İzole Sıçan Kalplerinde Uzun Süreli Ventriküler Fibrilasyon Modeli

Özet

Bu protokol, düşük voltajlı alternatif akımla sürekli stimülasyonla indüklenen sıçan kalplerinde uzun süreli ventriküler fibrilasyon modeli sunmaktadır. Bu model yüksek bir başarı oranına sahiptir, stabil, güvenilir ve tekrarlanabilir, kardiyak fonksiyon üzerinde düşük bir etkiye sahiptir ve sadece hafif miyokard hasarına neden olur.

Özet

Ventriküler fibrilasyon (VF) kalp hastalarında görülme sıklığı yüksek olan ölümcül bir aritmidir, ancak perfüzyon altında VF arresti kalp cerrahisi alanında ihmal edilen bir intraoperatif arrest yöntemidir. Kalp cerrahisindeki son gelişmelerle birlikte, perfüzyon altında uzun süreli VF çalışmalarına olan talep artmıştır. Bununla birlikte, alan kronik ventriküler fibrilasyonun basit, güvenilir ve tekrarlanabilir hayvan modellerinden yoksundur. Bu protokol, epikardın alternatif akım (AC) elektriksel stimülasyonu yoluyla uzun süreli VF'yi indükler. VF'yi indüklemek için, uzun süreli VF'yi indüklemek için düşük veya yüksek voltajla sürekli stimülasyon ve spontan uzun süreli VF'yi indüklemek için düşük veya yüksek voltajla 5 dakika boyunca stimülasyon dahil olmak üzere farklı koşullar kullanılmıştır. Farklı durumların başarı oranlarının yanı sıra miyokard yaralanması ve kardiyak fonksiyonların iyileşme oranları karşılaştırıldı. Sonuçlar, sürekli düşük voltajlı stimülasyonun uzun süreli VF'yi indüklediğini ve 5 dakikalık düşük voltajlı stimülasyonun hafif miyokard hasarı ve yüksek oranda kardiyak fonksiyon iyileşmesi ile spontan uzun süreli VF'yi indüklediğini göstermiştir. Bununla birlikte, düşük voltajlı, sürekli uyarılan uzun vadeli VF modeli daha yüksek bir başarı oranına sahipti. Yüksek voltajlı stimülasyon daha yüksek VF indüksiyon oranı sağladı, ancak düşük defibrilasyon başarı oranı, kardiyak fonksiyonun zayıf iyileşmesi ve ciddi miyokard hasarı gösterdi. Bu sonuçlara dayanarak, yüksek başarı oranı, stabilitesi, güvenilirliği, tekrarlanabilirliği, kardiyak fonksiyon üzerindeki düşük etkisi ve hafif miyokard hasarı nedeniyle sürekli düşük voltajlı epikardiyal AC stimülasyonu önerilmektedir.

Giriş

Kalp cerrahisi genellikle torakotomi yoluyla, aortun bloke edilmesi ve kalbi tutuklamak için kardiyoplejik bir solüsyonla perfüzyon ile gerçekleştirilir. Tekrarlayan kalp cerrahisi ilk ameliyattan daha zor olabilir, komplikasyon ve mortalite oranları daha yüksektir ^1,2,3. Ayrıca, konvansiyonel medyan sternotomi yaklaşımı, sternumun arkasındaki köprü damarlarına, yükselen aorta, sağ ventriküle ve diğer önemli yapılara zarar verebilir. Bağ dokusunun ayrılmasına bağlı yaygın kanama, sternal yara enfeksiyonu ve sternotomiye bağlı sternal osteomiyelit olası komplikasyonlardır. Kapsamlı diseksiyon vital kardiyak yapılarda lezyon ve kanama riskini arttırır.

Minimal invaziv kalp cerrahisinin gelişmesiyle birlikte, insizyonlar küçülmüştür ve kalp durması bazen zordur. Ventriküler fibrilasyon (VF)^4,5 altında tekrarlanan kalp cerrahisi güvenli^, uygulanabilir ve daha iyi miyokard koruması sağlayabilir. Bu nedenle, bu protokol minimal invaziv ekstrakorporeal dolaşım ile cerrahide VF kardiyak arrest yöntemini tanıtmaktadır. Kalp, VF sırasında etkili kasılmayı kaybeder ve bu nedenle, ameliyat sırasında artan aortu dikmeye ve bloke etmeye gerek yoktur, bu da prosedürü basitleştirir. Bununla birlikte, kalp sürekli perfüze edilse bile, uzun süreli VF hala kalbe zararlı olabilir.

