Un modèle de fibrillation ventriculaire à long terme dans des cœurs de rats isolés

Résumé

Ce protocole présente un modèle de fibrillation ventriculaire à long terme dans le cœur de rat induite par une stimulation continue avec un courant alternatif basse tension. Ce modèle a un taux de réussite élevé, est stable, fiable et reproductible, a un faible impact sur la fonction cardiaque et ne provoque que des lésions myocardiques légères.

Résumé

La fibrillation ventriculaire (FV) est une arythmie mortelle avec une incidence élevée chez les patients cardiaques, mais l’arrêt de la FV sous perfusion est une méthode négligée d’arrêt peropératoire dans le domaine de la chirurgie cardiaque. Avec les progrès récents de la chirurgie cardiaque, la demande d’études prolongées de FV sous perfusion a augmenté. Cependant, le domaine manque de modèles animaux simples, fiables et reproductibles de fibrillation ventriculaire chronique. Ce protocole induit une FV à long terme par stimulation électrique en courant alternatif (CA) de l’épicarde. Différentes conditions ont été utilisées pour induire la FV, y compris la stimulation continue avec une basse ou haute tension pour induire la FV à long terme et la stimulation pendant 5 minutes avec une tension basse ou haute pour induire une FV spontanée à long terme. Les taux de réussite des différentes affections, ainsi que les taux de lésions myocardiques et de récupération de la fonction cardiaque, ont été comparés. Les résultats ont montré que la stimulation continue à basse tension induisait une FV à long terme et que 5 minutes de stimulation basse tension induisaient une FV spontanée à long terme avec une lésion myocardique légère et un taux élevé de récupération de la fonction cardiaque. Cependant, le modèle VF à basse tension et stimulé en continu à long terme a eu un taux de réussite plus élevé. La stimulation à haute tension a fourni un taux plus élevé d’induction de la FV, mais a montré un faible taux de réussite de la défibrillation, une mauvaise récupération de la fonction cardiaque et une lésion myocardique grave. Sur la base de ces résultats, la stimulation épicardique continue à basse tension est recommandée pour son taux de réussite élevé, sa stabilité, sa fiabilité, sa reproductibilité, son faible impact sur la fonction cardiaque et ses lésions myocardiques légères.

Introduction

La chirurgie cardiaque est généralement réalisée par thoracotomie, avec blocage de l’aorte et perfusion avec une solution cardioplégique pour arrêter le cœur. La chirurgie cardiaque répétée peut être plus difficile que la chirurgie initiale, avec des taux de complications et de mortalité plus élevés ^1,2,3. De plus, l’approche conventionnelle de la sternotomie médiane peut endommager les vaisseaux du pont derrière le sternum, l’aorte ascendante, le ventricule droit et d’autres structures importantes. Des saignements étendus dus à la séparation du tissu conjonctif, une infection de la plaie sternale et une ostéomyélite sternale due à une sternotomie sont toutes des complications possibles. Un curage étendu augmente le risque de lésions et d’hémorragies dans les structures cardiaques vitales.

Avec le développement de la chirurgie cardiaque mini-invasive, les incisions sont devenues plus petites et l’arrêt cardiaque est parfois difficile à réaliser. Une chirurgie cardiaque répétée sous fibrillation ventriculaire (FV)^4,5 est sûre, faisable et peut offrir une meilleure protection du myocarde. Par conséquent, ce protocole introduit la méthode de l’arrêt cardiaque VF en chirurgie avec circulation extracorporelle mini-invasive. Le cœur perd une contraction efficace pendant la FV et, par conséquent, il n’est pas nécessaire de suturer et de bloquer l’aorte ascendante pendant la chirurgie, ce qui simplifie la procédure. Cependant, même si le cœur est continuellement perfusé, la FV à long terme peut toujours être nocive pour le cœur.

Au fur et à mesure que cette méthode devient plus largement utilisée, la question de savoir comment protéger le cœur pendant la FV devient de plus en plus pertinente. Cela nécessitera des études approfondies et approfondies utilisant des modèles animaux de FV à long terme. Dans le passé, la recherche dans ce domaine a surtout utilisé de gros animaux^6,7 et a nécessité la coopération de chirurgiens^, d’anesthésiologistes, de perfusionnistes et d’autres chercheurs. Ces études prenaient trop de temps, la taille des échantillons était souvent petite et les études se concentraient généralement sur la fonction cardiaque et moins sur les évaluations mécanistes et moléculaires. À ce jour, aucune étude n’a rapporté de protocole détaillé pour établir un modèle FV à long terme.

