Lesión no invasiva del ligamento cruzado anterior (LCA) inducida por compresión e imágenes in vivo de la actividad de la proteasa en ratones

Resumen

La lesión no invasiva del LCA es un método fiable y clínicamente relevante para iniciar la osteoartritis postraumática (PTOA) en ratones. Este método de lesión también permite la cuantificación in vivo de la actividad de la proteasa en la articulación en puntos de tiempo tempranos después de la lesión utilizando sondas de infrarrojo cercano activables por proteasa e imágenes de reflectancia de fluorescencia.

Resumen

Las lesiones articulares traumáticas, como la rotura del ligamento cruzado anterior (LCA) o las roturas de menisco, suelen provocar artrosis postraumática (PTOA) en un plazo de 10 a 20 años tras la lesión. Comprender los procesos biológicos tempranos iniciados por lesiones articulares (p. ej., inflamación, metaloproteinasas de matriz (MMP), proteasas de catepsina, resorción ósea) es crucial para comprender la etiología de PTOA. Sin embargo, hay pocas opciones para la medición in vivo de estos procesos biológicos, y las respuestas biológicas tempranas pueden confundirse si se utilizan técnicas quirúrgicas invasivas o inyecciones para iniciar la artrosis. En nuestros estudios de PTOA, hemos utilizado sondas activables de proteasa de infrarrojo cercano disponibles comercialmente combinadas con imágenes de reflectancia de fluorescencia (FRI) para cuantificar la actividad de la proteasa in vivo después de una lesión no invasiva del LCA inducida por compresión en ratones. Este método no invasivo de lesión del LCA recapitula fielmente las condiciones de lesión clínicamente relevantes y es completamente aséptico, ya que no implica alterar la piel ni la cápsula articular. La combinación de estos métodos de lesión e imagen nos permite estudiar el curso temporal de la actividad de la proteasa en múltiples puntos de tiempo después de una lesión articular traumática.

Introducción

La osteoartritis es un problema de salud generalizado que afecta a millones de personas en^{los Estados Unidos}. La osteoartritis postraumática (PTOA, por sus siglas en inglés) es un subconjunto de la artrosis que se inicia por una lesión articular, como la rotura del ligamento cruzado anterior (LCA), una lesión de menisco o una fractura intraarticular². La proporción de pacientes con artrosis sintomática que se pueden clasificar como PTOA es de al menos el 12%³, y esta etiología suele afectar a una población más joven que la artrosis idiopática⁴. Los modelos murinos de artros....

Protocolo

Todos los procedimientos descritos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California Davis. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de 3 meses de edad.

1. Lesión no invasiva del LCA

NOTA: La lesión del LCA producida por una carga compresiva aplicada externamente es un método simple y reproducible que recapitula fielmente las condiciones de lesión del LCA en humanos. Este protocolo está escrito para un instrumento de bastidor de carga disponible comercialmente (véase la Tabla de materiales), pero podría....

Resultados

Después de aplicar una sola fuerza de compresión (1 mm/s hasta la lesión) en la parte inferior de las piernas de ratones machos C57BL/6J de 3 meses de edad, la lesión del LCA se indujo consistentemente en todos los ratones. La fuerza de compresión promedio en la lesión de rodilla fue de aproximadamente 10 N (Figura 1).

El análisis de FRI mostró una actividad de proteasa significativamente mayor en las articulaciones lesionadas de ratones sometidos a una le.......

Discusión

Este protocolo ha establecido y descrito rigurosamente un método reproducible y no invasivo para inducir la lesión del LCA en ratones 20,21,24,33. Este método de lesión simple y eficiente se puede realizar en solo unos minutos, lo que facilita estudios de alto rendimiento de PTOA. Este método de lesión también recapitula de cerca las condiciones de lesión relevantes para la lesión del .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate-Buffered Saline	Tissue Protech	PBS01-32R	or equivalent
Air Anesthetia System			Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine			Analgesic post-injury
Depilatory Cream	Veet	B001KYPZ4G	or equivalent
Fixtures			Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	06-666	or equivalent
Living Image software	Perkin Elmer
Materials testing systems	TA Instruments		Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680	Perkin Elmer	NEV10003	Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	550-82231-CS	Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell	TA Instruments		20 N capacity
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc.	SI-0236	or equivalent
WinTest software	TA Instruments		compatible with Electroforce 3200