Bu yöntem daha yaygın olarak kullanılmaya başlandıkça, VF sırasında kalbin nasıl korunacağı sorusu giderek daha fazla önem kazanmaktadır. Bu, uzun vadeli VF'nin hayvan modellerini kullanarak kapsamlı ve derinlemesine çalışmalar gerektirecektir. Geçmişte, bu alandaki araştırmalar çoğunlukla büyük hayvanlar^6,7 kullanmış ve cerrahlar^, anestezistler, perfüzyonistler ve diğer araştırmacılar arasında işbirliği gerektirmiştir. Bu çalışmalar çok uzun sürdü, örneklem büyüklükleri genellikle küçüktü ve çalışmalar genellikle kardiyak fonksiyona odaklandı ve mekanik ve moleküler değerlendirmelere daha az odaklandı. Bugüne kadar, hiçbir çalışma uzun vadeli bir VF modeli oluşturmak için ayrıntılı bir protokol bildirmemiştir.

Bu protokol, Langendorff aparatını kullanarak uzun vadeli bir VF sıçan modeli geliştirmek için gereken ayrıntıları sağlar. Protokol basit, ekonomik, tekrarlanabilir ve kararlıdır.

Protokol

Bu araştırmada kullanılan tüm deneysel prosedürler ve protokoller PLA Genel Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Langendorff aparatının hazırlanması

1. Krebs-Henseleit (K-H) arabelleğini hazırlayın. K-H tamponunu hazırlamak için damıtılmış suya aşağıdakileri ekleyin: 118,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM NaH 2 PO₄, 1,8 mM CaCl ₂,25,0 mM NaHCO₃, 11,1 mM glikoz ve 0,5 mM EDTA.
2. Modifiye Langendorff perfüzyon sistemini hazırlayın.
   1. K-H tamponu içeren şişeyi yaklaşık 80 mmHg basınçta %95_O2 + %5 CO₂ ile sürekli olarak gazlayın. Perfüzyon tüpünün bir ucunu K-H tamponuna yerleştirin, perfüzyon tüpünün ortasını su banyosundan geçirin ve perfüzyon tüpünün diğer ucuna künt bir 20 G iğnesi takın.
   2. İğneyi bir tel standa askıya alın. Su banyosunun sıcaklığını, perfüzyon sisteminin sonundan itibaren K-H tamponunun sıcaklığı 37.0 °C ± 1.0 °C olacak şekilde ayarlayın.

2. Donanım ve yazılımın hazırlanması

1. Donanım
   1. Tüm analog sinyalleri dijitalleştirmek ve kaydetmek için fizyolojik bir sinyal kaydedici kullanın. Bipolar elektrokardiyogramı (EKG) kaydetmek için iki paslanmaz çelik iğne elektrodu kullanın ve elektriksel stimülasyon için iki paslanmaz çelik iğne elektrodu kullanın.
   2. Dört elektrotun bir ucunu fizyolojik sinyal kaydediciye, diğer ucunu ise cihaza bağlandıktan sonra kalbin konumlandırılacağı alana yakın bir yere bağlayın.
2. Yazılım
   1. Bipolar EKG ve hemodinamik parametreleri otomatik olarak tanımak, ayarlamak ve kaydetmek için dizüstü bilgisayar yazılımını kullanın. Parametreler arasında sol ventrikül basınç farkı (LVPD), sol ventrikül gelişmiş basıncı (LVDP) ile sol ventrikül diyastolik sonu basıncı (LVEDP) arasındaki fark ve kalp hızı (HR) bulunur.
   2. Elektrik stimülatörü parametrelerini 30 Hz AC'ye ayarlayın, alçak gerilim grubu 2 V ve yüksek voltaj grubu 6 V alır.

