非侵入性压缩诱导的前交叉韧带 （ACL） 损伤和小鼠蛋白酶活性 的体内 成像

摘要

非侵入性前交叉韧带损伤是小鼠引发创伤后骨关节炎 （PTOA） 的可靠且具有临床相关性的方法。这种损伤方法还允许使用蛋白酶可激活的近红外探针和荧光反射成像在损伤后的早期时间点对关节中的蛋白酶活性 进行体内 定量。

摘要

前交叉韧带 （ACL） 断裂或半月板撕裂等创伤性关节损伤通常在受伤后 10-20 年内导致创伤后骨关节炎 （PTOA）。了解关节损伤引发的早期生物过程（例如炎症、基质金属蛋白酶 （MMP）、组织蛋白酶蛋白酶、骨吸收）对于了解 PTOA 的病因至关重要。然而，这些生物过程 的体内 测量选择很少，如果使用侵入性手术技术或注射来启动 OA，早期生物学反应可能会混淆。在我们对 PTOA 的研究中，我们使用市售的近红外蛋白酶可激活探针结合荧光反射成像 （FRI） 来量化小鼠非侵入性压缩诱导的 ACL 损伤 后体内 蛋白酶活性。这种非侵入性 ACL 损伤方法紧密概括了临床相关的损伤状况，并且完全无菌，因为它不涉及破坏皮肤或关节囊。这些损伤和成像方法的结合使我们能够研究创伤性关节损伤后多个时间点的蛋白酶活性的时间过程。

引言

骨关节炎是一个普遍存在的健康问题，影响着美国数百万人¹.创伤后骨关节炎 （PTOA） 是 OA 的一个亚型，由关节损伤引发，例如前交叉韧带 （ACL） 断裂、半月板损伤或关节内骨折²。可归类为 PTOA 的有症状 OA 患者比例至少为 12%³，这种病因通常影响比特发性 OA 更年轻的人群⁴。OA小鼠模型是在更短的时间内（小鼠模型为4-12周，而人类为10-20年）研究疾病病因和潜在OA治疗的重要工具。然而，在小鼠中启动OA的方法通常涉及侵入性手术技术，例如ACL^横断5,6，内侧半月板^的切除或不稳定5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16，或两者的组合 17,18,19，它们不会再现临床相关的损伤状况。由于关节囊的破坏，手术模型还会加剧关节炎症，这可能会加速 OA 的进展。

非侵入性膝关节损伤小鼠模型提供了在损伤后早期时间点研究生物学和生物力学变化的机会，并可能产生更多临床相关结果²⁰。我们的实验室已经建立了一个非侵入性损伤模型，该模型使用单个外部施加的胫骨加压超负荷来诱导小鼠前交叉韧带 （ACL） 断裂^{21、22、23、24}。这种非侵入性损伤方法能够在不破坏皮肤或关节囊的情况下产生无菌性关节损伤。

荧光反射成像 （FRI） 是一种光学成像方法，涉及用特定波长的红外光激发目标并量化在另一个波长发射的反射光。市售的蛋白酶特异性探针可以注射到动物模型中，然后可以使用FRI来量化特定部位（如膝关节）的蛋白酶活性。该方法已广泛用于炎症等生物活性的体内检测。用于此应用的探针被荧光淬灭，直到它们遇到相关的蛋白酶。然后，这些蛋白酶将破坏探针上的酶切割位点，之后它们将产生近红外荧光信号。这些探针和这种成像方法已在癌症25,26,27,28和动脉粥样硬化^29,30,31,32的研究中得到广泛验证和使用，我们小组已将它们用于肌肉骨骼系统的研究，以测量炎症和基质降解的标志物23,24,33。

总之，非侵入性关节损伤与体内 FRI 和蛋白酶可激活探针相结合，提供了一种独特的能力来跟踪创伤性关节损伤后的炎症和蛋白酶活性。这种分析最早可以在受伤后数小时甚至数分钟内进行，并且可以多次评估同一动物以研究关节中蛋白酶活性的时间过程。重要的是，当与OA的手术模型结合使用时，这种成像方法可能不可行，因为皮肤和关节囊的破坏会导致荧光信号，从而混淆来自关节内的信号。

研究方案

所描述的所有程序均已获得加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用3个月大的雄性C57BL/6J小鼠。

1.无创ACL损伤

注意：由外部施加的压缩载荷产生的 ACL 损伤是一种简单且可重复的方法，可以密切概括人类的 ACL 损伤状况。该协议是为市售的负载框架仪器编写的（参见 材料表），但可以适用于类似的系统。

