Lesione non invasiva del legamento crociato anteriore (LCA) indotta dalla compressione e imaging in vivo dell'attività della proteasi nei topi

Riepilogo

La lesione non invasiva del legamento crociato anteriore è un metodo affidabile e clinicamente rilevante per l'avvio dell'osteoartrite post-traumatica (PTOA) nei topi. Questo metodo di lesione consente anche la quantificazione in vivo dell'attività della proteasi nell'articolazione nei primi punti temporali post-lesione utilizzando sonde nel vicino infrarosso attivabili dalla proteasi e imaging di riflettanza della fluorescenza.

Abstract

Le lesioni articolari traumatiche come la rottura del legamento crociato anteriore (LCA) o le rotture del menisco portano comunemente all'osteoartrite post-traumatica (PTOA) entro 10-20 anni dalla lesione. La comprensione dei processi biologici precoci avviati dalle lesioni articolari (ad esempio, infiammazione, metalloproteinasi della matrice (MMP), catepsina proteasi, riassorbimento osseo) è fondamentale per comprendere l'eziologia della PTOA. Tuttavia, ci sono poche opzioni per la misurazione in vivo di questi processi biologici e le risposte biologiche precoci possono essere confuse se vengono utilizzate tecniche chirurgiche invasive o iniezioni per avviare l'OA. Nei nostri studi sulla PTOA, abbiamo utilizzato sonde attivabili della proteasi nel vicino infrarosso disponibili in commercio combinate con l'imaging a riflettanza di fluorescenza (FRI) per quantificare l'attività della proteasi in vivo a seguito di lesioni non invasive del LCA indotte dalla compressione nei topi. Questo metodo non invasivo di lesione del LCA ricapitola fedelmente le condizioni di lesione clinicamente rilevanti ed è completamente asettico poiché non comporta l'interruzione della pelle o della capsula articolare. La combinazione di questi metodi di lesione e di imaging ci consente di studiare il decorso temporale dell'attività della proteasi in più punti temporali a seguito di una lesione articolare traumatica.

Introduzione

L'osteoartrite è un problema di salute pervasivo che colpisce milioni di persone negli Stati Uniti¹. L'osteoartrite post-traumatica (PTOA) è un sottogruppo dell'OA che viene avviato da una lesione articolare come la rottura del legamento crociato anteriore (LCA), una lesione del menisco o una frattura intra-articolare². La percentuale di pazienti con OA sintomatica che possono essere classificati come PTOA è di almeno il 12%³ e questa eziologia colpisce tipicamente una popolazione più giovane rispetto all'OA idiopatica⁴. I modelli murini di OA sono strumenti cruciali per studiare l'eziologia della malattia e i potenziali trattamenti per l'OA in una tempistica molto più breve (4-12 settimane nei modelli murini rispetto a 10-20 anni negli esseri umani). Tuttavia, i metodi per iniziare l'OA nei topi comportano comunemente tecniche chirurgiche invasive come la^{transezione 5,6} del LCA, la rimozione o la destabilizzazione del menisco mediale ^{5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16} o una combinazione dei due 17,18,19, che non riproducono condizioni di lesione clinicamente rilevanti. I modelli chirurgici esacerbano anche l'infiammazione dell'articolazione a causa della rottura della capsula articolare, che potrebbe accelerare la progressione dell'OA.

I modelli murini non invasivi di lesione del ginocchio offrono l'opportunità di studiare i cambiamenti biologici e biomeccanici nei primi punti temporali post-infortunio e possono produrre risultati clinicamente più rilevanti²⁰. Il nostro laboratorio ha stabilito un modello di lesione non invasivo che utilizza un singolo sovraccarico di compressione tibiale applicato esternamente per indurre la rottura del legamento crociato anteriore (LCA) nei topi 21,22,23,24. Questo metodo di lesione non invasivo è in grado di produrre una lesione articolare asettica senza interrompere la pelle o la capsula articolare.