3. İzole kalbin hazırlanması

1. Hayvanı hazırla.
   1. Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını intraperitoneal enjeksiyonlardan sonra 0.05 mg/kg buprenorfin ve 1.000 IU/kg heparin sodyum enjeksiyonlarından sonra %2 izofluran ile uyuşturun. Sıçanın ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeyi bıraktığından emin olun.
   2. Sıçanı küçük bir hayvan cerrahi platformuna aktarın, sıçanı sırtüstü pozisyona yerleştirin ve göğsü% 75 etanol ile sterilize edin.
2. Kalbi tüketin.
   1. Servikal diseksiyon ve trakeal entübasyondan sonra bir ventilatöre bağlı sıçan ile, cildi dişli forsepslerle ksifoid süreçten kaldırın ve doku makası ile deride 3 cm'lik enine bir kesi yapın. Deri ve kaburga kesilerini V şeklinde her iki taraftaki aksillaya uzatın.
   2. Kalbi ve akciğerleri tamamen açığa çıkarmak için sternumu kraniyal olarak doku forsepsleri ile yansıtın.
   3. İki kavisli forseps kullanarak timusu izole edin ve açıkça diseke edin. Timik dokuyu kelepçeleyin ve aortu ve dallarını açığa çıkarmak için her iki taraftan da yanal olarak saptırın.
   4. Aort ve pulmoner arterin künt bir şekilde ayrılmasını sağlamak için kavisli forseps kullanın, bu da kalbi çıkarmak ve çıkarıldıktan sonra kalbi askıya almak için oftalmik makasın daha sonra kullanılmasını kolaylaştırır.
      NOT: Bu yordamda yeni olanlar için, adım 3.2.4 atlanabilir.
   5. Brakiyosefalik gövdeyi çevreleyen dokudan ayırmak için künt diseksiyon kullanın. Daha sonra, kalbin çıkarılmasını kolaylaştırmak için brakiyosefalik gövdeyi kavisli forseps ile kelepçeleyin. Brakiyosefalik gövde ile sol ortak karotis arter arasındaki aortu hızla kesin. Sıçan, kalp çıkarılır çıkarılmaz ölür.
   6. Gereksiz dokuyu kesin ve kalan kanı yıkamak ve pompalamak için kalbi derhal 0-4 ° C'de K-H tamponlu bir Petri kabına daldırın.
      NOT: Aortun brakiyosefalik gövde ile sol ortak karotis arter arasında transeksiyonu önerilir, çünkü gövdenin korunması aortun tanımlanmasına ve kanülasyon derinliğinin tahmin edilmesine izin verir.
3. Kalbi askıya alın.
   1. Kalbi ikinci bir Petri kabına aktarın. Aortu tanımlayın. Aortu kaldırmak için iki oftalmik forseps kullanın ve künt iğneyi Langendorff aparatına yerleştirin.
   2. Aort derinliğini uygun konuma ayarlayın. Bir asistanın 0 dikiş ipliği ile bir düğüm bağlamasını sağlayın. Ardından, perfüzyon akış regülatörünü açın.
      NOT: İşlem boyunca kalbe giren hava kabarcıklarını önlemeye özen gösterin. Ayrıca, aortun kesilmesinden ilk perfüzyona kadar geçen sürenin 2 dakikayı geçmemesi gerektiğini unutmayın.
   3. Bir basınç dönüştürücüsüne bağlı küçük modifiye edilmiş bir lateks balonu sol atriyuma yerleştirin ve balonu mitral kapaktan sol ventriküle doğru itin. 5-10 mmHg'lik bir diyastolik uç basınç elde etmek için balonu damıtılmış suyla doldurun.
   4. EKG ve elektriksel stimülasyon elektrotlarını kalbe bağlayın. Ardından, 37.0 ° C ± 1.0 ° C'lik bir iç sıcaklığı korumak için kalbi ceketli bir cam odaya yerleştirin.
      NOT: Aşağıdaki hariç tutma ölçütlerini kullanın: kalp atış hızı 25 mL/dk. EKG ve elektriksel stimülasyon elektrodu bağlantı konumları Şekil 1A'da, ceketli cam haznesi ise Şekil 1B'de gösterilmiştir.

4. Kalbin perfüzyonu ve elektriksel olarak uyarılması (Şekil 2)

1. Denge aşaması (0-30 dk.)
   1. Perfüzyonu başlatın ve kalp kendiliğinden atana kadar yaklaşık 37 ° C'lik bir sıcaklığı koruyun; Ardından, kalbin 20 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
   2. Ceketli cam haznedeki sıcaklığı yaklaşık 30 ° C'de tutmak için su banyosu sıcaklığını ayarlayın.
      NOT: Tüm soğutma işlemi yaklaşık 10 dakika sürmelidir.
2. Elektriksel stimülasyon aşaması (30-120 dk.)
   1. Sıcaklık istenen seviyeye ulaştıktan sonra, dizüstü bilgisayar yazılımındaki elektriksel stimülasyon anahtarını etkinleştirin.
      NOT: Elektriksel stimülasyonun başlangıcındaki bipolar EKG ve sol ventrikül basıncı (LVP) Şekil 3A'da gösterilmiştir.
   2. Hayvan sürekli uyarılan uzun süreli VF grubunun bir parçasıysa, 90 dakikalık elektriksel stimülasyona izin verin. Hayvan indüklenmiş spontan uzun süreli VF grubundaysa, 5 dakikalık elektriksel stimülasyona izin verin, ardından elektriksel stimülasyonu kapatın ve Şekil 3B'de gösterildiği gibi spontan uzun süreli VF için 90 dakika bekleyin.
      NOT: Spontan uzun süreli VF grubunda, elektriksel stimülasyondan sonraki 90 dakika içinde spontan VF geliştirmeyen kalpler için, elektriksel stimülasyon daha sonra dahil etme kriterlerini karşılamadıkları için kapatılır.
3. Yeniden ısınma, defibrilasyon ve dayak aşaması (120-180 dk.)
   1. 90 dakikalık VF'den sonra, Şekil 3C'de gösterildiği gibi 0.1 J doğru akım defibrilasyonu vermek için elektrotlar kullanın.
   2. Aynı zamanda, ceketli cam haznedeki sıcaklığın yavaşça yaklaşık 37 ° C'ye yükselmesini sağlamak için su banyosu sıcaklığını düzenleyin. Isınma işlemine yaklaşık 10 dakika devam edin.
   3. Defibrilasyondan sonra, kalbin 60 dakika boyunca atmasına izin verin ve daha sonra yaklaşık 37 ° C'de% 10 KCl ile yavaş perfüzyonla atışı durdurun. Daha fazla analiz için kalbi çıkarın.
      NOT: Defibrilasyondan sonra atmayan kalpler dahil etme kriterlerini karşılamaz. Ek olarak, koroner efüzyonun soğumadan önce (20 dakikada), defibrilasyondan sonra (120 dakikada) ve deneyin sonunda (180 dakikada) toplanması önemlidir.

