マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

要約

非侵襲的ACL損傷は、マウスの心的外傷後変形性関節症(PTOA)を開始するための信頼性が高く、臨床的に関連性のある方法です。また、この傷害法では、プロテアーゼ活性化可能な近赤外プローブおよび蛍光反射イメージングを用いて、損傷後早期の関節におけるプロテアーゼ活性を in vivo で定量することができます。

要約

前十字靭帯(ACL)断裂や半月板断裂などの外傷性関節損傷は、通常、損傷後10〜20年以内に外傷後変形性関節症(PTOA)を引き起こします。PTOAの病因を理解するには、関節損傷によって開始される初期の生物学的プロセス(炎症、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、カテプシンプロテアーゼ、骨吸収など)を理解することが非常に重要です。しかし、これらの生物学的プロセスの in vivo 測定の選択肢はほとんどなく、侵襲的な外科的技術または注射を使用してOAを開始すると、初期の生物学的応答が交絡する可能性があります。PTOAの研究では、市販の近赤外プロテアーゼ活性化プローブと蛍光反射イメージング(FRI)を組み合わせて使用し、マウスの非侵襲的圧迫誘発性ACL損傷後の in vivo でのプロテアーゼ活性を定量化しました。この非侵襲的なACL損傷法は、臨床的に関連する損傷条件を綿密に再現し、皮膚や関節包を破壊しないため、完全に無菌的です。これらの損傷法とイメージング法の組み合わせにより、外傷性関節損傷後の複数の時点でのプロテアーゼ活性の経時変化を研究することができます。

概要

変形性関節症は、米国で何百万人もの人々が罹患している広範な健康^{問題です1。}心的外傷後変形性関節症(PTOA)は、前十字靭帯(ACL)の断裂、半月板損傷、関節内骨折などの関節損傷によって引き起こされるOAのサブセット^です2。PTOAに分類される症候性OA患者の割合は少なくとも12%^であり3、この病因は通常、特発性OA^よりも若い集団に影響を及ぼします4。OAのマウスモデルは、はるかに短いタイムライン(ヒトの10〜20年と比較して、マウスモデルでは4〜12週間)で疾患の病因と潜在的なOA治療を調査するための重要なツールです。しかし、マウスでOAを開始する方法は、一般的にACL切断^5,6、内側半月板^{5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16}の除去または不安定化、またはその2つの組み合わせなどの侵襲的な外科的技術を含む 17,18,19は、臨床的に関連する損傷状態を再現しません。また、手術モデルは関節包の破壊により関節の炎症を悪化させ、変形性関節症の進行を加速させる可能性があります。

非侵襲的膝損傷マウスモデルは、損傷後の早い段階で生物学的および生体力学的変化を研究する機会を提供し、より臨床的に関連性のある結果をもたらす可能性があります²⁰。私たちの研究室は、マウスの前十字靭帯(ACL)断裂を誘発するために、単一の外部から加えられた脛骨圧迫過負荷を使用する非侵襲的損傷モデルを確立しました^{21、22、23、24}。この非侵襲的傷害法は、皮膚や関節包を破壊することなく、無菌関節傷害を引き起こすことができる。

蛍光反射画像法(FRI)は、特定の波長の赤外光で対象物を励起し、別の波長で放出される反射光を定量化する光学イメージング法です。市販のプロテアーゼ特異的プローブを動物モデルに注入し、FRIを使用して膝関節などの特定の部位におけるプロテアーゼ活性を定量化することができます。この方法は、炎症などの生物活性のin vivo検出に広く使用されています。このアプリケーションに使用されるプローブは、関連するプロテアーゼに遭遇するまで蛍光消光されます。これらのプロテアーゼは、プローブ上の酵素切断部位を破壊し、その後、近赤外蛍光シグナルを生成します。これらのプローブとこのイメージング法は、癌^25,26,27,28およびアテローム性動脈硬化症29,30,31,32の研究で広く検証および使用されており、私たちのグループは、炎症およびマトリックス分解のマーカーを測定するための筋骨格系の研究にそれらを使用しています23,24,33。

