マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

要約

非侵襲的ACL損傷は、マウスの心的外傷後変形性関節症(PTOA)を開始するための信頼性が高く、臨床的に関連性のある方法です。また、この傷害法では、プロテアーゼ活性化可能な近赤外プローブおよび蛍光反射イメージングを用いて、損傷後早期の関節におけるプロテアーゼ活性を in vivo で定量することができます。

要約

前十字靭帯(ACL)断裂や半月板断裂などの外傷性関節損傷は、通常、損傷後10〜20年以内に外傷後変形性関節症(PTOA)を引き起こします。PTOAの病因を理解するには、関節損傷によって開始される初期の生物学的プロセス(炎症、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、カテプシンプロテアーゼ、骨吸収など)を理解することが非常に重要です。しかし、これらの生物学的プロセスの in vivo 測定の選択肢はほとんどなく、侵襲的な外科的技術または注射を使用してOAを開始すると、初期の生物学的応答が交絡する可能性があります。PTOAの研究では、市販の近赤外プロテアーゼ活性化プローブと蛍光反射イメージング(FRI)を組み合わせて使用し、マウスの非侵襲的圧迫誘発性ACL損傷後の in vivo でのプロテアーゼ活性を定量化しました。この非侵襲的なACL損傷法は、臨床的に関連する損傷条件を綿密に再現し、皮膚や関節包を破壊しないため、完全に無菌的です。これらの損傷法とイメージング法の組み合わせにより、外傷性関節損傷後の複数の時点でのプロテアーゼ活性の経時変化を研究することができます。

概要

変形性関節症は、米国で何百万人もの人々が罹患している広範な健康^{問題です1。}心的外傷後変形性関節症(PTOA)は、前十字靭帯(ACL)の断裂、半月板損傷、関節内骨折などの関節損傷によって引き起こされるOAのサブセット^です2。PTOAに分類される症候性OA患者の割合は少なくとも12%^であり3、この病因は通常、特発性OA^よりも若い集団に影響を及ぼします4。OAのマウスモデルは、はるかに短いタイムライン(ヒトの10〜20年と比較して、マウスモデルでは4〜12週間)で疾患の病因と潜在的なOA治療を調査するための重要なツールです。しかし、マウスでOAを開始する方法は、一般的にACL切断^5,6、内側半月板^{5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16}の除去または不安定化、またはその2つの組み合わせなどの侵襲的な外科的技術を含む

プロトコル

記載されているすべての手順は、カリフォルニア大学デービス校の施設動物管理および使用委員会によって承認されています。本研究では、生後3ヶ月の雄のC57BL/6Jマウスを使用しました。

1.非侵襲性前十字靭帯損傷

注:外部から加えられた圧縮荷重によって生じるACL損傷は、人間のACL損傷の状態を厳密に再現するシンプルで再現可能な方法です。このプロトコルは、市販のロードフレーム機器( 材料表を参照)用に書かれていますが、同様のシステムにも適合させることができます。

1. 荷重フレーム装置と互換性のあるソフトウェア( 材料表を参照)を開き、既存の制御ファイルを選択するか、新しいファイルを作成します。
2. アクチュエータの電源を入れます。
3. キャリブレーションメニューで、ロードセルの力の読み取り値を参照し、アクチュエータの変位を 0に設定します。
4. 酸素中の1%〜4%吸入イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけ、つま先のつまむときや尾のつまむときに動物が完全に麻酔されるようにします。.
5. マウスをプラットフォーム上でうつ伏せの位置に置きます。下腿を2つの荷重固定具の間に垂直に配置します(

ディスカッション

このプロトコルは、マウス^20,21,24,33にACL損傷を誘発するための再現性のある非侵襲的な方法を確立し、厳密に説明しています。このシンプルで効率的な傷害法は、わずか数分で実施できるため、PTOAのハイスループット研究が容易になります。この傷害方法は、人間のACL損傷に関連する損傷条件も?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate-Buffered Saline	Tissue Protech	PBS01-32R	or equivalent
Air Anesthetia System			Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine			Analgesic post-injury
Depilatory Cream	Veet	B001KYPZ4G	or equivalent
Fixtures			Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	06-666	or equivalent
Living Image software	Perkin Elmer
Materials testing systems	TA Instruments		Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680	Perkin Elmer	NEV10003	Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	550-82231-CS	Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell	TA Instruments		20 N capacity
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc.	SI-0236	or equivalent
WinTest software	TA Instruments		compatible with Electroforce 3200