非侵入性压缩诱导的前交叉韧带 （ACL） 损伤和小鼠蛋白酶活性 的体内 成像

摘要

非侵入性前交叉韧带损伤是小鼠引发创伤后骨关节炎 （PTOA） 的可靠且具有临床相关性的方法。这种损伤方法还允许使用蛋白酶可激活的近红外探针和荧光反射成像在损伤后的早期时间点对关节中的蛋白酶活性 进行体内 定量。

摘要

前交叉韧带 （ACL） 断裂或半月板撕裂等创伤性关节损伤通常在受伤后 10-20 年内导致创伤后骨关节炎 （PTOA）。了解关节损伤引发的早期生物过程（例如炎症、基质金属蛋白酶 （MMP）、组织蛋白酶蛋白酶、骨吸收）对于了解 PTOA 的病因至关重要。然而，这些生物过程 的体内 测量选择很少，如果使用侵入性手术技术或注射来启动 OA，早期生物学反应可能会混淆。在我们对 PTOA 的研究中，我们使用市售的近红外蛋白酶可激活探针结合荧光反射成像 （FRI） 来量化小鼠非侵入性压缩诱导的 ACL 损伤 后体内 蛋白酶活性。这种非侵入性 ACL 损伤方法紧密概括了临床相关的损伤状况，并且完全无菌，因为它不涉及破坏皮肤或关节囊。这些损伤和成像方法的结合使我们能够研究创伤性关节损伤后多个时间点的蛋白酶活性的时间过程。

引言

骨关节炎是一个普遍存在的健康问题，影响着美国数百万人¹.创伤后骨关节炎 （PTOA） 是 OA 的一个亚型，由关节损伤引发，例如前交叉韧带 （ACL） 断裂、半月板损伤或关节内骨折²。可归类为 PTOA 的有症状 OA 患者比例至少为 12%³，这种病因通常影响比特发性 OA 更年轻的人群⁴。OA小鼠模型是在更短的时间内（小鼠模型为4-12周，而人类为10-20年）研究疾病病因和潜在OA治疗的重要工具。然而，在小鼠中启动OA的方法通常涉及侵入性手术技术，例如ACL^横断5,6，内侧半月板^的切除或不稳定5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16，或两者的组合....

研究方案

所描述的所有程序均已获得加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用3个月大的雄性C57BL/6J小鼠。

1.无创ACL损伤

注意：由外部施加的压缩载荷产生的 ACL 损伤是一种简单且可重复的方法，可以密切概括人类的 ACL 损伤状况。该协议是为市售的负载框架仪器编写的（参见 材料表），但可以适用于类似的系统。

1. 打开与载荷框架仪器兼容的软件（参见 材料表），然后选择现有控制文件或创建新文件。
2. 打开执行器的电源。
3. 在校准菜单中，将称重传感器的力读数去皮，并将执行器的位移设置为 0。
4. 使用1%-4%吸入异氟醚的氧气麻醉小鼠，并确保通过捏脚趾和/或捏尾巴完全麻醉动物。
5. 将鼠标置于平台上的俯卧位。将小腿垂直放置在两个装载夹具之间（图 1）（参见 材料表）。将脚插入顶部固定装置的切口中，将膝盖插入底部固定装置的杯子中。
6. 手动调整底部夹具的高度以施加 1-2 N 的预紧力（在电脑屏幕上实时监控）并拧紧固定螺钉以保持该位置。在施加伤害负荷之前，需要预紧力将腿保持在正确的位置。....

讨论

该协议已经建立并严格描述了一种可重复的、非侵入性的方法来诱导小鼠 ACL 损伤 20,21,24,33。这种简单有效的损伤方法可以在短短几分钟内完成，这有利于 PTOA 的高通量研究。这种损伤方法还密切概括了与人体前交叉韧带损伤相关的损伤状况。用于诱导小鼠OA的手术方法可能排除使用体内成像方.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate-Buffered Saline	Tissue Protech	PBS01-32R	or equivalent
Air Anesthetia System			Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine			Analgesic post-injury
Depilatory Cream	Veet	B001KYPZ4G	or equivalent
Fixtures			Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	06-666	or equivalent
Living Image software	Perkin Elmer
Materials testing systems	TA Instruments		Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680	Perkin Elmer	NEV10003	Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	550-82231-CS	Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell	TA Instruments		20 N capacity
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc.	SI-0236	or equivalent
WinTest software	TA Instruments		compatible with Electroforce 3200