고립 된 쥐 심장에서 장기 심실 세동의 모델

요약

이 프로토콜은 저전압 교류를 통한 지속적인 자극에 의해 유도된 쥐 심장의 장기 심실 세동 모델을 제시합니다. 이 모델은 성공률이 높고 안정적이고 신뢰할 수 있으며 재현 가능하며 심장 기능에 미치는 영향이 적고 경미한 심근 손상만 유발합니다.

초록

심실 세동 (VF)은 심장 환자에서 발생률이 높은 치명적인 부정맥이지만, 관류하에 VF 정지는 심장 수술 분야에서 수술 중 정지의 무시 된 방법입니다. 최근 심장 수술의 발전으로 관류 하에 장기간의 VF 연구에 대한 수요가 증가했습니다. 그러나 이 분야에는 만성 심실 세동의 간단하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 동물 모델이 부족합니다. 이 프로토콜은 심외막의 교류(AC) 전기 자극을 통해 장기 VF를 유도합니다. VF를 유도하기 위해 장기 VF를 유도하기 위해 저전압 또는 고전압으로 연속 자극을 하고 자발적인 장기 VF를 유도하기 위해 저전압 또는 고전압으로 5분 동안 자극하는 등 다양한 조건을 사용했습니다. 다양한 조건의 성공률과 심근 손상 및 심장 기능 회복률을 비교했습니다. 그 결과 지속적인 저전압 자극이 장기 VF를 유도하고 5분의 저전압 자극이 경미한 심근 손상과 높은 심장 기능 회복률로 자발적인 장기 VF를 유도하는 것으로 나타났습니다. 그러나 저전압, 지속적으로 자극되는 장기 VF 모델은 성공률이 더 높았습니다. 고전압 자극은 VF 유도율이 높았지만 제세동 성공률이 낮고 심장 기능 회복이 불량하며 심각한 심근 손상을 보였습니다. 이러한 결과를 바탕으로 높은 성공률, 안정성, 신뢰성, 재현성, 심장 기능에 대한 낮은 영향 및 경미한 심근 손상을 위해 지속적인 저전압 심외막 AC 자극이 권장됩니다.

서문

심장 수술은 일반적으로 개흉술을 통해 수행되며 대동맥을 차단하고 심장을 정지시키기 위해 심정지 용액으로 관류합니다. 반복적인 심장 수술은 초기 수술보다 더 어려울 수 있으며, 합병증과 사망률이 더 높다 ^1,2,3. 또한, 기존의 정중 흉골 절개술 접근법은 흉골 뒤의 교량 혈관, 상행 대동맥, 우심실 및 기타 중요한 구조에 손상을 줄 수 있습니다. 결합 조직의 분리로 인한 광범위한 출혈, 흉골 상처 감염 및 흉골 절개술로 인한 흉골 골수염은 모두 가능한 합병증입니다. 광범위한 해부는 중요한 심장 구조에서 병변 및 출혈의 위험을 증가시킵니다.

최소 침습 심장 수술의 발달로 절개 부위가 작아지고 심정지가 때때로 이루어지기 어렵습니다. 심실세동(VF)^4,5 하에서 반복적인 심장 수술은 안전하고 실현 가능하며 더 나은 심근 보호를 제공할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 최소 침습적 체외 순환을 통한 수술에서 VF 심정지 방법을 소개합니다. 심장은 VF 동안 효과적인 수축을 잃기 때문에 수술 중 상행 대동맥을 봉합하고 차단할 필요가 없으므로 절차가 간단 해집니다. 그러나 심장이 지속적으로 관류되더라도 장기간의 VF는 여전히 심장에 해로울 수 있습니다.

이 방법이 널리 사용됨에 따라 VF 동안 심장을 보호하는 방법에 대한 질문이 점점 더 중요해지고 있습니다. 이를 위해서는 장기 VF의 동물 모델을 사용한 광범위하고 심층적인 연구가 필요합니다. 과거에는 이 분야의 연구가 주로^{큰 동물을 사용}했으며 6,7 외과의, 마취과 의사^, 관류 의사 및 기타 연구자 간의 협력이 필요했습니다. 이러한 연구는 너무 오래 걸렸고 표본 크기가 작은 경우가 많았으며 연구는 일반적으로 기계 및 분자 평가보다는 심장 기능에 초점을 맞췄습니다. 현재까지 장기 VF 모델을 구축하기 위한 자세한 프로토콜을 보고한 연구는 없습니다.

