Modelo de Fibrilação Ventricular de Longa Duração em Corações Isolados de Rato

Resumo

Este protocolo apresenta um modelo de fibrilação ventricular de longa duração em corações de ratos induzida por estimulação contínua com corrente alternada de baixa voltagem. Esse modelo tem alta taxa de sucesso, é estável, confiável e reprodutível, tem baixo impacto na função cardíaca e causa apenas lesão miocárdica leve.

Resumo

A fibrilação ventricular (FV) é uma arritmia fatal com alta incidência em pacientes cardíacos, mas a parada da PV sob perfusão é um método negligenciado de parada intraoperatória no campo da cirurgia cardíaca. Com os recentes avanços da cirurgia cardíaca, a demanda por estudos prolongados de PV sob perfusão tem aumentado. Entretanto, o campo carece de modelos animais simples, confiáveis e reprodutíveis de fibrilação ventricular crônica. Esse protocolo induz a PV de longa duração por meio da estimulação elétrica do epicárdio em corrente alternada (CA). Diferentes condições foram utilizadas para induzir a PV, incluindo estimulação contínua com baixa ou alta voltagem para induzir FV de longa duração e estimulação por 5 min com baixa ou alta voltagem para induzir FV espontânea de longa duração. As taxas de sucesso das diferentes condições, bem como as taxas de lesão miocárdica e recuperação da função cardíaca, foram comparadas. Os resultados mostraram que a estimulação contínua de baixa voltagem induziu FV de longa duração e que 5 min de estimulação de baixa voltagem induziram FV espontânea de longa duração com lesão miocárdica leve e alta taxa de recuperação da função cardíaca. No entanto, o modelo de PV de longa duração continuamente estimulado de baixa voltagem apresentou maior taxa de sucesso. A estimulação de alta voltagem proporcionou maior taxa de indução de FV, mas mostrou baixa taxa de sucesso na desfibrilação, má recuperação da função cardíaca e lesão miocárdica grave. Com base nesses resultados, a estimulação contínua por CA epicárdica de baixa voltagem é recomendada por sua alta taxa de sucesso, estabilidade, confiabilidade, reprodutibilidade, baixo impacto na função cardíaca e leve lesão miocárdica.

Introdução

A cirurgia cardíaca geralmente é realizada por toracotomia, com bloqueio da aorta e perfusão com solução cardioplégica para parada do coração. A repetição da cirurgia cardíaca pode ser mais desafiadora do que a cirurgia inicial, com maiores taxas de complicações e mortalidade ^1,2,3. Além disso, a abordagem convencional de esternotomia mediana pode causar danos aos vasos da ponte atrás do esterno, da aorta ascendente, do ventrículo direito e de outras estruturas importantes. Sangramento extenso devido à separação do tecido conjuntivo, infecção da ferida esternal e osteomielite esternal devido à esternotomia são complicações possíveis. A dissecção extensa aumenta o risco de lesões e hemorragia em estruturas cardíacas vitais.

Com o desenvolvimento da cirurgia cardíaca minimamente invasiva, as incisões tornaram-se menores, e a parada cardíaca às vezes é difícil de alcançar. A repetição de cirurgia cardíaca sob fibrilação ventricular (FV)^4,5 é segura, factível e pode proporcionar melhor proteção miocárdica. Portanto, este protocolo introduz o método de parada cardíaca de PV em cirurgia com circulação extracorpórea minimamente invasiva. O coração perde contração efetiva durante a PV e, assim, não há necessidade de sutura e bloqueio da aorta ascendente durante a cirurgia, o que simplifica o procedimento. No entanto, mesmo que o coração seja continuamente perfundido, a PV a longo prazo ainda pode ser prejudicial ao coração.

À medida que esse método se torna mais amplamente utilizado, a questão de como proteger o coração durante a PV torna-se cada vez mais relevante. Isso exigirá estudos extensivos e aprofundados utilizando modelos animais de FV de longa duração. No passado, as pesquisas nessa área utilizaram principalmente animais de grande porte^6,7 e exigiram cooperação entre cirurgiões^, anestesiologistas, perfusionistas e outros pesquisadores. Esses estudos demoraram muito, os tamanhos amostrais foram muitas vezes pequenos, e os estudos geralmente se concentraram na função cardíaca e menos em avaliações mecanicistas e moleculares. Até o momento, nenhum estudo relatou um protocolo detalhado para estabelecer um modelo de PV de longa duração.

