Non-İnvaziv Kompresyona Bağlı Ön Çapraz Bağ (ACL) Yaralanması ve Farelerde Proteaz Aktivitesinin İn vivo Görüntülenmesi

Özet

Non-invaziv ÖÇB yaralanması, farelerde travma sonrası osteoartriti (PTOA) başlatmak için güvenilir ve klinik olarak anlamlı bir yöntemdir. Bu yaralanma yöntemi aynı zamanda, proteazla aktive edilebilen yakın kızılötesi problar ve floresan yansıma görüntüleme kullanılarak yaralanma sonrası erken zaman noktalarında eklemdeki proteaz aktivitesinin in vivo olarak ölçülmesine izin verir.

Özet

Ön çapraz bağ (ÖÇB) rüptürü veya menisküs yırtıkları gibi travmatik eklem yaralanmaları genellikle yaralanmayı takip eden 10-20 yıl içinde travma sonrası osteoartrite (PTOA) yol açar. Eklem yaralanmaları tarafından başlatılan erken biyolojik süreçleri anlamak (ör., inflamasyon, matriks metalloproteinazlar (MMP'ler), katepsin proteazları, kemik rezorpsiyonu) PTOA'nın etiyolojisini anlamak için çok önemlidir. Bununla birlikte, bu biyolojik süreçlerin in vivo ölçümü için çok az seçenek vardır ve OA'yı başlatmak için invaziv cerrahi teknikler veya enjeksiyonlar kullanılırsa erken biyolojik yanıtlar karıştırılabilir. PTOA çalışmalarımızda, farelerde non-invaziv kompresyona bağlı ACL hasarını takiben in vivo proteaz aktivitesini ölçmek için floresan yansıma görüntüleme (FRI) ile birlikte ticari olarak temin edilebilen yakın kızılötesi proteaz aktive edilebilir problar kullandık. Bu non-invaziv ÖÇB yaralanma yöntemi, klinik olarak ilgili yaralanma koşullarını yakından özetler ve cildi veya eklem kapsülünü bozmayı içermediğinden tamamen aseptiktir. Bu yaralanma ve görüntüleme yöntemlerinin kombinasyonu, travmatik bir eklem yaralanmasını takiben proteaz aktivitesinin zaman akışını birden fazla zaman noktasında incelememizi sağlar.

Giriş

Osteoartrit, Amerika Birleşik Devletleri'nde milyonlarca insanı etkileyen yaygın bir sağlık sorunudur¹. Travma sonrası osteoartrit (PTOA), ön çapraz bağ (ÖÇB) yırtılması, menisküs yaralanması veya eklem içi kırık gibi bir eklem yaralanması ile başlayan bir OA alt kümesidir². PTOA olarak sınıflandırılabilecek semptomatik OA hastalarının oranı en az %12'dir3 ve bu etiyoloji tipik olarak idiyopatik OA'dan daha genç bir popülasyonu^etkiler4. OA'nın fare modelleri, hastalık etiyolojisini ve potansiyel OA tedavilerini çok daha kısa bir zaman çizelgesinde (insanlarda 10-20 yıla kıyasla fare modellerinde 4-12 hafta) araştırmak için çok önemli araçlardır. Bununla birlikte, farelerde OA'yı başlatma yöntemleri genellikle ACL transeksiyonu ^5,6, medial menisküs ^{5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16} veya ikisinin bir kombinasyonu gibi invaziv cerrahi teknikleri içerir 17,18,19, klinik olarak ilgili yaralanma koşullarını yeniden üretmez. Cerrahi modeller ayrıca eklem kapsülünün bozulması nedeniyle eklemdeki iltihabı şiddetlendirir ve bu da OA ilerlemesini hızlandırabilir.

Non-invaziv diz yaralanması fare modelleri, yaralanma sonrası erken zaman noktalarında biyolojik ve biyomekanik değişiklikleri inceleme fırsatı sağlar ve klinik olarak daha anlamlı sonuçlar verebilir²⁰. Laboratuvarımız, farelerde ön çapraz bağ (ACL) rüptürünü indüklemek için harici olarak uygulanan tek bir tibial kompresyon aşırı yüklemesini kullanan non-invaziv bir yaralanma modeli oluşturmuştur 21,22,23,24. Bu non-invaziv yaralanma yöntemi, cildi veya eklem kapsülünü bozmadan aseptik bir eklem yaralanması üretebilir.