L'imaging a riflettanza di fluorescenza (FRI) è un metodo di imaging ottico che consiste nell'eccitare un bersaglio con luce infrarossa a una lunghezza d'onda specifica e quantificare la luce riflessa emessa a un'altra lunghezza d'onda. Le sonde specifiche per proteasi disponibili in commercio possono essere iniettate in modelli animali e la FRI può quindi essere utilizzata per quantificare l'attività della proteasi in siti specifici come l'articolazione del ginocchio. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per il rilevamento in vivo di attività biologiche come l'infiammazione. Le sonde utilizzate per questa applicazione vengono temprate in fluorescenza fino a quando non incontrano proteasi rilevanti. Queste proteasi romperanno quindi un sito di scissione enzimatica sulle sonde, dopodiché produrranno un segnale fluorescente nel vicino infrarosso. Queste sonde e questo metodo di imaging sono stati ampiamente convalidati e utilizzati negli studi sul cancro 25,26,27,28 e sull'aterosclerosi 29,30,31,32, e il nostro gruppo li ha utilizzati per studi sul sistema muscolo-scheletrico per misurare i marcatori di infiammazione e degradazione della matrice 23,24,33.

Insieme, la lesione articolare non invasiva combinata con le sonde attivabili FRI e proteasi in vivo fornisce una capacità unica di monitorare l'infiammazione e l'attività della proteasi a seguito di una lesione articolare traumatica. Questa analisi può essere eseguita già ore o addirittura minuti dopo la lesione e lo stesso animale può essere valutato più volte per studiare il decorso temporale dell'attività della proteasi nell'articolazione. È importante sottolineare che questo metodo di imaging potrebbe non essere fattibile se combinato con modelli chirurgici di OA, poiché la rottura della pelle e della capsula articolare provoca un segnale di fluorescenza che confonderebbe il segnale dall'interno dell'articolazione.

Protocollo

Tutte le procedure descritte sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della California Davis. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di 3 mesi.

1. Lesione non invasiva del legamento crociato anteriore

NOTA: La lesione del legamento crociato anteriore prodotta da un carico di compressione applicato esternamente è un metodo semplice e riproducibile che ricapitola fedelmente le condizioni di lesione del legamento crociato anteriore nell'uomo. Questo protocollo è scritto per uno strumento di telaio di carico disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali), ma potrebbe essere adattato per sistemi simili.