非侵襲的関節損傷とin vivo FRIおよびプロテアーゼ活性化プローブを組み合わせることで、外傷性関節損傷後の炎症とプロテアーゼ活性を追跡する独自の能力が得られます。この分析は、損傷後数時間または数分後に行うことができ、同じ動物を複数回評価して、関節内のプロテアーゼ活性の経時変化を研究することができます。重要なことに、このイメージング方法は、皮膚と関節包の破壊により、関節内からの信号を混乱させる蛍光信号が生じるため、OAの外科的モデルと組み合わせると実行できない可能性があります。

プロトコル

記載されているすべての手順は、カリフォルニア大学デービス校の施設動物管理および使用委員会によって承認されています。本研究では、生後3ヶ月の雄のC57BL/6Jマウスを使用しました。

1.非侵襲性前十字靭帯損傷

注:外部から加えられた圧縮荷重によって生じるACL損傷は、人間のACL損傷の状態を厳密に再現するシンプルで再現可能な方法です。このプロトコルは、市販のロードフレーム機器( 材料表を参照)用に書かれていますが、同様のシステムにも適合させることができます。

1. 荷重フレーム装置と互換性のあるソフトウェア( 材料表を参照)を開き、既存の制御ファイルを選択するか、新しいファイルを作成します。
2. アクチュエータの電源を入れます。
3. キャリブレーションメニューで、ロードセルの力の読み取り値を参照し、アクチュエータの変位を 0に設定します。
4. 酸素中の1%〜4%吸入イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけ、つま先のつまむときや尾のつまむときに動物が完全に麻酔されるようにします。.
5. マウスをプラットフォーム上でうつ伏せの位置に置きます。下腿を2つの荷重固定具の間に垂直に配置します(図1)( 材料表を参照)。足を上部の固定具の切り欠きに、膝を下部の固定具のカップに合わせます。
6. 下部固定具の高さを手動で調整して、1〜2 Nの予圧を適用し(コンピューター画面でリアルタイムで監視)、止めネジを締めて位置を保持します。予圧は、傷害荷重をかける前に脚を正しい位置に保持するために必要です。
7. 目標力(~12-15 N)または目標変位(~1.5-2.0 mm)に単一の圧縮荷重を加えます。
   注:より遅い負荷速度(~1 mm/s)で負荷をかけると、より高いレベルのリアルタイム監視と制御が可能になりますが、ACLの剥離が失敗する可能性があります。より速い負荷速度(~200 mm/s)を適用すると、中物質ACL損傷を引き起こす可能性が高くなります²²。脛骨骨折またはその他の過度の損傷が発生したと判断された場合は、動物が麻酔から回復する前に、IACUCが承認した方法を使用して動物を安楽死させます。
   1. ソフトウェア制御ファイルで荷重率を設定し、力-変位データを使用して確認します。
      注:脛骨圧迫荷重中の骨折は、骨折力(~20 N)がACL損傷力よりもかなり高いため、通常は問題になりません。ただし、これは触診で監視する必要があり、画像(すなわち、X線)を使用して、脛骨骨折が発生していないことを確認できます。
8. 損傷は通常、音(「カチッ」または「クランチ」)と力-変位プロットで識別可能な力の解放で示されます(図1C)。より遅い負荷速度を使用する場合は、損傷直後に圧縮負荷を停止して、さらなる負荷や他の関節組織への損傷を防ぎます。
   注:ACL損傷は、通常、体重に応じて8〜15Nで発生します³⁴。予想される前十字靭帯損傷力よりも大きな目標力を設定することが重要です。
9. 前部-後部引き出しテスト^35,36または関節不安定性の同等の評価を使用して、ACL損傷を確認します。
10. 動物の体重依存的な用量(例:.、0.05-0.1 mg / kg SCまたはブプレノルフィンのIP、 材料表を参照)を損傷後のマウスに投与し、所属機関IACUCによって推奨および承認された期間と用量を使用します。
    注:NSAIDは、損傷後のPTOAの進行を変化させる可能性があるため、研究の特定の目的である場合を除き、この損傷モデルでNSAIDを疼痛管理に使用することは推奨されません。

