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La lésion non invasive du LCA est une méthode fiable et cliniquement pertinente pour initier l’arthrose post-traumatique (PTOA) chez la souris. Cette méthode permet également de quantifier in vivo l’activité de la protéase dans l’articulation à des moments précoces après la blessure à l’aide de sondes proches infrarouges activables par protéase et d’imagerie par réflectance de fluorescence.
Les blessures articulaires traumatiques telles que la rupture du ligament croisé antérieur (LCA) ou les déchirures du ménisque entraînent généralement une arthrose post-traumatique (PTOA) dans les 10 à 20 ans suivant la blessure. Comprendre les processus biologiques précoces initiés par les lésions articulaires (par exemple, l’inflammation, les métalloprotéinases matricielles (MMP), les protéases de cathepsine, la résorption osseuse) est crucial pour comprendre l’étiologie de la PTOA. Cependant, il existe peu d’options pour la mesure in vivo de ces processus biologiques, et les réponses biologiques précoces peuvent être faussées si des techniques chirurgicales invasives ou des injections sont utilisées pour initier l’arthrose. Dans nos études sur la PTOA, nous avons utilisé des sondes activables de protéase dans le proche infrarouge disponibles dans le commerce combinées à l’imagerie par réflectance de fluorescence (IRF) pour quantifier l’activité de la protéase in vivo après une lésion non invasive du LCA induite par compression chez la souris. Cette méthode non invasive de lésion du LCA récapitule fidèlement les conditions de blessure cliniquement pertinentes et est complètement aseptique car elle n’implique pas de perturber la peau ou la capsule articulaire. La combinaison de ces méthodes de blessure et d’imagerie nous permet d’étudier l’évolution temporelle de l’activité de la protéase à plusieurs moments après une blessure articulaire traumatique.
L’arthrose est un problème de santé omniprésent qui touche des millions de personnes aux États-Unis1. L’arthrose post-traumatique (PTOA) est un sous-ensemble de l’arthrose qui est initié par une blessure articulaire telle qu’une rupture du ligament croisé antérieur (LCA), une lésion du ménisque ou une fracture intra-articulaire2. La proportion de patients atteints d’arthrose symptomatique pouvant être classés comme PTOA est d’au moins 12 %3, et cette étiologie affecte généralement une population plus jeune que l’arthrose idiopathique4. Les modèles murins d’arthrose sont des outils cruciaux pour étudier l’étiologie de la maladie et les traitements potentiels de l’arthrose dans un délai beaucoup plus court (4 à 12 semaines chez les modèles murins contre 10 à 20 ans chez l’homme). Cependant, les méthodes pour initier l’arthrose chez la souris impliquent généralement des techniques chirurgicales invasives telles que la transsection du LCA 5,6, l’ablation ou la déstabilisation du ménisque médial 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, ou une combinaison des deux 17,18,19, qui ne reproduisent pas les conditions de blessure cliniquement pertinentes. Les modèles chirurgicaux exacerbent également l’inflammation de l’articulation en raison de la perturbation de la capsule articulaire, ce qui pourrait accélérer la progression de l’arthrose.
Les modèles murins non invasifs de blessures au genou offrent la possibilité d’étudier les changements biologiques et biomécaniques à des moments précoces après la blessure et peuvent donner des résultats plus pertinents sur le plan clinique20. Notre laboratoire a établi un modèle de blessure non invasif qui utilise une seule surcharge de compression tibiale appliquée de l’extérieur pour induire une rupture du ligament croisé antérieur (LCA) chez la souris 21,22,23,24. Cette méthode de blessure non invasive est capable de produire une blessure articulaire aseptique sans perturber la peau ou la capsule articulaire.
L’imagerie par réflectance de fluorescence (IRF) est une méthode d’imagerie optique qui consiste à exciter une cible avec de la lumière infrarouge à une longueur d’onde spécifique et à quantifier la lumière réfléchie émise à une autre longueur d’onde. Des sondes spécifiques à la protéase disponibles dans le commerce peuvent être injectées dans des modèles animaux et l’IRF peut ensuite être utilisée pour quantifier l’activité de la protéase à des sites spécifiques tels que l’articulation du genou. Cette méthode a été largement utilisée pour la détection in vivo d’activités biologiques telles que l’inflammation. Les sondes utilisées pour cette application sont trempées par fluorescence jusqu’à ce qu’elles rencontrent des protéases pertinentes. Ces protéases briseront ensuite un site de clivage enzymatique sur les sondes, après quoi elles produiront un signal fluorescent proche infrarouge. Ces sondes et cette méthode d’imagerie ont été largement validées et utilisées dans des études sur le cancer 25,26,27,28 et l’athérosclérose 29,30,31,32, et notre groupe les a utilisées pour des études du système musculo-squelettique afin de mesurer les marqueurs de l’inflammation et de la dégradation de la matrice 23,24,33.