1. Aprire il software compatibile con lo strumento del telaio di carico (vedere Tabella dei materiali) e selezionare un file di controllo esistente o crearne uno nuovo.
2. Accendere l'attuatore.
3. Nel menu di calibrazione, tarare la lettura della forza della cella di carico e impostare lo spostamento dell'attuatore su 0.
4. Utilizzare l'isoflurano inalato all'1%-4% di ossigeno per anestetizzare i topi e assicurarsi che gli animali siano completamente anestetizzati pizzicando le dita dei piedi e/o la coda.
5. Posizionare il mouse in posizione prona sulla piattaforma. Posizionare la gamba inferiore verticalmente tra due dispositivi di carico (Figura 1) (vedere la tabella dei materiali). Inserire il piede nell'apertura dell'apparecchio superiore e il ginocchio nella coppa dell'apparecchio inferiore.
6. Regolare manualmente l'altezza dell'apparecchio inferiore per applicare un precarico di 1-2 N (monitorato in tempo reale sullo schermo del computer) e serrare la vite di fermo per mantenere la posizione. Il precarico è necessario per mantenere la gamba nella posizione corretta prima di applicare il carico di lesione.
7. Applicare un singolo carico di compressione a una forza target (~12-15 N) o a uno spostamento target (~1,5-2,0 mm).
   NOTA: L'applicazione del carico a una velocità di caricamento inferiore (~1 mm/s) fornirà un livello maggiore di monitoraggio e controllo in tempo reale, ma probabilmente comporterà un errore di avulsione dell'ACL. L'applicazione di una velocità di carico più rapida (~200 mm/s) avrà maggiori probabilità di produrre una lesione del LCA a metà sostanza²². Se si determina che si è verificata una frattura tibiale o un'altra lesione eccessiva, sopprimere l'animale utilizzando un metodo approvato dalla IACUC prima che l'animale si riprenda dall'anestesia.
   1. Impostare la velocità di carico nel file di controllo del software e confermare utilizzando i dati di forza-spostamento.
      NOTA: La frattura ossea durante il carico di compressione tibiale non è in genere un problema poiché la forza di frattura (~20 N) è considerevolmente superiore alla forza di lesione del LCA. Tuttavia, questo dovrebbe essere monitorato con la palpazione e l'imaging (cioè i raggi X) può essere utilizzato per confermare che non si sono verificate fratture tibiali.
8. La lesione è tipicamente indicata da un suono ("clic" o "scricchiolio") e da un rilascio di forza identificabile sui grafici forza-spostamento (Figura 1C). Se si utilizza una velocità di carico più lenta, interrompere il carico di compressione immediatamente dopo la lesione per evitare ulteriori carichi e possibili danni ad altri tessuti articolari.
   NOTA: La lesione del legamento crociato anteriore si verifica in genere a 8-15 N a seconda della massa corporea³⁴. È importante impostare una forza target maggiore della forza prevista per la lesione del legamento crociato anteriore.
9. Confermare la lesione del legamento crociato anteriore utilizzando un test del cassetto anteriore-posteriore^35,36 o una valutazione comparabile dell'instabilità articolare.
10. Somministrare una dose dipendente dal peso dell'animale (ad esempio, 0,05-0,1 mg/kg SC o IP di buprenorfina, vedere la tabella dei materiali) ai topi dopo l'infortunio, con la durata e la dose raccomandate e approvate dall'istituzione di origine IACUC.
    NOTA: I FANS possono alterare la progressione della PTOA dopo la lesione, quindi non è raccomandato che i FANS vengano utilizzati per la gestione del dolore in questo modello di lesione, a meno che non si tratti di un obiettivo specifico dello studio.

2. Preparazione animale per l'imaging FRI

NOTA: Per l'imaging ottico, la pelliccia di animale (in particolare la pelliccia scura) è altamente efficace nel bloccare, assorbire e disperdere la luce, pertanto la pelliccia deve essere rimossa il più possibile dall'area intorno alle articolazioni del ginocchio prima dell'imaging. Una crema depilatoria è in genere più efficace per la rimozione del pelo rispetto alle tosatrici. I topi nudi o glabri non richiedono la rimozione del pelo. Tuttavia, la rimozione del pelo è necessaria per i ceppi di topi più comunemente usati (ad esempio, C57BL/6). Se possibile, nutrire i topi con cibo purificato a bassa fluorescenza prima dell'imaging. Il cibo standard per topi contiene clorofilla, che auto-fluoresce con una lunghezza d'onda di circa 700 nm e può influenzare la raccolta dei dati dal sistema FRI nel vicino infrarosso.

1. Anestetizzare i topi con l'1%-4% di isoflurano inalato nell'ossigeno. Tieni i topi su un termoforo il più possibile e applica un unguento per gli occhi per prevenire l'irritazione degli occhi.
2. Utilizzare un batuffolo di cotone per applicare la crema depilatoria (vedere Tabella dei materiali) sulla parte anteriore (cranica) delle zampe dei topi intorno all'articolazione del ginocchio.
3. Lascia riposare la crema per ~ 1 minuto, quindi usa delle salviette per rimuovere la crema e il pelo dalla gamba. Ripetere l'operazione se necessario.
4. Una volta che le articolazioni del ginocchio sono completamente esposte senza peli che coprono l'area, pulisci le gambe con salviettine imbevute di alcol per rimuovere eventuali residui di crema depilatoria.
   NOTA: La crema depilatoria può essere utilizzata sugli stessi topi più volte durante uno studio, ma queste applicazioni devono essere distanziate di almeno una settimana per evitare inutili irritazioni della pelle.