2. FRIイメージングのための動物調製

注:光学イメージングの場合、動物の毛皮(特に暗い毛皮)は光の遮断、吸収、散乱に非常に効果的であるため、イメージングする前に膝関節の周囲から毛皮をできるだけ取り除く必要があります。脱毛クリームは、通常、バリカンよりも脱毛に効果的です。ヌードマウスや無毛マウスは、毛皮を脱ぐ必要はありません。ただし、最も一般的に使用されるマウス系統(C57BL/6など)では、毛の除去が必要です。可能であれば、イメージングの前に低蛍光精製食品をマウスに与えてください。標準的なマウスチャウにはクロロフィルが含まれており、約700 nmの波長で自家蛍光を発し、近赤外FRIシステムからのデータ収集に影響を与える可能性があります。

1. 酸素中の1%〜4%吸入イソフルランでマウスを麻酔します。マウスをできるだけ加熱パッドの上に置き、目の刺激を防ぐために眼軟膏を塗ります。
2. 綿棒を使用して、膝関節の周りのマウスの脚の前(頭蓋)に脱毛クリーム( 材料表を参照)を塗布します。
3. クリームを~1分間放置してから、ワイプを使用して脚からクリームと毛皮を取り除きます。必要に応じて繰り返します。
4. 膝関節が完全に露出し、その部分を覆う毛皮がなくなったら、アルコールワイプで脚をきれいにして、残っている脱毛クリームを取り除きます。
   注:脱毛クリームは、研究全体を通して同じマウスに複数回使用できますが、これらの塗布は、皮膚の不必要な刺激を防ぐために、少なくとも1週間の間隔を空ける必要があります。

3. プローブ溶液の調製

1. 必要に応じて、蛍光活性化プローブを製造元の指示に従って滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈します。市販のプローブのバイアル1本( 材料表を参照)には、通常、0.15 mLの1x PBS中に20 nmolが含まれています。バイアル内の溶液を希釈するには、1x PBS 1.35 mL を添加し、1x PBS 1.5 mL で 20 nmol を混合します。
   注:希釈後、マウス1匹あたり0.15 mLを注入すると、1バイアルで10匹のマウスをイメージングできます。
2. 最小速度(~2000 rpm)で溶液を30秒間ボルテックスして、プローブが溶液に溶解していることを確認してから、短時間遠心分離してすべての液体が蓋から出ていることを確認します。
   注:溶液は、光から保護された場所で2〜8°Cで最大12か月間保存できます。

4.後眼窩注入

注:この手順の詳細については、Yardeni et al.を参照してください³⁷。

1. 酸素中の1%〜4%吸入イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけ、鼻を鼻錐形にしてマウスを横向きにします。
2. プローブ溶液の注入には~29Gのインスリンシリンジを使用します(ステップ3で調製)。
3. 光に当たらないように、使用前にシリンジを覆ってください。
4. 注射を投与する場合:
   1. 眼の内側(涙腺)に注射し、シリンジの斜角が眼に向かって傾いていることを確認します。.右利きの人の場合は、動物を右に向けてマウスの右目に注射することをお勧めします。
   2. 注射を打たない手で、目の周りの皮膚をそっと引き戻して頭を安定させ、目を突出させます。
   3. シリンジをマウスの本体と平行に傾けます。
   4. シリンジが硬い抵抗に達するまで、シリンジを目を越えて静かに進めます。このポイントを超えてプッシュしようとしないでください。
   5. プローブ溶液を眼窩後洞にゆっくりと注入し、針をゆっくりと眼窩から引き抜きます。針で溶液が出なければ、注射は成功です。
   6. 生理食塩水または眼軟膏を注射した眼に塗布します。
      注:イメージングプローブに付属のドキュメントに基づくと、最適なイメージング時間は通常、プローブ溶液の注入後1〜2日です。可能であれば、初期時間スクリーニングを行い、特定のアプリケーションごとに最適なイメージング時間を決定することをお勧めします。マウスは約7日以内に注入されたプローブを代謝し、その後、追加の時点が必要な場合は、新しい用量のプローブ溶液を注入する必要があります。