1. 打开与载荷框架仪器兼容的软件（参见 材料表），然后选择现有控制文件或创建新文件。
2. 打开执行器的电源。
3. 在校准菜单中，将称重传感器的力读数去皮，并将执行器的位移设置为 0。
4. 使用1%-4%吸入异氟醚的氧气麻醉小鼠，并确保通过捏脚趾和/或捏尾巴完全麻醉动物。
5. 将鼠标置于平台上的俯卧位。将小腿垂直放置在两个装载夹具之间（图 1）（参见 材料表）。将脚插入顶部固定装置的切口中，将膝盖插入底部固定装置的杯子中。
6. 手动调整底部夹具的高度以施加 1-2 N 的预紧力（在电脑屏幕上实时监控）并拧紧固定螺钉以保持该位置。在施加伤害负荷之前，需要预紧力将腿保持在正确的位置。
7. 对目标力 （~12-15 N） 或目标位移 （~1.5-2.0 mm） 施加单个压缩载荷。
   注意： 以较慢的加载速率 （~1 mm/s） 施加负载将提供更高水平的实时监测和控制，但可能会导致 ACL 撕脱失败。应用更快的加载速率（~200 mm/s）更有可能产生中物质 ACL 损伤²²。如果确定发生了胫骨骨折或其他过度损伤，请在动物从麻醉中恢复之前使用 IACUC 批准的方法对动物实施安乐死。
   1. 在软件控制文件中设置加载速率，并使用力位移数据进行确认。
      注意：胫骨加压负荷期间的骨折通常不是问题，因为骨折力 （~20 N） 远高于 ACL 损伤力。然而，应通过触诊进行监测，影像学检查（即 X 线）可用于确认没有发生胫骨骨折。
8. 损伤通常用声音（“咔哒”或“嘎吱”）和力释放来表示，这在力-位移图上是可识别的（图1C）。如果使用较慢的负荷率，则在受伤后立即停止压缩负荷，以防止进一步负荷和可能对其他关节组织造成损害。
   注意：ACL 损伤通常发生在 8-15 N，具体取决于体重³⁴。重要的是要设定一个大于预期的前交叉韧带损伤力的目标力。
9. 使用前后抽屉试验^35,36 或类似的关节不稳定评估来确认 ACL 损伤。
10. 在受伤后对小鼠施用动物体重依赖性剂量（例如，0.05-0.1mg / kg SC或丁丙诺啡的IP，参见 材料表），持续时间和剂量根据推荐和批准由家庭机构IACUC批准。
    注意：非甾体抗炎药可能会改变损伤后 PTOA 的进展，因此不建议在此损伤模型中使用非甾体抗炎药进行疼痛管理，除非这是研究的特定目的。

2. FRI成像的动物制剂

注意：对于光学成像，动物皮毛（尤其是深色皮毛）在阻挡、吸收和散射光线方面非常有效，因此，在成像前必须尽可能从膝关节周围区域去除毛皮。脱毛霜通常比理发器更有效地去除毛发。裸鼠或无毛小鼠不需要去除皮毛。然而，对于最常用的小鼠品系（例如，C57BL/6），去除毛发是必要的。如果可能，在成像前用低荧光纯化食物喂养小鼠。标准小鼠食物含有叶绿素，叶绿素的波长约为 700 nm，可能会影响近红外 FRI 系统的数据收集。

1. 用1%-4%吸入异氟醚的氧气麻醉小鼠。尽可能将小鼠放在加热垫上，并涂抹眼药膏以防止刺激眼睛。
2. 使用棉签将脱毛膏（见 材料表）涂抹在膝关节周围小鼠腿的前部（颅骨）上。
3. 让乳霜静置 ~1 分钟，然后用湿巾去除腿上的乳霜和毛发。如有必要，重复上述步骤。
4. 一旦膝关节完全暴露在没有任何毛皮覆盖该区域，请用酒精湿巾清洁腿部以去除任何残留的脱毛膏。
   注意：在整个研究过程中，脱毛霜可以多次用于同一只小鼠，但这些应用应至少间隔一周，以防止对皮肤造成不必要的刺激。

3.探针溶液的制备

1. 如有必要，根据制造商的说明在无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中稀释荧光活化探针。一小瓶市售探针（参见 材料表）通常含有 20 nmol 的 0.15 mL 1x PBS。要稀释小瓶中的溶液，加入 1.35 mL 1x PBS 以在 1.5 mL 1x PBS 中制备 20 nmol。
   注意：稀释后，当每只小鼠注射0.15mL时，可以使用一个小瓶对10只小鼠进行成像。
2. 以最低速度（~2000 rpm）涡旋溶液30秒，以确保探针溶解在溶液中，然后短暂离心以确保所有液体都从盖子中取出。
   注意：溶液可以在2-8°C下储存在避光的地方长达12个月。

4.眶后注射

注：有关此程序的详细信息，请参阅 Yardeni 等人³⁷.