따라서, 이 프로토콜은 Langendorff 장치를 사용하여 장기 VF 쥐 모델을 개발하는데 필요한 세부사항을 제공한다. 프로토콜은 간단하고 경제적이며 반복 가능하고 안정적입니다.

프로토콜

이 조사에 사용된 모든 실험 절차와 프로토콜은 PLA 종합병원의 동물 관리 및 사용 위원회에서 검토하고 승인했습니다.

1. Langendorff 장치 준비

1. Krebs-Henseleit(K-H) 완충액을 준비합니다. K-H 완충액을 제조하기 위해, 다음을 증류수에 첨가한다: 118.0 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM NaH2PO4, 1.8 mM _CaCl2, 25.0 mM NaHCO3, 11.1 mM 글루코스, 및 0.5 mM EDTA.
2. 수정된 Langendorff 관류 시스템을 준비합니다.
   1. K-H 완충액을 함유하는 플라스크를 대략 80 mmHg의 압력에서 95% O2 + 5%_CO2로 연속적으로 기체 처리한다. 관류 튜브의 한쪽 끝을 K-H 버퍼에 놓고 관류 튜브의 중간을 수조에 통과시킨 다음 관류 튜브의 다른 쪽 끝에 뭉툭한 20G 바늘을 부착합니다.
   2. 와이어 스탠드에 바늘을 매달아 놓습니다. 관류 시스템의 끝에서 KH 버퍼의 온도가 37.0°C ± 1.0°C가 되도록 수조의 온도를 조정합니다.

2. 하드웨어 및 소프트웨어 준비

1. 하드웨어
   1. 생리학적 신호 레코더를 사용하여 모든 아날로그 신호를 디지털화하고 기록할 수 있습니다. 두 개의 스테인리스 스틸 바늘 전극을 사용하여 양극성 심전도(ECG)를 기록하고 전기 자극을 위해 두 개의 스테인리스 스틸 바늘 전극을 사용합니다.
   2. 4개의 전극 중 한쪽 끝을 생리적 신호 기록기에 연결하고 다른 쪽 끝을 장치에 부착한 후 심장이 위치할 영역에 가깝게 연결합니다.
2. 소프트웨어
   1. 랩톱 소프트웨어를 사용하여 양극성 ECG 및 혈역학적 매개변수를 자동으로 인식, 조정 및 기록합니다. 매개변수에는 좌심실 압력 차이(LVPD), 좌심실 전개 압력(LVDP)과 좌심실 이완기말 압력(LVEDP) 간의 차이 및 심박수(HR)가 포함됩니다.
   2. 전기 자극기 매개변수를 30Hz AC로 설정하고 낮은 볼륨으로 tage 그룹은 2V를 수신하고 고전압 그룹은 6V를 수신합니다.