5. 蛍光反射イメージング

注意: このセクションの手順は、市販の光学イメージングシステムに固有のものです( 材料表を参照)。同様のイメージングは、同等のシステムでも実行できます。

1. 酸素中の1%〜4%の吸入イソフルランでマウスを麻酔し、鼻を鼻錐形にして動物を仰臥位でイメージングシステムに入れます。
2. 膝が空中でわずかに尖るように、下肢を伸ばしてマウスを配置します(足をテープで留める必要がある場合があります)。すべての動物に一貫したポジショニングを使用することが重要です。
3. イメージングシステムコンピュータで互換性のあるソフトウェア( 材料表を参照)を開きます。「取得コントロールパネル」が表示されます。
4. システムをウォームアップするには、[ 初期化 ]をクリックし、温度ライトが緑色に変わるまで待ちます。
5. [ イメージングウィザード]をクリックし、[イメージングウィザード]ウィンドウが表示されることを確認します。
6. [フィルターペア]をクリックし、設定が[落射照明]になっていることを確認してから、[次へ]を押します。
7. 正しい励起/発光設定を選択するには、プルダウンリストから目的のプローブを見つけます。正しいプローブが見つからない場合は、名前「Input Ex/Em」を見つけ、使用するプローブの特性に基づいて、励起ピークと発光ピークの値を手動で入力します(たとえば、励起ピークには675と入力し、発光ピークには720と入力します)。「 次へ」をクリックします。
8. 「被写体撮影」で マウス を選択します。「露出パラメータ」で、「 自動設定 」がチェックされ、「 蛍光灯 」と 「写真 」オプションが選択されていることを確認します。「視野」のチェックリストで D-22.6cm を選択します。 [次へ] を押します。
9. イメージング設定は、「取得コントロールパネル」の右側のパネルで確認および変更できます。すべての設定が正しいことを確認し、[ Acquire Sequence] ボタンを押します。画像が表示されたら、画像の露出が適切であることを確認します。そうでない場合は、露光時間の設定を変更し、もう一度 [Acquire Sequence ] をクリックします。
10. 画像を解析するには、白黒画像上の各膝関節に一定のサイズの関心領域(ROI)円を配置します(これにより、蛍光シグナルの領域に基づく偏った配置が防止されます)。
11. 各膝関節の総放射効率および/または平均放射効率を計算します。反対側の脚でも放射効率が計算される場合は、負傷した脚の放射効率測定値を反対側の脚の放射効率測定値で割ってデータを正規化します。
    注:すべての膝に一貫した面積を持つ関心領域を使用すると、総放射効率と平均放射効率の両方が同様の結果になります。異なるサイズの関心領域を使用する場合は、平均放射効率を使用することをお勧めします。損傷した関節からの放射効率データを、損傷していない反対側の膝からのデータで正規化することで、異なる動物間のプローブ注入量と送達効率の違いを説明するための内部制御が提供されます。

結果

生後3ヶ月の雄のC57BL/6Jマウスの下肢に1回の圧縮力(損傷までは1mm/s)を加えたところ、すべてのマウスでACL損傷が一貫して誘発された。膝損傷時の平均圧縮力は約10Nでした(図1)。

FRI解析では、非侵襲的ACL損傷を受けたマウスの損傷した関節において、損傷後7日目にプロテアーゼ活性が有意に高いことが示されました(図2)。膝関?...

ディスカッション

このプロトコルは、マウス^20,21,24,33にACL損傷を誘発するための再現性のある非侵襲的な方法を確立し、厳密に説明しています。このシンプルで効率的な傷害法は、わずか数分で実施できるため、PTOAのハイスループット研究が容易になります。この傷害方法は、人間のACL損傷に関連する損傷条件も?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate-Buffered Saline	Tissue Protech	PBS01-32R	or equivalent
Air Anesthetia System			Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine			Analgesic post-injury
Depilatory Cream	Veet	B001KYPZ4G	or equivalent
Fixtures			Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	06-666	or equivalent
Living Image software	Perkin Elmer
Materials testing systems	TA Instruments		Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680	Perkin Elmer	NEV10003	Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	550-82231-CS	Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell	TA Instruments		20 N capacity
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc.	SI-0236	or equivalent
WinTest software	TA Instruments		compatible with Electroforce 3200