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La lesión no invasiva del LCA es un método fiable y clínicamente relevante para iniciar la osteoartritis postraumática (PTOA) en ratones. Este método de lesión también permite la cuantificación in vivo de la actividad de la proteasa en la articulación en puntos de tiempo tempranos después de la lesión utilizando sondas de infrarrojo cercano activables por proteasa e imágenes de reflectancia de fluorescencia.
Las lesiones articulares traumáticas, como la rotura del ligamento cruzado anterior (LCA) o las roturas de menisco, suelen provocar artrosis postraumática (PTOA) en un plazo de 10 a 20 años tras la lesión. Comprender los procesos biológicos tempranos iniciados por lesiones articulares (p. ej., inflamación, metaloproteinasas de matriz (MMP), proteasas de catepsina, resorción ósea) es crucial para comprender la etiología de PTOA. Sin embargo, hay pocas opciones para la medición in vivo de estos procesos biológicos, y las respuestas biológicas tempranas pueden confundirse si se utilizan técnicas quirúrgicas invasivas o inyecciones para iniciar la artrosis. En nuestros estudios de PTOA, hemos utilizado sondas activables de proteasa de infrarrojo cercano disponibles comercialmente combinadas con imágenes de reflectancia de fluorescencia (FRI) para cuantificar la actividad de la proteasa in vivo después de una lesión no invasiva del LCA inducida por compresión en ratones. Este método no invasivo de lesión del LCA recapitula fielmente las condiciones de lesión clínicamente relevantes y es completamente aséptico, ya que no implica alterar la piel ni la cápsula articular. La combinación de estos métodos de lesión e imagen nos permite estudiar el curso temporal de la actividad de la proteasa en múltiples puntos de tiempo después de una lesión articular traumática.
La osteoartritis es un problema de salud generalizado que afecta a millones de personas enlos Estados Unidos. La osteoartritis postraumática (PTOA, por sus siglas en inglés) es un subconjunto de la artrosis que se inicia por una lesión articular, como la rotura del ligamento cruzado anterior (LCA), una lesión de menisco o una fractura intraarticular2. La proporción de pacientes con artrosis sintomática que se pueden clasificar como PTOA es de al menos el 12%3, y esta etiología suele afectar a una población más joven que la artrosis idiopática4. Los modelos murinos de artrosis son herramientas cruciales para investigar la etiología de la enfermedad y los posibles tratamientos para la artrosis en un plazo mucho más corto (4-12 semanas en modelos de ratón en comparación con 10-20 años en humanos). Sin embargo, los métodos para iniciar la artrosis en ratones suelen implicar técnicas quirúrgicas invasivas como la transección 5,6 del LCA, la extirpación o desestabilización del menisco medial 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, o una combinación de ambas 17,18,19, que no reproducen condiciones de lesión clínicamente relevantes. Los modelos quirúrgicos también exacerban la inflamación en la articulación debido a la alteración de la cápsula articular, lo que podría acelerar la progresión de la artrosis.
Los modelos de ratón con lesión de rodilla no invasiva brindan la oportunidad de estudiar los cambios biológicos y biomecánicos en los primeros momentos posteriores a la lesión y pueden arrojar resultados clínicamente más relevantes20. Nuestro laboratorio ha establecido un modelo de lesión no invasivo que utiliza una única sobrecarga de compresión tibial aplicada externamente para inducir la rotura del ligamento cruzado anterior (LCA) en ratones 21,22,23,24. Este método de lesión no invasivo es capaz de producir una lesión articular aséptica sin alterar la piel o la cápsula articular.
La imagen de reflectancia de fluorescencia (FRI) es un método de imagen óptica que consiste en excitar un objetivo con luz infrarroja en una longitud de onda específica y cuantificar la luz reflejada emitida en otra longitud de onda. Las sondas específicas de proteasa disponibles en el mercado se pueden inyectar en modelos animales y la FRI se puede utilizar para cuantificar la actividad de la proteasa en sitios específicos, como la articulación de la rodilla. Este método ha sido ampliamente utilizado para la detección in vivo de actividades biológicas como la inflamación. Las sondas utilizadas para esta aplicación se apagan con fluorescencia hasta que encuentran proteasas relevantes. Esas proteasas romperán un sitio de escisión enzimática en las sondas, después de lo cual producirán una señal fluorescente de infrarrojo cercano. Estas sondas y este método de imagen han sido ampliamente validados y utilizados en estudios de cáncer 25,26,27,28 y aterosclerosis 29,30,31,32, y nuestro grupo los ha utilizado para estudios del sistema musculoesquelético para medir marcadores de inflamación y degradación de la matriz 23,24,33.