Floresan yansıma görüntüleme (FRI), belirli bir dalga boyunda kızılötesi ışıkla bir hedefi uyarmayı ve başka bir dalga boyunda yayılan yansıyan ışığı ölçmeyi içeren bir optik görüntüleme yöntemidir. Ticari olarak temin edilebilen proteaza özgü problar hayvan modellerine enjekte edilebilir ve FRI daha sonra diz eklemi gibi belirli bölgelerde proteaz aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntem, inflamasyon gibi biyolojik aktivitelerin in vivo tespiti için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu uygulama için kullanılan problar, ilgili proteazlarla karşılaşana kadar floresan olarak söndürülür. Bu proteazlar daha sonra problar üzerindeki bir enzim bölünme bölgesini kıracak ve ardından yakın kızılötesi bir floresan sinyali üreteceklerdir. Bu problar ve bu görüntüleme yöntemi, kanser ^25,26,27,28 ve ateroskleroz^29,30,31,32 çalışmalarında kapsamlı bir şekilde doğrulanmış ve kullanılmıştır ve grubumuz bunları inflamasyon ve matris bozulması belirteçlerini ölçmek için kas-iskelet sistemi çalışmaları için kullanmıştır 23,24,33.

Birlikte, in vivo FRI ve proteaz aktive edilebilir problarla birleştirilmiş non-invaziv eklem yaralanması, travmatik bir eklem yaralanmasını takiben inflamasyonu ve proteaz aktivitesini izlemek için benzersiz bir yetenek sağlar. Bu analiz, yaralanmadan saatler hatta dakikalar sonra yapılabilir ve aynı hayvan, eklemdeki proteaz aktivitesinin zaman seyrini incelemek için birden çok kez değerlendirilebilir. Daha da önemlisi, bu görüntüleme yöntemi, OA'nın cerrahi modelleriyle birleştirildiğinde mümkün olmayabilir, çünkü cildin ve eklem kapsülünün bozulması, eklem içinden gelen sinyali karıştıracak bir floresan sinyaline neden olur.

Protokol

Açıklanan tüm prosedürler, California Davis Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için 3 aylık erkek C57BL/6J fareler kullanıldı.

1. Non-invaziv ACL yaralanması

NOT: Harici olarak uygulanan bir basınç yükü tarafından üretilen ÖÇB yaralanması, insanlarda ÖÇB yaralanma koşullarını yakından özetleyen basit ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen bir yük çerçevesi cihazı için yazılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu), ancak benzer sistemler için uyarlanabilir.