1. 使用1%-4%吸入异氟醚的氧气麻醉小鼠，并将小鼠侧卧，鼻子放在鼻锥中。
2. 使用~29G胰岛素注射器注射探针溶液（在步骤3中制备）。
3. 使用前请盖好注射器，以防止暴露在光线下。
4. 注射时：
   1. 注射在眼睛内侧（泪腺），并确保注射器的斜面朝向眼睛。对于惯用右手的人，建议将动物朝右注射到鼠标的右眼中。
   2. 用非注射的手轻轻拉回眼睛周围的皮肤，以稳定头部并使眼睛突出。
   3. 将注射器与鼠标主体平行的角度。
   4. 轻轻地将注射器推进过眼睛，直到它遇到刚性阻力;不要试图超越这一点。
   5. 缓慢地将探针溶液注入眶后窦，然后缓慢地将针头从眼窝中拉出。如果针头没有溶液，则注射成功。
   6. 将生理盐水或眼药膏涂抹在注射的眼睛上。
      注意：根据成像探头随附的文档，最佳成像时间通常在注射探针溶液后 1 到 2 天之间。如果可能，建议进行初始时间筛选，以确定每个特定应用的最佳成像时间。小鼠将在大约 7 天内代谢注射的探针，之后如果需要额外的时间点，则需要注射新剂量的探针溶液。

5. 荧光反射成像

注意：本节中的程序特定于市售光学成像系统（参见 材料表）。类似的成像可以使用类似的系统进行。

1. 用1%-4%吸入异氟醚的氧气麻醉小鼠，并将动物仰卧在成像系统中，鼻子在鼻锥中。
2. 放置鼠标时，小腿伸展，使膝盖略微指向空中（可能需要用胶带固定脚）。对所有动物使用一致的定位至关重要。
3. 在成像系统计算机上打开兼容软件（见 材料表）;将出现“采集控制面板”。
4. 要预热系统，请单击 “初始化 ”并等待温度指示灯变为绿色。
5. 单击 “映像向导”，并确保出现“映像向导”窗口。
6. 单击 滤光片对，并确保设置在“Epi-Illumination”上，然后按 下一步。
7. 要选择正确的激发/发射设置，请从下拉列表中找到感兴趣的探头。如果找不到正确的探头，请找到名称“输入 Ex/Em”，然后根据要使用的探头的属性手动输入“激发峰”和“发射峰”的值（例如，对于“激发峰”，输入 675，对于“发射峰”，输入 720）。单击 “下一步”。
8. 选择鼠 标 作为“成像主体”。在“曝光参数”中，确保选中自动 设置 ，并选择 荧光 和 照片 选项。在“视野”清单中选择 D-22.6 cm 。按 下一步。
9. 可以在“采集控制面板”的右侧面板上查看和修改成像设置。确保所有设置正确，然后按 “采集序列 ”按钮。图像显示后，确认图像具有足够的曝光。如果没有，请更改曝光时间设置，然后再次单击 “获取序列 ”。
10. 要分析图像，请在黑白图像的每个膝关节上放置一个大小一致的感兴趣区域 （ROI） 圆圈（这可以防止基于荧光信号区域的偏置定位）。
11. 计算每个膝关节的总辐射效率和/或平均辐射效率。如果还计算了对侧腿的辐射效率，则通过将受伤腿的辐射效率测量值除以对侧腿的辐射效率测量值来归一化数据。
    注意：如果所有膝盖都使用面积一致的感兴趣区域，则总辐射效率和平均辐射效率将产生相似的结果。如果使用不同大小的感兴趣区域，建议使用平均辐射效率。将来自受伤关节的辐射效率数据与来自未受伤的对侧膝关节的数据归一化将提供内部控制，以解释不同动物之间探针注射量和输送效率的任何差异。

结果

在对 3 个月大的雄性 C57BL/6J 小鼠的小腿施加单一压缩力（1 mm/s 直到受伤）后，所有小鼠的 ACL 损伤始终如一。膝关节损伤时的平均压缩力约为10 N（图1）。

FRI分析显示，在受伤后7天，遭受非侵入性ACL损伤的小鼠受伤关节中的蛋白酶活性显着提高（图2）。膝关节的FRI分析也对在非侵入性ACL损伤后立即接受膝关节手术重新稳定的小鼠...

讨论

该协议已经建立并严格描述了一种可重复的、非侵入性的方法来诱导小鼠 ACL 损伤 20,21,24,33。这种简单有效的损伤方法可以在短短几分钟内完成，这有利于 PTOA 的高通量研究。这种损伤方法还密切概括了与人体前交叉韧带损伤相关的损伤状况。用于诱导小鼠OA的手术方法可能排除使用体内成像方...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate-Buffered Saline	Tissue Protech	PBS01-32R	or equivalent
Air Anesthetia System			Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine			Analgesic post-injury
Depilatory Cream	Veet	B001KYPZ4G	or equivalent
Fixtures			Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	06-666	or equivalent
Living Image software	Perkin Elmer
Materials testing systems	TA Instruments		Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680	Perkin Elmer	NEV10003	Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	550-82231-CS	Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell	TA Instruments		20 N capacity
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc.	SI-0236	or equivalent
WinTest software	TA Instruments		compatible with Electroforce 3200