Ensemble, les lésions articulaires non invasives combinées à l’IRF in vivo et aux sondes activables par protéase offrent une capacité unique à suivre l’inflammation et l’activité de la protéase après une blessure articulaire traumatique. Cette analyse peut être effectuée dès des heures, voire quelques minutes après la blessure, et le même animal peut être évalué plusieurs fois pour étudier l’évolution de l’activité de la protéase dans l’articulation. Il est important de noter que cette méthode d’imagerie peut ne pas être réalisable lorsqu’elle est combinée à des modèles chirurgicaux d’arthrose, car la perturbation de la peau et de la capsule articulaire entraîne un signal de fluorescence qui confondrait le signal de l’intérieur de l’articulation.
Toutes les procédures décrites ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Davis. Des souris C57BL/6J mâles de 3 mois ont été utilisées pour la présente étude.
1. Lésion non invasive du LCA
REMARQUE : La lésion du LCA produite par une charge de compression appliquée de l’extérieur est une méthode simple et reproductible qui récapitule fidèlement les conditions de lésion du LCA chez l’homme. Ce protocole est écrit pour un instrument de cadre de charge disponible dans le commerce (voir la Table des matériaux), mais pourrait être adapté à des systèmes similaires.
2. Préparation des animaux pour l’imagerie IRF
REMARQUE : Pour l’imagerie optique, la fourrure animale (en particulier la fourrure foncée) est très efficace pour bloquer, absorber et diffuser la lumière, par conséquent, la fourrure doit être retirée autant que possible de la zone autour des articulations du genou avant l’imagerie. Une crème dépilatoire est généralement plus efficace pour l’épilation que les tondeuses. Les souris nues ou sans poils n’ont pas besoin d’être enlevées. Cependant, l’épilation est nécessaire pour les souches de souris les plus couramment utilisées (p. ex., C57BL/6). Si possible, nourrissez les souris avec des aliments purifiés à faible fluorescence avant l’imagerie. La nourriture standard de souris contient de la chlorophylle, qui s’auto-fluoresse avec une longueur d’onde d’environ 700 nm et peut affecter la collecte de données à partir du système IRF proche infrarouge.
3. Préparation de la solution de sonde
4. Injection rétro-orbitale
REMARQUE : Se référer à Yardeni et al. pour les détails de cette procédure37.
5. Imagerie par réflectance de fluorescence
REMARQUE : Les procédures de cette section sont spécifiques à un système d’imagerie optique disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Des images similaires peuvent être réalisées avec des systèmes comparables.
Après l’application d’une seule force de compression (1 mm/s jusqu’à la blessure) sur le bas des pattes de souris mâles C57BL/6J âgées de 3 mois, une lésion du LCA a été systématiquement induite chez toutes les souris. La force de compression moyenne lors d’une blessure au genou était d’environ 10 N (figure 1).
L’analyse FRI a montré une activité protéase significativement plus élevée dans les articulations blessées des souris soumises ...
Ce protocole a établi et décrit rigoureusement une méthode reproductible et non invasive pour induire des lésions du LCA chez la souris 20,21,24,33. Cette méthode simple et efficace peut être réalisée en quelques minutes seulement, ce qui facilite les études à haut débit de la PTOA. Cette méthode récapitule également de près les conditions de blessure pertinentes pour les lésion...
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Les recherches présentées dans cette publication ont été soutenues par le National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, qui fait partie des National Institutes of Health, sous le numéro de prix R01 AR075013.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x Phosphate-Buffered Saline | Tissue Protech | PBS01-32R | or equivalent |
Air Anesthetia System | Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone | ||
Buprenorphine | Analgesic post-injury | ||
Depilatory Cream | Veet | B001KYPZ4G | or equivalent |
Fixtures | Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform | ||
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Can also use comparable optical imaging system |
Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 06-666 | or equivalent |
Living Image software | Perkin Elmer | ||
Materials testing systems | TA Instruments | Electroforce 3200 or equivalent | |
ProSense680 | Perkin Elmer | NEV10003 | Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc. |
Sterile Syringe with Needle | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 550-82231-CS | Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent |
Uniaxial load cell | TA Instruments | 20 N capacity | |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | SI-0236 | or equivalent |
WinTest software | TA Instruments | compatible with Electroforce 3200 |
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