5. Kreatin kinaz-MB (CK-MB) testinin yapılması ve histolojik analiz

1. CK-MB testi
   1. Toplanan koroner efüzyon sıvısındaki CK-MB seviyesini belirlemek için otomatik bir biyokimya analizörü ve ticari CK-MB tahlil kiti kullanın⁸.
2. Histolojik analiz
   1. Kalbi tamponlu% 10 formaline sabitleyin, kalbi dehidrate edin ve parafine gömün.
   2. Parafine gömülü dokuyu 5 μm kesitlere ayırmak için bir mikrotom kullanın; Ardından, bölümleri cam slaytlara monte edin ve hematoksilin ve EOSIN⁹ ile lekeleyin.

Sonuçlar

Deneylerde toplam 57 sıçan kullanıldı ve bunların 30'u dahil etme kriterlerini karşıladı. Dahil edilen hayvanlar, her grupta altı hayvan olmak üzere beş gruba ayrıldı: kontrol grubu (Grup C), düşük voltajlı sürekli uyarılmış uzun süreli VF grubu (Grup LC), yüksek voltajlı sürekli uyarılmış uzun süreli VF grubu (Grup HC), düşük voltaja bağlı spontan uzun süreli VF grubu (Grup LI) ve yüksek voltaja bağlı spontan uzun vadeli VF grubu (Grup HI). Her grup için deneysel süreç

Tartışmalar

Bu protokol, daha önce bildirilmemiş olan izole sıçan kalplerinde uzun süreli VF'nin bir hayvan modelini oluşturur. Ayrıca bu çalışmada farklı elektriksel stimülasyon koşulları karşılaştırılmıştır. Bu çalışma, kalp cerrahisi sırasında ventriküler fibrilasyon durması ile ilgili çalışmalar için bir model sunmaktadır.

Modelin başarı oranı, personel, zaman ve ekonomik maliyetlerle ilgili çok önemli bir göstergedir. VF modellerinde başarı oranı, VF'nin kal...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Non-absorbable suture	Ethicon, Inc.		Preparation of the isolated heart
95% O2 + 5% CO2	Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd.		K-H buffer
AcqKnowledge software	BIOPAC Systems Inc.	Version 4.2.1	Software
Automatic biochemistry analyzer	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	Chemray 800	CK-MB assay
BIOPAC research systems	BIOPAC Systems Inc.	MP150	Hardware
Blunt needle (20 G, TWLB)	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10005861	K-H buffer
CK-MB assay kits	Changchun Huili Biotech Co., Ltd.	C060	CK-MB assay
Curved forcep	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
EDTA	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10009717	K-H buffer
Electrical stimulator	BIOPAC Systems Inc.	STEMISOC	Hardware
Filter	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	63005518	K-H buffer
Heparin sodium	Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd.	H120200505	Preparation of the isolated heart
Isoflurane	RWD Life Science Co.,LTD	21082201	Preparation of the isolated heart
Magnesium sulfate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20025118	K-H buffer
Needle electrodes	BIOPAC Systems Inc.	EL452	Hardware
Ophthalmic clamp	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Perfusion tube	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Potassium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318	K-H buffer
Sodium bicarbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10018960	K-H buffer
Sodium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10019318	K-H buffer
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20040718	K-H buffer
Sprague-Dawley (SD) rats	SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd.	Male, 300-350g	Preparation of the isolated heart
Thermometer	Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd.	GSP-6	Modified Langendorff perfusion system
Tissueforceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Tissue scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Toothed forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ventilator	Chengdu Instrument Factory	DKX-150	Preparation of the isolated heart
Water bath1	Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd.	SC-15	Modified Langendorff perfusion system
Water bath2	Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Modified Langendorff perfusion system