Este protocolo, portanto, fornece os detalhes necessários para o desenvolvimento de um modelo de PV de longo prazo em ratos usando o aparelho de Langendorff. O protocolo é simples, econômico, repetível e estável.

Protocolo

Todos os procedimentos e protocolos experimentais utilizados nesta investigação foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de PLA.

1. Preparação do aparelho de Langendorff

1. Prepare o tampão Krebs-Henseleit (K-H). Para preparar o tampão K-H, adicione o seguinte à água destilada: NaCl 118,0 mM, KCl 4,7 mM, MgSO 4 1,2 mM, NaH 2 PO₄ 1,2 mM, CaCl₂1,8 mM, NaHCO ₃ 25,0 mM, glicose 11,1 mM e EDTA 0,5 mM.
2. Preparar o sistema de perfusão Langendorff modificado.
   1. Gaseificar continuamente o balão contendo tampão K-H com 95% O 2 + 5% CO₂ a uma pressão de aproximadamente 80 mmHg. Coloque uma extremidade do tubo de perfusão no tampão K-H, passe o meio do tubo de perfusão através do banho-maria e prenda uma agulha romba de 20 G na outra extremidade do tubo de perfusão.
   2. Suspenda a agulha em um suporte de arame. Ajustar a temperatura do banho-maria de modo a que a temperatura do tampão K-H a partir da extremidade do sistema de perfusão seja de 37,0 °C ± 1,0 °C.

2. Preparação do hardware e software

1. Hardware
   1. Use um gravador de sinais fisiológicos para digitalizar e gravar todos os sinais analógicos. Use dois eletrodos de agulha de aço inoxidável para registrar um eletrocardiograma bipolar (ECG) e use dois eletrodos de agulha de aço inoxidável para estimulação elétrica.
   2. Conecte uma extremidade dos quatro eletrodos ao registrador de sinais fisiológicos e a outra extremidade próxima à área onde o coração será posicionado após a fixação ao aparelho.
2. Software
   1. Use o software do laptop para reconhecer, ajustar e registrar automaticamente o ECG bipolar e os parâmetros hemodinâmicos. Os parâmetros incluem a diferença de pressão do ventrículo esquerdo (DLVE), a diferença entre a pressão desenvolvida do ventrículo esquerdo (PDVE) e a pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE) e a frequência cardíaca (FC).
   2. Ajuste os parâmetros do estimulador elétrico para 30 Hz AC, com o grupo de baixa tensão recebendo 2 V e o grupo de alta tensão recebendo 6 V.