1. Yük çerçevesi cihazıyla uyumlu yazılımı açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve mevcut bir kontrol dosyasını seçin veya yeni bir dosya oluşturun.
2. Aktüatörün gücünü açın.
3. Kalibrasyon menüsünde, yük hücresinin kuvvet okumasını ayarlayın ve aktüatörün yer değiştirmesini 0 olarak ayarlayın.
4. Fareleri uyuşturmak için oksijende %1-4 inhale izofluran kullanın ve hayvanların ayak parmağı tutamı ve/veya kuyruk tutamıyla tamamen uyuşturulmasını sağlayın.
5. Fareyi platform üzerinde yüzüstü konuma getirin. Alt bacağı iki yükleme fikstürü arasına dikey olarak yerleştirin (Şekil 1) (bkz. Malzeme Tablosu). Ayağı üst fikstürün oyuğuna ve dizini alt fikstürün kabına yerleştirin.
6. 1-2 N'luk bir ön yük uygulamak için alt fikstürün yüksekliğini manuel olarak ayarlayın (bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak izlenir) ve konumu korumak için ayar vidasını sıkın. Yaralanma yükünü uygulamadan önce bacağı doğru pozisyonda tutmak için ön yük gereklidir.
7. Bir hedef kuvvete (~12-15 N) veya hedef yer değiştirmeye (~1.5-2.0 mm) tek bir basınç yükü uygulayın.
   NOT: Yükün daha yavaş bir yükleme hızında (~1 mm/sn) uygulanması, daha yüksek düzeyde gerçek zamanlı izleme ve kontrol sağlayacaktır, ancak muhtemelen ACL'de bir avülsiyon arızasına neden olacaktır. Daha hızlı bir yükleme hızı (~ 200 mm / s) uygulamak, orta madde ACL yaralanmasına neden olma olasılığı daha yüksek olacaktır²². Tibia kırığı veya başka bir aşırı yaralanmanın meydana geldiği belirlenirse, hayvan anesteziden iyileşmeden önce IACUC onaylı bir yöntem kullanarak hayvana ötenazi yapın.
   1. Yazılım kontrol dosyasında yükleme hızını ayarlayın ve zorla yer değiştirme verilerini kullanarak onaylayın.
      NOT: Tibial kompresyon yüklemesi sırasında kemik kırığı tipik olarak bir endişe kaynağı değildir, çünkü kırılma kuvveti (~ 20 N) ACL yaralanma kuvvetinden önemli ölçüde daha yüksektir. Bununla birlikte, bu palpasyonla izlenmelidir ve tibia kırığı oluşmadığını doğrulamak için görüntüleme (yani röntgen) kullanılabilir.
8. Yaralanma tipik olarak bir ses ("klik" veya "çatırtı") ve kuvvet yer değiştirme grafiklerinde tanımlanabilen bir kuvvet serbest bırakma ile gösterilir (Şekil 1C). Daha yavaş bir yükleme hızı kullanılıyorsa, daha fazla yüklemeyi ve diğer eklem dokularına olası hasarı önlemek için yaralanmadan hemen sonra basınç yükünü durdurun.
   NOT: ACL yaralanması tipik olarak vücut kütlesine bağlı olarak 8-15 N'de meydana gelir³⁴. Beklenen ACL yaralanma kuvvetinden daha büyük bir hedef kuvvet belirlemek önemlidir.
9. Ön-arka çekmece testi^35,36 veya eklem instabilitesinin karşılaştırılabilir değerlendirmesini kullanarak ACL yaralanmasını doğrulayın.
10. Yaralanma sonrası farelere, ev kurumu IACUC tarafından önerilen ve onaylanan süre ve dozla, hayvan ağırlığına bağlı bir doz (örneğin, 0.05-0.1 mg / kg SC veya buprenorfin IP'si, Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın.
    NOT: NSAİİ'ler yaralanma sonrası PTOA'nın ilerlemesini değiştirebilir, bu nedenle çalışmanın özel bir amacı olmadıkça bu yaralanma modelinde ağrı yönetimi için NSAİİ'lerin kullanılması önerilmez.

2. FRI görüntüleme için hayvan hazırlığı

NOT: Optik görüntüleme için, hayvan kürkü (özellikle koyu kürk) ışığı engellemede, emmede ve dağıtmada oldukça etkilidir, bu nedenle görüntülemeden önce kürk diz eklemlerinin etrafındaki alandan mümkün olduğunca çıkarılmalıdır. Tüy dökücü bir krem tipik olarak tüy çıkarma için makaslardan daha etkilidir. Çıplak veya tüysüz fareler kürkün alınmasını gerektirmez. Bununla birlikte, en yaygın kullanılan fare suşları için tüylerin çıkarılması gereklidir (örneğin, C57BL / 6). Mümkünse, görüntülemeden önce fareleri düşük floresan saflaştırılmış yiyeceklerle besleyin. Standart fare yemi, yaklaşık 700 nm dalga boyunda otomatik floresan veren ve yakın kızılötesi FRI sisteminden veri toplamayı etkileyebilen klorofil içerir.

1. Oksijende% 1 -% 4 inhale izofluran ile fareleri uyuşturun. Fareleri mümkün olduğunca bir ısıtma yastığı üzerinde tutun ve gözlerin tahriş olmasını önlemek için göz merhemi sürün.
2. Diz eklemi çevresindeki farelerin bacaklarının ön (kraniyal) yönüne tüy dökücü krem ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulamak için pamuklu çubuk kullanın.
3. Kremi ~ 1 dakika bekletin, ardından kremi ve kürkü bacaktan çıkarmak için mendil kullanın. Gerekirse tekrarlayın.
4. Diz eklemleri, bölgeyi kaplayan herhangi bir kürk olmadan tamamen açığa çıktığında, kalan tüy dökücü kremi çıkarmak için bacakları alkollü mendillerle temizleyin.
   NOT: Tüy dökücü krem, bir çalışma boyunca aynı farelerde birden çok kez kullanılabilir, ancak cildin gereksiz tahriş olmasını önlemek için bu uygulamalar en az bir hafta arayla yapılmalıdır.