Ce protocole fournit donc les détails nécessaires au développement d’un modèle VF à long terme chez le rat à l’aide de l’appareil de Langendorff. Le protocole est simple, économique, reproductible et stable.

Protocole

Toutes les procédures et protocoles expérimentaux utilisés dans le cadre de cette enquête ont été examinés et approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Hôpital général de l’APL.

1. Préparation de l’appareil Langendorff

1. Préparez le tampon Krebs-Henseleit (K-H). Pour préparer le tampon K-H, ajouter ce qui suit à l’eau distillée : 118,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM NaH₂PO₄, 1,8 mM CaCl2, 25,0 mM NaHCO₃, 11,1 mM glucose et_0,5 mM EDTA.
2. Préparez le système de perfusion Langendorff modifié.
   1. Gazer en continu la fiole contenant le tampon K-H avec 95 %_O2 + 5 % CO₂ à une pression d’environ 80 mmHg. Placez une extrémité du tube de perfusion dans le tampon K-H, passez le milieu du tube de perfusion à travers le bain-marie et fixez une aiguille émoussée de 20 G à l’autre extrémité du tube de perfusion.
   2. Suspendez l’aiguille sur un support en fil de fer. Régler la température du bain-marie de telle sorte que la température du tampon K-H à partir de l’extrémité du système de perfusion soit de 37,0 °C ± 1,0 °C.

2. Préparation du matériel et des logiciels

1. Matériel
   1. Utilisez un enregistreur de signaux physiologiques pour numériser et enregistrer tous les signaux analogiques. Utilisez deux électrodes à aiguille en acier inoxydable pour enregistrer un électrocardiogramme bipolaire (ECG) et utilisez deux électrodes à aiguille en acier inoxydable pour la stimulation électrique.
   2. Connectez une extrémité des quatre électrodes à l’enregistreur de signaux physiologiques et l’autre extrémité près de la zone où le cœur sera positionné après la fixation à l’appareil.
2. Logiciel
   1. Utilisez le logiciel de l’ordinateur portable pour reconnaître, ajuster et enregistrer automatiquement l’ECG bipolaire et les paramètres hémodynamiques. Les paramètres comprennent la différence de pression ventriculaire gauche (LVPD), la différence entre la pression ventriculaire gauche développée (LVDP) et la pression ventriculaire gauche en fin diastolique (LVEDP), et la fréquence cardiaque (HR).
   2. Réglez les paramètres du stimulateur électrique sur 30 Hz AC, le groupe basse tension recevant 2 V et le groupe haute tension recevant 6 V.