3. Preparazione della soluzione della sonda

1. Se necessario, diluire la sonda attivabile a fluorescenza secondo le istruzioni del produttore in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) 1x. Un flaconcino della sonda disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali) contiene in genere 20 nmol in 0,15 mL di PBS 1x. Per diluire la soluzione nel flaconcino, aggiungere 1,35 mL di 1x PBS per ottenere 20 nmol in 1,5 mL di 1x PBS.
   NOTA: Dopo la diluizione, è possibile utilizzare un flaconcino per l'imaging di dieci topi quando si iniettano 0,15 mL per topo.
2. Agitare la soluzione con una velocità minima (~2000 giri/min) per 30 s per assicurarsi che la sonda sia disciolta nella soluzione, quindi centrifugare brevemente per assicurarsi che tutto il liquido sia fuori dal coperchio.
   NOTA: La soluzione può essere conservata a 2-8 °C in un luogo protetto dalla luce per un massimo di 12 mesi.

4. Iniezione retroorbitale

NOTA: Fare riferimento a Yardeni et al. per i dettagli di questa procedura³⁷.

1. Utilizzare l'isoflurano inalato all'1%-4% nell'ossigeno per anestetizzare i topi e posizionare il topo su un fianco con il muso in un cono nasale.
2. Utilizzare siringhe da insulina da ~29 G per l'iniezione della soluzione della sonda (preparata al punto 3).
3. Tenere la siringa coperta prima dell'uso per evitare l'esposizione alla luce.
4. Quando si somministra l'iniezione:
   1. Iniettare all'interno dell'occhio (caruncola lacrimale) e assicurarsi che lo smusso della siringa sia inclinato verso l'occhio. Per i destrimani, si consiglia di iniettare nell'occhio destro del topo con l'animale rivolto a destra.
   2. Con la mano che non inietta, tirare delicatamente indietro la pelle intorno all'occhio per stabilizzare la testa e far sporgere l'occhio.
   3. Inclinare la siringa parallelamente al corpo del mouse.
   4. Far avanzare delicatamente la siringa oltre l'occhio fino a quando non incontra una resistenza rigida; Non tentare di spingersi oltre questo punto.
   5. Iniettare lentamente la soluzione della sonda nel seno retroorbitale, quindi estrarre lentamente l'ago dall'orbita dell'occhio. Se con l'ago non esce alcuna soluzione, l'iniezione ha esito positivo.
   6. Applicare soluzione fisiologica o unguento per gli occhi sull'occhio iniettato.
      NOTA: In base alla documentazione fornita con le sonde di imaging, il tempo di imaging ottimale è in genere compreso tra 1 e 2 giorni dopo l'iniezione della soluzione della sonda. Se possibile, si consiglia di eseguire uno screening temporale iniziale per determinare il tempo di imaging ottimale per ogni applicazione specifica. I topi metabolizzeranno la sonda iniettata entro circa 7 giorni, dopodiché sarà necessario iniettare una nuova dose di soluzione per sonda se si desiderano ulteriori punti temporali.

5. Imaging in riflettanza di fluorescenza

NOTA: Le procedure descritte in questa sezione sono specifiche per un sistema di imaging ottico disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali). Immagini simili possono essere eseguite con sistemi comparabili.