3. Prob çözeltisinin hazırlanması

1. Gerekirse, floresan aktive edilebilir probu üreticinin talimatlarına göre steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin. Ticari olarak temin edilebilen probun bir şişesi (Malzeme Tablosuna bakınız) tipik olarak 0.15 mL 1x PBS'de 20 nmol içerir. Şişedeki çözeltiyi seyreltmek için, 1.5 mL 1x PBS'de 20 nmol yapmak için 1.35 mL 1x PBS ekleyin.
   NOT: Seyreltmeden sonra, fare başına 0.15 mL enjekte edilirken on fareyi görüntülemek için bir şişe kullanılabilir.
2. Probun çözelti içinde çözünmesini sağlamak için çözeltiyi minimum hızda (~ 2000 rpm) 30 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından tüm sıvının kapaktan çıktığından emin olmak için kısa bir süre santrifüjleyin.
   NOT: Çözelti, 12 aya kadar ışıktan korunan bir yerde 2-8 °C'de saklanabilir.

4. Retro-orbital enjeksiyon

NOT: Bu prosedürün ayrıntıları ile ilgili olarak Yardeni ve ark.'ya bakın³⁷.

1. Fareleri uyuşturmak için oksijende% 1 -% 4 inhale izofluran kullanın ve fareyi burnu bir burun konisinde olacak şekilde yan yatırın.
2. Prob çözeltisinin enjeksiyonu için ~ 29 G insülin şırıngaları kullanın (3. adımda hazırlanır).
3. Işığa maruz kalmayı önlemek için kullanmadan önce şırıngayı kapalı tutun.
4. Enjeksiyonu uygularken:
   1. Gözün içine (lakrimal karuncula) enjekte edin ve şırınganın eğiminin göze doğru açılı olduğundan emin olun. Sağ elini kullananlar için, hayvan sağa bakacak şekilde farenin sağ gözüne enjekte edilmesi önerilir.
   2. Enjekte etmeyen el ile, başı stabilize etmek ve gözün dışarı çıkmasına neden olmak için göz çevresindeki cildi nazikçe geri çekin.
   3. Şırıngayı farenin gövdesine paralel olarak açın.
   4. Şırıngayı sert bir dirençle karşılaşana kadar gözün yanından yavaşça ilerletin; Bu noktayı aşmaya çalışmayın.
   5. Prob solüsyonunu retro-orbital sinüse yavaşça enjekte edin, ardından iğneyi yavaşça göz yuvasından dışarı çekin. İğne ile herhangi bir çözelti çıkmazsa, enjeksiyon başarılıdır.
   6. Enjekte edilen göze salin veya göz merhemi sürün.
      NOT: Görüntüleme problarıyla birlikte verilen belgelere dayanarak, optimum görüntüleme süresi tipik olarak prob çözeltisinin enjeksiyonundan sonraki 1 ila 2 gün arasındadır. Mümkünse, her bir özel uygulama için en uygun görüntüleme süresini belirlemek için bir başlangıç zamanı taraması yapılması önerilir. Fareler, enjekte edilen probu yaklaşık 7 gün içinde metabolize eder, bundan sonra ek zaman noktaları istenirse yeni bir prob çözeltisi dozunun enjekte edilmesi gerekecektir.

5. Floresan yansıma görüntüleme

NOT: Bu bölümdeki prosedürler, piyasada bulunan bir optik görüntüleme sistemine özeldir (bkz. Benzer görüntülemeler benzer sistemlerle yapılabilir.