3. Préparer le cœur isolé

1. Préparez l’animal.
   1. Anesthésier les rats Sprague-Dawley (SD) avec de l’isoflurane à 2 % après injections intrapéritonéales de 0,05 mg/kg de buprénorphine et de 1 000 UI/kg d’héparine sodique. Assurez-vous que le rat a cessé de répondre au pincement des orteils.
   2. Transférez le rat sur une plate-forme chirurgicale pour petits animaux, placez-le en décubitus dorsal et stérilisez la poitrine avec de l’éthanol à 75%.
2. Excise le cœur.
   1. Avec le rat connecté à un ventilateur après la dissection cervicale et l’intubation trachéale, soulevez la peau du processus xiphoïde avec une pince dentée et faites une incision transversale de 3 cm dans la peau avec des ciseaux tissulaires. Étendez les incisions de la peau et des côtes aux aisselles des deux côtés en forme de V.
   2. Réfléchissez le sternum crânienne avec des pinces tissulaires pour exposer complètement le cœur et les poumons.
   3. Isolez et disséquez carrément le thymus à l’aide de deux pinces incurvées. Serrez le tissu thymique et déviez-le latéralement des deux côtés pour exposer l’aorte et ses branches.
   4. Utilisez des pinces incurvées pour effectuer une séparation émoussée de l’aorte et de l’artère pulmonaire, facilitant l’utilisation ultérieure de ciseaux ophtalmiques pour retirer le cœur et suspendre le cœur une fois qu’il a été retiré.
      Remarque : Pour ceux qui sont nouveaux dans cette procédure, l’étape 3.2.4 peut être omise.
   5. Utilisez une dissection contondante pour séparer le tronc brachiocéphalique des tissus environnants. Ensuite, serrez le tronc brachiocéphalique avec une pince incurvée pour faciliter l’ablation du cœur. Couper rapidement l’aorte entre le tronc brachiocéphalique et l’artère carotide commune gauche. Le rat meurt dès que le cœur est retiré.
   6. Coupez le tissu redondant et immergez immédiatement le cœur dans une boîte de Petri avec un tampon K-H à 0-4 °C pour laver et pomper le sang résiduel.
      NOTE: La transsection de l’aorte entre le tronc brachiocéphalique et l’artère carotide commune gauche est recommandée car la préservation du tronc permet l’identification de l’aorte et l’estimation de la profondeur de la canulation.
3. Suspendez le cœur.
   1. Transférer le cœur dans une deuxième boîte de Pétri. Identifier l’aorte. Utilisez deux pinces ophtalmiques pour soulever l’aorte et insérez l’aiguille émoussée dans l’appareil de Langendorff.
   2. Ajustez la profondeur aortique à la position appropriée. Demandez à un assistant d’attacher un nœud avec un fil de suture 0. Ensuite, allumez le régulateur de débit de perfusion.
      REMARQUE: Prenez soin d’éviter que des bulles d’air ne pénètrent dans le cœur tout au long de la procédure. De plus, sachez que le temps entre la coupe de l’aorte et la perfusion initiale ne doit pas dépasser 2 min.
   3. Insérez un petit ballonnet en latex modifié relié à un transducteur de pression dans l’oreillette gauche et poussez le ballonnet à travers la valve mitrale dans le ventricule gauche. Remplissez le ballon avec de l’eau distillée pour obtenir une pression diastolique terminale de 5-10 mmHg.
   4. Connectez l’ECG et les électrodes de stimulation électrique au cœur. Ensuite, placez le cœur dans une chambre en verre gainé pour maintenir une température interne de 37,0 °C ± 1,0 °C.
      REMARQUE : Utilisez les critères d’exclusion suivants : fréquence cardiaque < 250 battements par minute ; débit coronaire (mL/min) <10 mL/min ou >25 mL/min. Les positions de connexion de l’ECG et de l’électrode de stimulation électrique sont illustrées à la figure 1A, et la chambre en verre gainée est illustrée à la figure 1B.

4. Perfuser et stimuler électriquement le cœur (Figure 2)

1. Stade d’équilibre (0-30 min)
   1. Commencez la perfusion et maintenez une température d’environ 37 °C jusqu’à ce que le cœur batte spontanément; Ensuite, laissez le cœur s’équilibrer pendant 20 minutes.
   2. Ajustez la température du bain-marie pour maintenir la température à l’intérieur de la chambre en verre gainé à environ 30 °C.
      REMARQUE: L’ensemble du processus de refroidissement devrait durer environ 10 minutes.
2. Étape de stimulation électrique (30-120 min)
   1. Une fois que la température a atteint le niveau souhaité, activez l’interrupteur de stimulation électrique sur le logiciel de l’ordinateur portable.
      REMARQUE : L’ECG bipolaire et la pression ventriculaire gauche (PVG) au début de la stimulation électrique sont illustrés à la figure 3A.
   2. Si l’animal fait partie du groupe FV à long terme stimulé en continu, prévoir 90 minutes de stimulation électrique. Si l’animal fait partie du groupe FV spontané induit à long terme, prévoir 5 minutes de stimulation électrique, puis désactiver la stimulation électrique et prévoir 90 minutes pour la FV spontanée à long terme, comme le montre la figure 3B.
      REMARQUE: Pour les cœurs du groupe FV spontané à long terme qui ne développent pas de FV spontanée dans les 90 minutes suivant la stimulation électrique, la stimulation électrique est alors désactivée car ils ne répondent pas aux critères d’inclusion.
3. Étape de réchauffement, défibrillation et battement (120-180 min)
   1. Après 90 min de VF, utiliser des électrodes pour donner 0,1 J de défibrillation en courant continu, comme le montre la figure 3C.
   2. Réguler simultanément la température du bain-marie pour permettre à la température d’augmenter lentement dans la chambre en verre gainée jusqu’à environ 37 °C. Continuez le processus de réchauffement pendant environ 10 min.
   3. Après la défibrillation, laisser battre le cœur pendant 60 minutes, puis arrêter le battement par perfusion lente avec 10% de KCl à environ 37 °C. Retirez le cœur pour une analyse plus approfondie.
      REMARQUE: Les cœurs qui ne battent pas après la défibrillation ne répondent pas aux critères d’inclusion. De plus, il est important de recueillir l’épanchement coronaire avant le refroidissement (à 20 min), après la défibrillation (à 120 min) et à la fin de l’expérience (à 180 min).

