Un modello di fibrillazione ventricolare a lungo termine in cuori di ratto isolati

Riepilogo

Questo protocollo presenta un modello di fibrillazione ventricolare a lungo termine nei cuori di ratto indotta dalla stimolazione continua con corrente alternata a bassa tensione. Questo modello ha un alto tasso di successo, è stabile, affidabile e riproducibile, ha un basso impatto sulla funzione cardiaca e causa solo lievi lesioni miocardiche.

Abstract

La fibrillazione ventricolare (VF) è un'aritmia fatale con un'alta incidenza nei pazienti cardiaci, ma l'arresto VF sotto perfusione è un metodo trascurato di arresto intraoperatorio nel campo della cardiochirurgia. Con i recenti progressi nella cardiochirurgia, la domanda di studi VF prolungati sotto perfusione è aumentata. Tuttavia, il campo manca di modelli animali semplici, affidabili e riproducibili di fibrillazione ventricolare cronica. Questo protocollo induce VF a lungo termine attraverso la stimolazione elettrica a corrente alternata (AC) dell'epicardio. Diverse condizioni sono state utilizzate per indurre VF, tra cui la stimolazione continua con una bassa o alta tensione per indurre VF a lungo termine e la stimolazione per 5 minuti con una bassa o alta tensione per indurre VF spontanea a lungo termine. Sono stati confrontati i tassi di successo delle diverse condizioni, nonché i tassi di lesioni miocardiche e recupero della funzione cardiaca. I risultati hanno mostrato che la stimolazione continua a bassa tensione ha indotto VF a lungo termine e che 5 minuti di stimolazione a bassa tensione hanno indotto VF spontanea a lungo termine con lieve danno miocardico e un alto tasso di recupero della funzione cardiaca. Tuttavia, il modello VF a bassa tensione, continuamente stimolato a lungo termine, ha avuto un tasso di successo più elevato. La stimolazione ad alta tensione ha fornito un più alto tasso di induzione VF, ma ha mostrato un basso tasso di successo della defibrillazione, scarso recupero della funzione cardiaca e gravi lesioni del miocardio. Sulla base di questi risultati, la stimolazione epicardica AC continua a bassa tensione è raccomandata per il suo alto tasso di successo, stabilità, affidabilità, riproducibilità, basso impatto sulla funzione cardiaca e lieve danno miocardico.

Introduzione

La cardiochirurgia viene solitamente eseguita tramite toracotomia, con blocco dell'aorta e perfusione con una soluzione cardioplegica per arrestare il cuore. La chirurgia cardiaca ripetuta può essere più impegnativa dell'intervento chirurgico iniziale, con complicanze e tassi di mortalità più elevati ^1,2,3. Inoltre, l'approccio convenzionale della sternotomia mediana può causare danni ai vasi ponte dietro lo sterno, all'aorta ascendente, al ventricolo destro e ad altre strutture importanti. Sanguinamento esteso dovuto alla separazione del tessuto connettivo, infezione della ferita sternale e osteomielite sternale dovuta a sternotomia sono tutte possibili complicanze. La dissezione estesa aumenta il rischio di lesioni ed emorragie nelle strutture cardiache vitali.

Con lo sviluppo della cardiochirurgia minimamente invasiva, le incisioni sono diventate più piccole e l'arresto cardiaco è talvolta difficile da raggiungere. La chirurgia cardiaca ripetuta sotto fibrillazione ventricolare (VF)^4,5 è sicura^, fattibile e può fornire una migliore protezione miocardica. Pertanto, questo protocollo introduce il metodo di arresto cardiaco VF in chirurgia con circolazione extracorporea minimamente invasiva. Il cuore perde una contrazione efficace durante la VF e, quindi, non è necessario suturare e bloccare l'aorta ascendente durante l'intervento chirurgico, il che semplifica la procedura. Tuttavia, anche se il cuore è continuamente perfuso, VF a lungo termine può ancora essere dannoso per il cuore.