1. Fareleri oksijende %1-4 inhale izofluran ile uyuşturun ve hayvanı burnu bir burun konisinde olacak şekilde görüntüleme sistemine sırtüstü yerleştirin.
2. Fareyi, dizler hafifçe havaya bakacak şekilde alt bacakları uzatılmış olarak konumlandırın (ayakları bantlamak gerekebilir). Tüm hayvanlar için tutarlı bir konumlandırma kullanılması çok önemlidir.
3. Görüntüleme sistemi bilgisayarında uyumlu yazılımı (bkz. Malzeme Tablosu) açın; "Edinme Kontrol Paneli" görünecektir.
4. Sistemi ısıtmak için Başlat'a tıklayın ve sıcaklık ışığı yeşile dönene kadar bekleyin.
5. Imaging Wizard (Görüntüleme Sihirbazı) öğesine tıklayın ve "Imaging Wizard" (Görüntüleme Sihirbazı) penceresinin göründüğünden emin olun.
6. Filtre Çifti'ne tıklayın ve ayarın 'Epi-Aydınlatma' üzerinde olduğundan emin olun, ardından İleri'ye basın.
7. Doğru uyarma/emisyon ayarlarını seçmek için, açılır listeden ilgilendiğiniz probu bulun. Doğru probu bulamazsanız, 'Giriş Ex/Em' Adını bulun ve kullanılacak probun özelliğine göre Uyarma Zirvesi ve Emisyon Zirvesi değerini manuel olarak yazın (örneğin, Uyarma Zirvesi için 675 girin ve Emisyon Zirvesi için 720 girin). İleri'ye tıklayın.
8. "Görüntüleme Konusu" için Fare'yi seçin. "Pozlama Parametreleri"nde, Otomatik Ayarlar'ın işaretli olduğundan ve Floresan ve Fotoğraf seçeneklerinin seçildiğinden emin olun. "Görüş Alanı" kontrol listesinden D-22,6 cm'yi seçin. İleri'ye basın.
9. Görüntüleme ayarı, "Edinme Kontrol Paneli"nin sağ panelinde görülebilir ve değiştirilebilir. Tüm ayarların doğru olduğundan emin olun ve Sıra Al düğmesine basın. Görüntü göründükten sonra, görüntünün yeterli pozlamaya sahip olduğunu onaylayın. Değilse, pozlama süresi ayarını değiştirin ve tekrar Sıra Al'a tıklayın.
10. Görüntüyü analiz etmek için, siyah beyaz görüntüde her diz ekleminin üzerine tutarlı boyutta bir ilgi bölgesi (ROI) dairesi yerleştirin (bu, floresan sinyal alanlarına dayalı önyargılı konumlandırmayı önler).
11. Her diz eklemi için toplam radyant verimliliği ve/veya ortalama radyant verimliliği hesaplayın. Radyant verim kontralateral bacaklarda da hesaplanıyorsa, yaralı bacak için radyant verimlilik ölçümünü karşı bacağın radyant verimlilik ölçümüne bölerek verileri normalleştirin.
    NOT: Tüm dizler için tutarlı alana sahip bir ilgi bölgesi kullanılırsa, hem toplam radyant verimliliği hem de ortalama radyant verimliliği benzer sonuçlar verecektir. Farklı boyutlara sahip ilgi çekici bölgeler kullanılıyorsa, ortalama radyant verimliliğinin kullanılması önerilir. Yaralı eklemden gelen radyant verimlilik verilerinin yaralanmamış kontralateral dizden alınan verilerle normalleştirilmesi, enjekte edilen prob miktarındaki ve farklı hayvanlar arasındaki dağıtım verimliliğindeki herhangi bir farklılığı hesaba katmak için dahili bir kontrol sağlayacaktır.

Sonuçlar

3 aylık erkek C57BL / 6J farelerinin alt bacaklarına tek bir sıkıştırma kuvveti (yaralanmaya kadar 1 mm / s) uygulandıktan sonra, tüm farelerde sürekli olarak ACL yaralanması indüklendi. Diz yaralanmasında ortalama basınç kuvveti yaklaşık 10 N idi (Şekil 1).

FRI analizi, yaralanmadan 7 gün sonra non-invaziv ACL hasarına maruz kalan farelerin yaralı eklemlerinde önemli ölçüde daha fazla proteaz aktivitesi gösterdi (Şek...

Tartışmalar

Bu protokol, farelerde^ACL hasarını indüklemek için tekrarlanabilir, invaziv olmayan bir yöntem oluşturmuş ve titizlikle tanımlamıştır 20,21,24,33. Bu basit ve etkili yaralanma yöntemi sadece birkaç dakika içinde gerçekleştirilebilir, bu da PTOA'nın yüksek verimli çalışmalarını kolaylaştırır. Bu yaralanma yöntemi aynı zamanda insan ACL yaralanması ile ilgili yaralanm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate-Buffered Saline	Tissue Protech	PBS01-32R	or equivalent
Air Anesthetia System			Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine			Analgesic post-injury
Depilatory Cream	Veet	B001KYPZ4G	or equivalent
Fixtures			Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	06-666	or equivalent
Living Image software	Perkin Elmer
Materials testing systems	TA Instruments		Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680	Perkin Elmer	NEV10003	Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	550-82231-CS	Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell	TA Instruments		20 N capacity
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc.	SI-0236	or equivalent
WinTest software	TA Instruments		compatible with Electroforce 3200