3. Preparando o coração isolado

1. Prepare o animal.
   1. Anestesiar ratos Sprague-Dawley (SD) com isoflurano a 2% após injeções intraperitoneais de 0,05 mg/kg de buprenorfina e 1.000 UI/kg de heparina sódica. Certifique-se de que o rato parou de responder ao aperto do dedo do pé.
   2. Transfira o rato para uma plataforma cirúrgica de pequenos animais, coloque-o em decúbito dorsal e esterilize o tórax com etanol a 75%.
2. Excise o coração.
   1. Com o rato conectado a um ventilador após dissecção cervical e intubação traqueal, levante a pele do processo xifoide com pinça dentada e faça uma incisão transversal de 3 cm na pele com tesoura de tecido. Estenda as incisões da pele e das costelas para as axilas de ambos os lados em forma de V.
   2. Refletir o esterno cranialmente com pinças de tecido para expor totalmente o coração e os pulmões.
   3. Isolar e dissecar o timo sem rodeios usando duas pinças curvas. Aperte o tecido tímico e desvie-o lateralmente em ambos os lados para expor a aorta e seus ramos.
   4. Utilizar pinça curva para realizar uma separação romba da aorta e da artéria pulmonar, facilitando o uso posterior da tesoura oftálmica para remover o coração e suspender o coração uma vez retirado.
      Observação : para aqueles que são novos para este procedimento, a etapa 3.2.4 pode ser omitida.
   5. Use dissecção romba para separar o tronco braquiocefálico do tecido circundante. Em seguida, pinça o tronco braquiocefálico com pinça curva para facilitar a remoção do coração. Cortar rapidamente a aorta entre o tronco braquiocefálico e a artéria carótida comum esquerda. O rato morre assim que o coração é removido.
   6. Corte o tecido redundante e mergulhe imediatamente o coração em uma placa de Petri com tampão K-H a 0-4 °C para lavar e bombear o sangue residual.
      OBS: A transecção da aorta entre o tronco braquiocefálico e a artéria carótida comum esquerda é recomendada, pois a preservação do tronco permite a identificação da aorta e a estimativa da profundidade da canulação.
3. Suspenda o coração.
   1. Transfira o coração para uma segunda placa de Petri. Identificar a aorta. Use duas pinças oftálmicas para levantar a aorta e insira a agulha romba no aparelho de Langendorff.
   2. Ajustar a profundidade da aorta para a posição apropriada. Peça a um assistente que amarre um nó com um fio de sutura 0. Em seguida, ligue o regulador de fluxo de perfusão.
      NOTA: Tome cuidado para evitar que bolhas de ar entrem no coração durante todo o procedimento. Além disso, esteja ciente de que o tempo desde o corte da aorta até a perfusão inicial não deve exceder 2 min.
   3. Insira um pequeno balão de látex modificado conectado a um transdutor de pressão no átrio esquerdo e empurre o balão através da valva mitral para o ventrículo esquerdo. Encher o balão com água destilada para atingir uma pressão diastólica final de 5-10 mmHg.
   4. Conecte o ECG e os eletrodos de estimulação elétrica ao coração. Em seguida, coloque o coração em uma câmara de vidro encamisada para manter uma temperatura interna de 37,0 °C ± 1,0 °C.
      OBS: Utilizar os seguintes critérios de exclusão: frequência cardíaca <250 batimentos por minuto; fluxo coronariano (mL/min) <10 mL/min ou >25 mL/min. As posições de conexão do eletrodo de eletrocardiograma e estimulação elétrica são mostradas na Figura 1A, e a câmara de vidro encamisada é mostrada na Figura 1B.

4. Perfundir e estimular eletricamente o coração (Figura 2)

1. Estágio de equilíbrio (0-30 min)
   1. Iniciar a perfusão e manter temperatura de aproximadamente 37 °C até que o coração bata espontaneamente; Em seguida, deixe o coração se equilibrar por 20 min.
   2. Ajuste a temperatura do banho-maria para manter a temperatura dentro da câmara de vidro encamisada em aproximadamente 30 °C.
      NOTA: Todo o processo de resfriamento deve durar aproximadamente 10 min.
2. Estágio de estimulação elétrica (30-120 min)
   1. Depois que a temperatura atingir o nível desejado, ative o interruptor de estimulação elétrica no software do laptop.
      NOTA: O ECG bipolar e a pressão ventricular esquerda (PVE) no início da estimulação elétrica são mostrados na Figura 3A.
   2. Se o animal fizer parte do grupo de PV de longa duração continuamente estimulada, permitir 90 min de estimulação elétrica. Se o animal estiver no grupo de FV espontânea induzida de longa duração, permitir 5 min de estimulação elétrica, desligá-la e aguardar 90 min para FV espontânea de longa duração, como mostra a Figura 3B.
      OBS: Para os corações do grupo de PV espontânea de longa duração que não desenvolvem PV espontânea dentro de 90 min após a eletroestimulação, a estimulação elétrica é então desligada por não atenderem aos critérios de inclusão.
3. Estágio de reaquecimento, desfibrilação e batimento (120-180 min)
   1. Após 90 min de FV, utilizar eletrodos para dar 0,1 J de desfibrilação por corrente contínua, como mostra a Figura 3C.
   2. Regule simultaneamente a temperatura do banho-maria para permitir que a temperatura suba lentamente dentro da câmara de vidro encamisada para cerca de 37 °C. Continue o processo de aquecimento por aproximadamente 10 min.
   3. Após a desfibrilação, deixar o coração bater por 60 min e, em seguida, parar o batimento por perfusão lenta com KCl a 10% a aproximadamente 37 °C. Remova o coração para uma análise mais aprofundada.
      OBS: Corações que não batem após a desfibrilação não atendem aos critérios de inclusão. Além disso, é importante coletar o derrame coronariano antes do resfriamento (aos 20 min), após a desfibrilação (aos 120 min) e ao final do experimento (aos 180 min).