5. Réalisation du test de créatine kinase-MB (CK-MB) et de l’analyse histologique

1. Dosage CK-MB
   1. Utiliser un analyseur de biochimie automatique et une trousse commerciale de dosage CK-MB pour déterminer le niveau de CK-MB dans le liquide d’épanchement coronaire^{prélevé 8}.
2. Analyse histologique
   1. Fixez le cœur dans du formol tamponné à 10%, déshydratez le cœur et incorporez-le dans de la paraffine.
   2. Utiliser un microtome pour couper le tissu incorporé dans la paraffine en sections de 5 μm; Ensuite, montez les sections sur des lames de verre et colorez-les avec de l’hématoxyline et de l’éosine⁹.

Résultats

Au total, 57 rats ont été utilisés dans les expériences, dont 30 remplissaient les critères d’inclusion. Les animaux inclus ont été divisés en cinq groupes, avec six animaux dans chaque groupe: le groupe témoin (groupe C), le groupe VF à long terme stimulé en continu à basse tension (groupe LC), le groupe VF à long terme stimulé en continu à haute tension (groupe HC), le groupe VF spontané à long terme induit par basse tension (groupe LI) et le groupe VF spontané à long terme induit par haute tension...

Discussion

Ce protocole établit un modèle animal de FV à long terme dans des cœurs de rats isolés qui n’a pas été signalé auparavant. De plus, différentes conditions de stimulation électrique ont été comparées dans cette étude. Cette étude fournit un modèle pour les études liées à l’arrêt de la fibrillation ventriculaire pendant la chirurgie cardiaque.

Le taux de réussite du modèle est un indicateur très important qui est lié au personnel, au temps et aux coûts économiques. ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Non-absorbable suture	Ethicon, Inc.		Preparation of the isolated heart
95% O2 + 5% CO2	Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd.		K-H buffer
AcqKnowledge software	BIOPAC Systems Inc.	Version 4.2.1	Software
Automatic biochemistry analyzer	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	Chemray 800	CK-MB assay
BIOPAC research systems	BIOPAC Systems Inc.	MP150	Hardware
Blunt needle (20 G, TWLB)	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10005861	K-H buffer
CK-MB assay kits	Changchun Huili Biotech Co., Ltd.	C060	CK-MB assay
Curved forcep	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
EDTA	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10009717	K-H buffer
Electrical stimulator	BIOPAC Systems Inc.	STEMISOC	Hardware
Filter	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	63005518	K-H buffer
Heparin sodium	Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd.	H120200505	Preparation of the isolated heart
Isoflurane	RWD Life Science Co.,LTD	21082201	Preparation of the isolated heart
Magnesium sulfate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20025118	K-H buffer
Needle electrodes	BIOPAC Systems Inc.	EL452	Hardware
Ophthalmic clamp	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Perfusion tube	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Potassium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318	K-H buffer
Sodium bicarbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10018960	K-H buffer
Sodium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10019318	K-H buffer
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20040718	K-H buffer
Sprague-Dawley (SD) rats	SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd.	Male, 300-350g	Preparation of the isolated heart
Thermometer	Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd.	GSP-6	Modified Langendorff perfusion system
Tissueforceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Tissue scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Toothed forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ventilator	Chengdu Instrument Factory	DKX-150	Preparation of the isolated heart
Water bath1	Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd.	SC-15	Modified Langendorff perfusion system
Water bath2	Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Modified Langendorff perfusion system