1. Anestetizzare i topi con l'1%-4% di isoflurano inalato nell'ossigeno e posizionare l'animale supino nel sistema di imaging con il muso in un cono nasale.
2. Posizionare il mouse con la parte inferiore delle gambe distese in modo che le ginocchia siano leggermente rivolte in aria (potrebbe essere necessario fissare i piedi con del nastro adesivo). È fondamentale che venga utilizzato un posizionamento coerente per tutti gli animali.
3. Aprire il software compatibile (vedere la tabella dei materiali) sul computer del sistema di imaging; apparirà il "Pannello di controllo dell'acquisizione".
4. Per riscaldare il sistema, fare clic su Inizializza e attendere che la spia della temperatura diventi verde.
5. Fare clic su Imaging Wizard e assicurarsi che venga visualizzata la finestra "Imaging Wizard".
6. Fare clic su Filter Pair (Coppia filtri) e assicurarsi che l'impostazione sia su "Epi-Illumination", quindi premere Next (Avanti).
7. Per selezionare le impostazioni corrette di eccitazione/emissione, individuare la sonda di interesse dall'elenco a discesa. Se non si riesce a trovare la sonda corretta, trovare il nome 'Input Ex/Em' e digitare manualmente il valore di Excitation Peak e Emission Peak in base alla proprietà della sonda da utilizzare (ad esempio, per Excitation Peak, immettere 675 e per Emission Peak, immettere 720). Fare clic su Avanti.
8. Scegliere Mouse per "Imaging Subject" (Soggetto imaging). In "Parametri di esposizione", assicurarsi che le impostazioni automatiche siano selezionate e che le opzioni Fluorescente e Fotografia siano selezionate. Selezionare D-22,6 cm nell'elenco di controllo di "Campo visivo". Premere Next (Avanti).
9. L'impostazione dell'immagine può essere visualizzata e modificata sul pannello di destra del "Pannello di controllo dell'acquisizione". Assicurarsi che tutte le impostazioni siano corrette e premere il pulsante Acquisisci sequenza . Dopo che l'immagine viene visualizzata, verificare che l'immagine abbia un'esposizione adeguata. In caso contrario, modificare l'impostazione del tempo di esposizione e fare nuovamente clic su Acquisisci sequenza .
10. Per analizzare l'immagine, posizionare un cerchio della regione di interesse (ROI) di dimensioni coerenti su ciascuna articolazione del ginocchio sull'immagine in bianco e nero (in questo modo si evita un posizionamento distorto basato su aree di segnale fluorescente).
11. Calcolare l'efficienza radiante totale e/o l'efficienza radiante media per ciascuna articolazione del ginocchio. Se l'efficienza radiante viene calcolata anche sulle gambe controlaterali, normalizzare i dati dividendo la misurazione dell'efficienza radiante per la gamba ferita per la misurazione dell'efficienza radiante della gamba controlaterale.
    NOTA: Se si utilizza una regione di interesse con un'area coerente per tutte le ginocchia, sia l'efficienza radiante totale che l'efficienza radiante media produrranno risultati simili. Si consiglia di utilizzare un'efficienza radiante media se si utilizzano regioni di interesse con dimensioni diverse. La normalizzazione dei dati sull'efficienza radiante dell'articolazione lesionata con i dati del ginocchio controlaterale non lesionato fornirà un controllo interno per tenere conto di eventuali differenze nella quantità di sonda iniettata e nell'efficienza di erogazione tra i diversi animali.

Risultati

Dopo aver applicato una singola forza di compressione (1 mm/s fino alla lesione) sulla parte inferiore delle zampe di topi maschi C57BL/6J di 3 mesi, la lesione del LCA è stata costantemente indotta in tutti i topi. La forza di compressione media in caso di lesione al ginocchio è stata di circa 10 N (Figura 1).

L'analisi FRI ha mostrato un'attività della proteasi significativamente maggiore nelle articolazioni danneggiate dei topi sottoposti a lesione non invas...

Discussione

Questo protocollo ha stabilito e descritto rigorosamente un metodo riproducibile e non invasivo per indurre la lesione del LCA nei topi 20,21,24,33. Questo metodo di lesione semplice ed efficiente può essere eseguito in pochi minuti, il che facilita gli studi ad alto rendimento della PTOA. Questo metodo di lesione ricapitola anche da vicino le condizioni di lesione rilevanti per la lesione del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate-Buffered Saline	Tissue Protech	PBS01-32R	or equivalent
Air Anesthetia System			Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine			Analgesic post-injury
Depilatory Cream	Veet	B001KYPZ4G	or equivalent
Fixtures			Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	06-666	or equivalent
Living Image software	Perkin Elmer
Materials testing systems	TA Instruments		Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680	Perkin Elmer	NEV10003	Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	550-82231-CS	Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell	TA Instruments		20 N capacity
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc.	SI-0236	or equivalent
WinTest software	TA Instruments		compatible with Electroforce 3200