5. Realização do ensaio de creatina quinase-MB (CK-MB) e análise histológica

1. Ensaio CK-MB
   1. Utilizar um analisador bioquímico automático e um kit comercial de ensaio de CK-MB para determinar o nível de CK-MB no líquido de derrame coronariano coletado⁸.
2. Análise histológica
   1. Fixe o coração em formalina tamponada a 10%, desidrate o coração e incorpore-o em parafina.
   2. Use um micrótomo para cortar o tecido embebido em parafina em cortes de 5 μm; em seguida, montar os cortes em lâminas de vidro e corar com hematoxilina e eosina⁹.

Resultados

Foram utilizados 57 ratos nos experimentos, dos quais 30 preencheram os critérios de inclusão. Os animais incluídos foram divididos em cinco grupos, com seis animais em cada grupo: grupo controle (Grupo C), grupo FV de longa duração continuamente estimulada por baixa voltagem (Grupo LC), grupo de FV de longa duração continuamente estimulada de alta voltagem (Grupo HC), grupo de PV espontânea de longa duração induzida por baixa voltagem (Grupo LI) e grupo de FV espontânea de longa duração induzida por alta vo...

Discussão

Este protocolo estabelece um modelo animal de FV de longa duração em corações isolados de ratos que não foi relatado anteriormente. Além disso, diferentes condições de estimulação elétrica foram comparadas neste estudo. Este estudo fornece um modelo para estudos relacionados à parada de fibrilação ventricular durante cirurgia cardíaca.

A taxa de sucesso do modelo é um indicador muito importante que está relacionado a pessoal, tempo e custos econômicos. Em modelos de PV, a tax...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Non-absorbable suture	Ethicon, Inc.		Preparation of the isolated heart
95% O2 + 5% CO2	Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd.		K-H buffer
AcqKnowledge software	BIOPAC Systems Inc.	Version 4.2.1	Software
Automatic biochemistry analyzer	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	Chemray 800	CK-MB assay
BIOPAC research systems	BIOPAC Systems Inc.	MP150	Hardware
Blunt needle (20 G, TWLB)	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10005861	K-H buffer
CK-MB assay kits	Changchun Huili Biotech Co., Ltd.	C060	CK-MB assay
Curved forcep	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
EDTA	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10009717	K-H buffer
Electrical stimulator	BIOPAC Systems Inc.	STEMISOC	Hardware
Filter	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	63005518	K-H buffer
Heparin sodium	Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd.	H120200505	Preparation of the isolated heart
Isoflurane	RWD Life Science Co.,LTD	21082201	Preparation of the isolated heart
Magnesium sulfate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20025118	K-H buffer
Needle electrodes	BIOPAC Systems Inc.	EL452	Hardware
Ophthalmic clamp	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Perfusion tube	Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd.	H-113AP-S	Modified Langendorff perfusion system
Potassium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318	K-H buffer
Sodium bicarbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10018960	K-H buffer
Sodium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10019318	K-H buffer
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20040718	K-H buffer
Sprague-Dawley (SD) rats	SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd.	Male, 300-350g	Preparation of the isolated heart
Thermometer	Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd.	GSP-6	Modified Langendorff perfusion system
Tissueforceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Tissue scissors	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Toothed forceps	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.		Preparation of the isolated heart
Ventilator	Chengdu Instrument Factory	DKX-150	Preparation of the isolated heart
Water bath1	Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd.	SC-15	Modified Langendorff perfusion system
Water bath2	Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Modified Langendorff perfusion system