Juntas, la lesión articular no invasiva combinada con FRI in vivo y sondas activables por proteasa proporcionan una capacidad única para rastrear la inflamación y la actividad de la proteasa después de una lesión articular traumática. Este análisis se puede realizar tan pronto como horas o incluso minutos después de la lesión, y el mismo animal puede ser evaluado varias veces para estudiar el curso temporal de la actividad de la proteasa en la articulación. Es importante destacar que este método de imagen puede no ser factible cuando se combina con modelos quirúrgicos de artrosis, ya que la alteración de la piel y la cápsula articular da como resultado una señal de fluorescencia que confundiría la señal desde el interior de la articulación.
Todos los procedimientos descritos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California Davis. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de 3 meses de edad.
1. Lesión no invasiva del LCA
NOTA: La lesión del LCA producida por una carga compresiva aplicada externamente es un método simple y reproducible que recapitula fielmente las condiciones de lesión del LCA en humanos. Este protocolo está escrito para un instrumento de bastidor de carga disponible comercialmente (véase la Tabla de materiales), pero podría adaptarse para sistemas similares.
2. Preparación de animales para la obtención de imágenes FRI
NOTA: Para las imágenes ópticas, el pelaje de los animales (particularmente el pelaje oscuro) es muy eficaz para bloquear, absorber y dispersar la luz, por lo tanto, el pelaje debe eliminarse tanto como sea posible del área alrededor de las articulaciones de la rodilla antes de tomar imágenes. Una crema depilatoria suele ser más eficaz para eliminar el pelo que las tijeras. Los ratones desnudos o sin pelo no requieren la eliminación del pelo. Sin embargo, la eliminación del pelo es necesaria para las cepas de ratón más utilizadas (por ejemplo, C57BL/6). Si es posible, alimente a los ratones con alimentos purificados de baja fluorescencia antes de tomar imágenes. La comida estándar para ratones contiene clorofila, que emite autofluorescencia con una longitud de onda de alrededor de 700 nm y puede afectar la recopilación de datos del sistema FRI de infrarrojo cercano.
3. Preparación de la solución de la sonda
4. Inyección retroorbitaria
NOTA: Refiérase a Yardeni et al. sobre los detalles de este procedimiento37.
5. Imágenes de reflectancia de fluorescencia
NOTA: Los procedimientos de esta sección son específicos de un sistema de imágenes ópticas disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales). Se pueden realizar imágenes similares con sistemas comparables.
Después de aplicar una sola fuerza de compresión (1 mm/s hasta la lesión) en la parte inferior de las piernas de ratones machos C57BL/6J de 3 meses de edad, la lesión del LCA se indujo consistentemente en todos los ratones. La fuerza de compresión promedio en la lesión de rodilla fue de aproximadamente 10 N (Figura 1).
El análisis de FRI mostró una actividad de proteasa significativamente mayor en las articulaciones lesionadas de ratones sometidos a una le...
Este protocolo ha establecido y descrito rigurosamente un método reproducible y no invasivo para inducir la lesión del LCA en ratones 20,21,24,33. Este método de lesión simple y eficiente se puede realizar en solo unos minutos, lo que facilita estudios de alto rendimiento de PTOA. Este método de lesión también recapitula de cerca las condiciones de lesión relevantes para la lesión del ...
Los autores no tienen nada que revelar.
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel, parte de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el número de adjudicación R01 AR075013.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x Phosphate-Buffered Saline | Tissue Protech | PBS01-32R | or equivalent |
Air Anesthetia System | Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone | ||
Buprenorphine | Analgesic post-injury | ||
Depilatory Cream | Veet | B001KYPZ4G | or equivalent |
Fixtures | Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform | ||
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Can also use comparable optical imaging system |
Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 06-666 | or equivalent |
Living Image software | Perkin Elmer | ||
Materials testing systems | TA Instruments | Electroforce 3200 or equivalent | |
ProSense680 | Perkin Elmer | NEV10003 | Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc. |
Sterile Syringe with Needle | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 550-82231-CS | Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent |
Uniaxial load cell | TA Instruments | 20 N capacity | |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | SI-0236 | or equivalent |
WinTest software | TA Instruments | compatible with Electroforce 3200 |
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