3. 고립 된 마음 준비

1. 동물을 준비하십시오.
   1. 0.05mg/kg 부프레노르핀 및 1,000IU/kg 헤파린 나트륨을 복강내 주사한 후 Sprague-Dawley(SD) 쥐에게 2% 이소플루란을 마취합니다. 쥐가 발가락 꼬집음에 반응하지 않았는지 확인하십시오.
   2. 쥐를 작은 동물 수술 플랫폼으로 옮기고 쥐를 앙와위 자세로 놓고 75 % 에탄올로 가슴을 소독합니다.
2. 마음을 소비하십시오.
   1. 자궁 경부 박리 및 기관 삽관 후 인공 호흡기에 연결된 쥐를 치아 집게로 xiphoid 과정에서 피부를 들어 올리고 조직 가위로 피부에 3cm 가로 절개를합니다. 피부와 갈비뼈 절개 부위를 양쪽 겨드랑이까지 V자 모양으로 확장합니다.
   2. 심장과 폐를 완전히 노출시키기 위해 조직 집게로 흉골을 두개골로 반사합니다.
   3. 두 개의 구부러진 집게를 사용하여 흉선을 분리하고 뭉툭하게 해부합니다. 흉선 조직을 고정하고 양쪽에서 측면으로 편향시켜 대동맥과 그 가지를 노출시킵니다.
   4. 구부러진 집게를 사용하여 대동맥과 폐동맥을 뭉툭하게 분리하여 나중에 안과용 가위를 사용하여 심장을 제거하고 심장을 제거한 후 심장을 정지시킵니다.
      참고: 이 절차를 처음 사용하는 사용자의 경우 3.2.4단계를 생략할 수 있습니다.
   5. 무딘 절개를 사용하여 상완 간부 줄기를 주변 조직에서 분리하십시오. 그런 다음 심장의 제거를 용이하게하기 위해 구부러진 집게로 상완 체간 줄기를 고정하십시오. 상완 뇌골 줄기와 왼쪽 총 경동맥 사이의 대동맥을 빠르게 절단합니다. 쥐는 심장이 제거되자마자 죽습니다.
   6. 여분의 조직을 잘라내고 즉시 0-4 °C에서 KH 버퍼가 있는 페트리 접시에 심장을 담그고 잔류 혈액을 씻어내고 펌핑합니다.
      참고: 상완 간선과 왼쪽 총경동맥 사이의 대동맥 절개는 몸통을 보존하면 대동맥을 식별하고 캐뉼라 깊이를 추정할 수 있기 때문에 권장됩니다.
3. 심장을 정지시킵니다.
   1. 심장을 두 번째 페트리 접시로 옮깁니다. 대동맥을 확인하십시오. 두 개의 안과용 집게를 사용하여 대동맥을 들어 올리고 뭉툭한 바늘을 Langendorff 장치에 삽입합니다.
   2. 대동맥 깊이를 적절한 위치로 조정합니다. 조수가 0 봉합사로 매듭을 묶도록하십시오. 그런 다음 관류 유량 조절기를 켭니다.
      알림: 시술 내내 기포가 심장에 들어가지 않도록 주의하십시오. 또한 대동맥 절단에서 초기 관류까지의 시간은 2분을 초과해서는 안 됩니다.
   3. 압력 변환기에 연결된 작은 수정 라텍스 풍선을 좌심방에 삽입하고 승모판을 통해 풍선을 좌심실로 밀어 넣습니다. 풍선을 증류수로 채워 이완기 말 압력이 5-10 mmHg가되도록합니다.
   4. ECG와 전기 자극 전극을 심장에 연결합니다. 이어서, 심장을 37.0°C ± 1.0°C의 내부 온도를 유지하기 위해 자켓 유리 챔버에 넣는다.
      알림: 다음 제외 기준을 사용하십시오: 심박수 <분당 250회; 관상동맥 흐름(mL/분) <10mL/분 또는 >25mL/분. ECG 및 전기 자극 전극 연결 위치는 그림 1A에 나와 있고 재킷 유리 챔버는 그림 1B에 나와 있습니다.

4. 심장을 관류하고 전기적으로 자극 (그림 2)

1. 평형 단계(0-30분)
   1. 관류를 시작하고, 심장이 자발적으로 박동할 때까지 대략 37°C의 온도를 유지하고; 그런 다음 심장이 20분 동안 평형을 이루도록 합니다.
   2. 수조 온도를 조정하여 재킷 유리 챔버 내의 온도를 약 30°C로 유지합니다.
      알림: 전체 냉각 과정은 약 10분 동안 지속되어야 합니다.
2. 전기 자극 단계(30-120분)
   1. 온도가 원하는 수준에 도달하면 랩톱 소프트웨어의 전기 자극 스위치를 활성화하십시오.
      참고: 전기 자극 시작 시 양극성 ECG와 좌심실압(LVP)은 그림 3A에 나와 있습니다.
   2. 동물이 지속적으로 자극되는 장기 VF 그룹의 일부인 경우 90분 동안 전기 자극을 허용합니다. 동물이 유도된 자발적인 장기 VF 그룹에 있는 경우 그림 3B와 같이 5분의 전기 자극을 허용한 다음 전기 자극을 끄고 자발적인 장기 VF를 위해 90분을 허용합니다.
      참고: 전기 자극 후 90분 이내에 자발적 VF가 발생하지 않는 자발적인 장기 VF 그룹의 심장의 경우 포함 기준을 충족하지 않으므로 전기 자극이 꺼집니다.
3. 재가열, 제세동 및 박동 단계(120-180분)
   1. VF 90분 후 전극을 사용하여 그림 0.1C와 같이 3J의 직류 제세동을 제공합니다.
   2. 동시에 수조 온도를 조절하여 자켓 유리 챔버 내에서 온도가 약 37°C까지 천천히 상승할 수 있도록 합니다. 약 10분 동안 예열 과정을 계속합니다.
   3. 제세동 후 심장이 60분 동안 박동하도록 한 다음 약 37°C에서 10% KCl로 천천히 관류하여 박동을 멈춥니다. 추가 분석을 위해 심장을 제거하십시오.
      참고: 제세동 후 박동하지 않는 심장은 포함 기준을 충족하지 않습니다. 또한 냉각 전 (20 분), 제세동 후 (120 분) 및 실험 종료 후 (180 분) 관상 동맥 삼출액을 수집하는 것이 중요합니다.

