.		K-H buffer
AcqKnowledge software	BIOPAC Systems Inc.	Version 4.2.1	Software
Automatic biochemistry analyzer	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	Chemray 800	CK-MB assay
BIOPAC research systems	BIOPAC Systems Inc.	MP150	Hardware
Blunt needle (20 G, TWLB)	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10005861	K-H buffer
CK-MB assay kits	Changchun Huili Biotech Co., Ltd.	C060	CK-MB assay
Curved forcep	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
EDTA	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10009717	K-H buffer
Electrical stimulator	BIOPAC Systems Inc.	STEMISOC	Hardware
Filter	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	63005518	K-H buffer
Heparin sodium	Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd.	H120200505	Preparation of the isolated heart
Isoflurane	RWD Life Science Co.,LTD	21082201	Preparation of the isolated heart
Magnesium sulfate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20025118	K-H buffer
Needle electrodes	BIOPAC Systems Inc.	EL452	Hardware
Ophthalmic clamp	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Perfusion tube	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Potassium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318	K-H buffer
Sodium bicarbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10018960	K-H buffer
Sodium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10019318	K-H buffer
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20040718	K-H buffer
Sprague-Dawley (SD) rats	SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd.	Male, 300-350g	Preparation of the isolated heart
Thermometer	Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd.	GSP-6	Modified Langendorff perfusion system
Tissueforceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Tissue scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Toothed forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ventilator	Chengdu Instrument Factory	DKX-150	Preparation of the isolated heart
Water bath1	Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd.	SC-15	Modified Langendorff perfusion system
Water bath2	Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Modified Langendorff perfusion system