Man mano che questo metodo diventa più ampiamente utilizzato, la questione di come proteggere il cuore durante la VF diventa sempre più rilevante. Ciò richiederà studi approfonditi e approfonditi utilizzando modelli animali di VF a lungo termine. In passato, la ricerca in questo campo ha utilizzato principalmente animali di grossa taglia^6,7 e ha richiesto la cooperazione tra chirurghi, anestesisti^, perfusionisti e altri ricercatori. Questi studi hanno richiesto troppo tempo, le dimensioni del campione erano spesso piccole e gli studi si sono generalmente concentrati sulla funzione cardiaca e meno sulle valutazioni meccanicistiche e molecolari. Ad oggi, nessuno studio ha riportato un protocollo dettagliato per stabilire un modello VF a lungo termine.

Questo protocollo, quindi, fornisce i dettagli necessari per sviluppare un modello di ratto VF a lungo termine utilizzando l'apparato di Langendorff. Il protocollo è semplice, economico, ripetibile e stabile.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali e i protocolli utilizzati in questa indagine sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale generale del PLA.

1. Preparazione dell'apparecchio di Langendorff

1. Preparare il buffer Krebs-Henseleit (K-H). Per preparare il tampone K-H, aggiungere quanto segue all'acqua distillata: 118,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM NaH 2 PO₄, 1,8 mM CaCl₂, 25,0 mM NaHCO₃, 11,1 mM glucosio e 0,5 mM EDTA.
2. Preparare il sistema di perfusione Langendorff modificato.
   1. Gassare continuamente il matraccio contenente tampone K-H con il 95% di O 2 + 5% di CO₂ ad una pressione di circa 80 mmHg. Posizionare un'estremità del tubo di perfusione nel tampone K-H, far passare il centro del tubo di perfusione attraverso il bagno d'acqua e attaccare un ago smussato da 20 G all'altra estremità del tubo di perfusione.
   2. Sospendere l'ago su un supporto di filo. Regolare la temperatura del bagno d'acqua in modo che la temperatura del tampone K-H dall'estremità del sistema di perfusione sia di 37,0 °C ± 1,0 °C.

2. Preparazione dell'hardware e del software

1. Hardware
   1. Utilizzare un registratore di segnali fisiologico per digitalizzare e registrare tutti i segnali analogici. Utilizzare due elettrodi ad ago in acciaio inossidabile per registrare un elettrocardiogramma bipolare (ECG) e utilizzare due elettrodi ad ago in acciaio inossidabile per la stimolazione elettrica.
   2. Collegare un'estremità dei quattro elettrodi al registratore di segnali fisiologici e l'altra estremità vicino all'area in cui verrà posizionato il cuore dopo il collegamento all'apparecchio.
2. Software
   1. Utilizzare il software del laptop per riconoscere, regolare e registrare automaticamente i parametri ECG ed emodinamici bipolari. I parametri includono la differenza di pressione ventricolare sinistra (LVPD), la differenza tra la pressione ventricolare sinistra sviluppata (LVDP) e la pressione ventricolare sinistra end-diastolica (LVEDP) e la frequenza cardiaca (HR).
   2. Impostare i parametri dello stimolatore elettrico a 30 Hz AC, con il gruppo di bassa tensione che riceve 2 V e il gruppo di alta tensione che riceve 6 V.