5. 크레아틴 키나아제-MB (CK-MB) 분석 및 조직학적 분석 수행

1. CK-MB 분석
   1. 자동 생화학 분석기 및 상용 CK-MB 분석 키트를 사용하여 수집된 관상동맥 삼출액의 CK-MB 수준을 측정합니다⁸.
2. 조직학적 분석
   1. 완충된 10% 포르말린에 심장을 고정하고 심장을 탈수시킨 다음 파라핀에 삽입합니다.
   2. 마이크로톰을 사용하여 파라핀이 포매된 조직을 5μm 섹션으로 절단합니다. 그런 다음 유리 슬라이드에 섹션을 장착하고 헤마톡실린과 에오신⁹로 염색합니다.

결과

총 57마리의 랫트가 실험에 사용되었으며, 그 중 30마리가 포함 기준을 충족했습니다. 포함된 동물을 5개 그룹으로 나누었고, 각 그룹에 6마리의 동물이 있었습니다: 대조군(그룹 C), 저전압 연속 자극 장기 VF 그룹(그룹 LC), 고전압 연속 자극 장기 VF 그룹(그룹 HC), 저전압 유도 자발적 장기 VF 그룹(그룹 LI) 및 고전압 유도 자발적 장기 VF 그룹(그룹 HI). 각 그룹의 실험 과정은 그림 2

토론

이 프로토콜은 이전에 보고되지 않은 고립된 쥐 심장에서 장기 VF의 동물 모델을 설정합니다. 또한 이 연구에서는 다양한 전기 자극 조건을 비교했습니다. 본 연구는 심장 수술 중 심실세동 정지와 관련된 연구 모델을 제공한다.

모델의 성공률은 인력, 시간 및 경제적 비용과 관련된 매우 중요한 지표입니다. VF 모델에서 성공률에는 심장에서 VF를 유도할 수 있는지 여부와 제세...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Non-absorbable suture	Ethicon, Inc.		Preparation of the isolated heart
95% O2 + 5% CO2	Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd.		K-H buffer
AcqKnowledge software	BIOPAC Systems Inc.	Version 4.2.1	Software
Automatic biochemistry analyzer	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	Chemray 800	CK-MB assay
BIOPAC research systems	BIOPAC Systems Inc.	MP150	Hardware
Blunt needle (20 G, TWLB)	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10005861	K-H buffer
CK-MB assay kits	Changchun Huili Biotech Co., Ltd.	C060	CK-MB assay
Curved forcep	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
EDTA	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10009717	K-H buffer
Electrical stimulator	BIOPAC Systems Inc.	STEMISOC	Hardware
Filter	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	63005518	K-H buffer
Heparin sodium	Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd.	H120200505	Preparation of the isolated heart
Isoflurane	RWD Life Science Co.,LTD	21082201	Preparation of the isolated heart
Magnesium sulfate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20025118	K-H buffer
Needle electrodes	BIOPAC Systems Inc.	EL452	Hardware
Ophthalmic clamp	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Perfusion tube	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Potassium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318	K-H buffer
Sodium bicarbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10018960	K-H buffer
Sodium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10019318	K-H buffer
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20040718	K-H buffer
Sprague-Dawley (SD) rats	SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd.	Male, 300-350g	Preparation of the isolated heart
Thermometer	Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd.	GSP-6	Modified Langendorff perfusion system
Tissueforceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Tissue scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Toothed forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ventilator	Chengdu Instrument Factory	DKX-150	Preparation of the isolated heart
Water bath1	Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd.	SC-15	Modified Langendorff perfusion system
Water bath2	Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Modified Langendorff perfusion system