3. Preparare il cuore isolato

1. Prepara l'animale.
   1. Anestetizzare ratti Sprague-Dawley (SD) con isoflurano al 2% dopo iniezioni intraperitoneali di 0,05 mg/kg di buprenorfina e 1.000 UI/kg di eparina sodica. Assicurarsi che il ratto abbia smesso di rispondere al pizzico del piede.
   2. Trasferire il ratto su una piattaforma chirurgica per piccoli animali, posizionare il ratto in posizione supina e sterilizzare il torace con etanolo al 75%.
2. Accisa il cuore.
   1. Con il ratto collegato a un ventilatore dopo la dissezione cervicale e l'intubazione tracheale, sollevare la pelle dal processo xifoideo con una pinza dentata e fare un'incisione trasversale di 3 cm nella pelle con forbici da tessuto. Estendere la pelle e le incisioni costali alle ascelle su entrambi i lati a forma di V.
   2. Riflettere lo sterno cranicamente con una pinza tissutale per esporre completamente il cuore e i polmoni.
   3. Isolare e sezionare senza mezzi termini il timo usando due pinze curve. Bloccare il tessuto timico e deviarlo lateralmente su entrambi i lati per esporre l'aorta e i suoi rami.
   4. Utilizzare una pinza curva per eseguire una separazione smussata dell'aorta e dell'arteria polmonare, facilitando l'uso successivo di forbici oftalmiche per rimuovere il cuore e sospendere il cuore una volta rimosso.
      Nota : per coloro che sono nuovi a questa procedura, il passaggio 3.2.4 può essere omesso.
   5. Utilizzare la dissezione smussata per separare il tronco brachiocefalico dal tessuto circostante. Quindi, bloccare il tronco brachiocefalico con una pinza curva per facilitare la rimozione del cuore. Tagliare rapidamente l'aorta tra il tronco brachiocefalo e l'arteria carotide comune sinistra. Il topo muore non appena il cuore viene rimosso.
   6. Tagliare il tessuto ridondante e immergere immediatamente il cuore in una capsula di Petri con tampone K-H a 0-4 °C per lavare e pompare fuori il sangue residuo.
      NOTA: La transezione dell'aorta tra il tronco brachiocefalico e l'arteria carotide comune sinistra è raccomandata perché la conservazione del tronco consente l'identificazione dell'aorta e la stima della profondità di incannulamento.
3. Sospendi il cuore.
   1. Trasferire il cuore in una seconda capsula di Petri. Identificare l'aorta. Utilizzare due pinze oftalmiche per sollevare l'aorta e inserire l'ago smussato nell'apparato di Langendorff.
   2. Regolare la profondità aortica nella posizione appropriata. Chiedi a un assistente di legare un nodo con un filo di sutura 0. Quindi, accendere il regolatore del flusso di perfusione.
      NOTA: Fare attenzione ad evitare che bolle d'aria entrino nel cuore durante la procedura. Inoltre, tieni presente che il tempo dal taglio dell'aorta alla perfusione iniziale non deve superare i 2 minuti.
   3. Inserire un piccolo palloncino in lattice modificato collegato a un trasduttore di pressione nell'atrio sinistro e spingere il palloncino attraverso la valvola mitrale nel ventricolo sinistro. Riempire il palloncino con acqua distillata per ottenere una pressione diastolica finale di 5-10 mmHg.
   4. Collegare l'ECG e gli elettrodi di stimolazione elettrica al cuore. Quindi, posizionare il cuore in una camera di vetro incamiciata per mantenere una temperatura interna di 37,0 ° C ± 1,0 ° C.
      NOTA: utilizzare i seguenti criteri di esclusione: frequenza cardiaca <250 battiti al minuto; flusso coronarico (mL/min) <10 mL/min o >25 mL/min. Le posizioni di connessione dell'elettrodo ECG e della stimolazione elettrica sono mostrate nella Figura 1A e la camera di vetro incamiciata è mostrata nella Figura 1B.

4. Perfondere e stimolare elettricamente il cuore (Figura 2)

1. Fase di equilibrio (0-30 min)
   1. Iniziare la perfusione e mantenere una temperatura di circa 37 °C fino a quando il cuore batte spontaneamente; Quindi, lascia che il cuore si equilibri per 20 minuti.
   2. Regolare la temperatura del bagno d'acqua per mantenere la temperatura all'interno della camera di vetro incamiciata a circa 30 °C.
      NOTA: L'intero processo di raffreddamento dovrebbe durare circa 10 minuti.
2. Fase di stimolazione elettrica (30-120 min)
   1. Dopo che la temperatura ha raggiunto il livello desiderato, attivare l'interruttore di stimolazione elettrica sul software del laptop.
      NOTA: L'ECG bipolare e la pressione ventricolare sinistra (LVP) all'inizio della stimolazione elettrica sono mostrati in Figura 3A.
   2. Se l'animale fa parte del gruppo VF a lungo termine continuamente stimolato, consentire 90 minuti di stimolazione elettrica. Se l'animale si trova nel gruppo VF spontanea a lungo termine indotta, consentire 5 minuti di stimolazione elettrica, quindi spegnere la stimolazione elettrica e consentire 90 minuti per VF spontanea a lungo termine, come mostrato nella Figura 3B.
      NOTA: Per i cuori nel gruppo VF spontanea a lungo termine che non sviluppano VF spontanea entro 90 minuti dalla stimolazione elettrica, la stimolazione elettrica viene quindi disattivata in quanto non soddisfano i criteri di inclusione.
3. Fase di riscaldamento, defibrillazione e battitura (120-180 min)
   1. Dopo 90 minuti di VF, utilizzare elettrodi per fornire 0,1 J di defibrillazione in corrente continua, come mostrato nella Figura 3C.
   2. Regolare contemporaneamente la temperatura del bagno d'acqua per consentire alla temperatura di salire lentamente all'interno della camera di vetro incamiciata a circa 37 °C. Continuare il processo di riscaldamento per circa 10 minuti.
   3. Dopo la defibrillazione, lasciare battere il cuore per 60 minuti, quindi interrompere il battito mediante perfusione lenta con KCl al 10% a circa 37 °C. Rimuovere il cuore per ulteriori analisi.
      NOTA: I cuori che non battono dopo la defibrillazione non soddisfano i criteri di inclusione. Inoltre, è importante raccogliere il versamento coronarico prima del raffreddamento (a 20 min), dopo la defibrillazione (a 120 min) e alla fine dell'esperimento (a 180 min).

5. Esecuzione del test della creatina chinasi-MB (CK-MB) e dell'analisi istologica

1. Saggio CK-MB
   1. Utilizzare un analizzatore biochimico automatico e un kit di analisi CK-MB commerciale per determinare il livello di CK-MB nel liquido di versamento coronarico raccolto⁸.
2. Analisi istologica
   1. Fissare il cuore in formalina tamponata al 10%, disidratare il cuore e incorporarlo nella paraffina.
   2. Utilizzare un microtomo per tagliare il tessuto incorporato in paraffina in sezioni da 5 μm; Quindi, montare le sezioni su vetrini e colorare con ematossilina ed eosina⁹.

Risultati

Un totale di 57 ratti sono stati utilizzati negli esperimenti, di cui 30 hanno soddisfatto i criteri di inclusione. Gli animali inclusi sono stati divisi in cinque gruppi, con sei animali in ciascun gruppo: il gruppo di controllo (Gruppo C), il gruppo VF a lungo termine continuamente stimolato a bassa tensione (Gruppo LC), il gruppo VF a lungo termine stimolato continuamente ad alta tensione (Gruppo HC), il gruppo VF spontaneo a lungo termine indotto da bassa tensione (Gruppo LI) e il gruppo VF spontaneo a lungo termine ...

Discussione

Questo protocollo stabilisce un modello animale di VF a lungo termine in cuori di ratto isolati che non è stato precedentemente segnalato. Inoltre, in questo studio sono state confrontate diverse condizioni di stimolazione elettrica. Questo studio fornisce un modello per gli studi relativi all'arresto della fibrillazione ventricolare durante la cardiochirurgia.

Il tasso di successo del modello è un indicatore molto importante correlato al personale, al tempo e ai costi economici. Nei modelli...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Non-absorbable suture	Ethicon, Inc.		Preparation of the isolated heart
95% O2 + 5% CO2	Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd.		K-H buffer
AcqKnowledge software	BIOPAC Systems Inc.	Version 4.2.1	Software
Automatic biochemistry analyzer	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	Chemray 800	CK-MB assay
BIOPAC research systems	BIOPAC Systems Inc.	MP150	Hardware
Blunt needle (20 G, TWLB)	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10005861	K-H buffer
CK-MB assay kits	Changchun Huili Biotech Co., Ltd.	C060	CK-MB assay
Curved forcep	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
EDTA	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10009717	K-H buffer
Electrical stimulator	BIOPAC Systems Inc.	STEMISOC	Hardware
Filter	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	63005518	K-H buffer
Heparin sodium	Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd.	H120200505	Preparation of the isolated heart
Isoflurane	RWD Life Science Co.,LTD	21082201	Preparation of the isolated heart
Magnesium sulfate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20025118	K-H buffer
Needle electrodes	BIOPAC Systems Inc.	EL452	Hardware
Ophthalmic clamp	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Perfusion tube	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Potassium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318	K-H buffer
Sodium bicarbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10018960	K-H buffer
Sodium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10019318	K-H buffer
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20040718	K-H buffer
Sprague-Dawley (SD) rats	SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd.	Male, 300-350g	Preparation of the isolated heart
Thermometer	Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd.	GSP-6	Modified Langendorff perfusion system
Tissueforceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Tissue scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Toothed forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ventilator	Chengdu Instrument Factory	DKX-150	Preparation of the isolated heart
Water bath1	Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd.	SC-15	Modified Langendorff perfusion system
Water bath2	Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Modified Langendorff perfusion system