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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para analizar los cambios en la densidad mitocondrial y la distribución longitudinal mediante imágenes de músculo esquelético vivo utilizando microscopía confocal para el escaneo de redes mitocondriales.

Resumen

La mitocondria es un orgánulo que puede alargarse, fragmentarse y renovarse según los requerimientos metabólicos de las células. La remodelación de la red mitocondrial permite que las mitocondrias sanas satisfagan las demandas celulares; Sin embargo, la pérdida de esta capacidad se ha relacionado con el desarrollo o progresión de diferentes patologías. En el músculo esquelético, se observan cambios en la densidad y distribución mitocondrial en condiciones fisiológicas y patológicas como el ejercicio, el envejecimiento y la obesidad, entre otras. Por lo tanto, el estudio de la red mitocondrial puede proporcionar una mejor comprensión de los mecanismos relacionados con esas condiciones.

Aquí, se describe un protocolo para la obtención de imágenes mitocondriales de fibras musculares esqueléticas vivas de ratas. Las fibras se diseccionan manualmente en una solución relajante y se incuban con un indicador fluorescente de imágenes de células vivas de las mitocondrias (éster etílico de tetrametilrodamina, TMRE). La señal mitocondrial se registra mediante microscopía confocal utilizando el modo de escaneo XYZ para obtener imágenes confocales de la red mitocondrial intermiofibrilar (IMF). Después de eso, las imágenes confocales se procesan mediante umbrales y binarización. La imagen confocal binarizada tiene en cuenta los píxeles positivos de las mitocondrias, que luego se cuentan para obtener la densidad mitocondrial. La red mitocondrial en el músculo esquelético se caracteriza por una alta densidad de población IMF, que tiene una distribución longitudinal periódica similar a la de los túbulos T (TT). La Transformada Rápida de Fourier (FFT) es una técnica de análisis estándar realizada para evaluar la distribución de TT que permite encontrar la frecuencia de distribución y el nivel de su organización. En este protocolo se describe la implementación del algoritmo FFT para el análisis de la distribución mitocondrial longitudinal en músculo esquelético.

Introducción

Las mitocondrias forman redes altamente dinámicas que están reguladas principalmente por el equilibrio entre su elongación (fusión) y fragmentación (fisión)1,2, que son moduladas por la expresión y actividad de proteínas como la Mitofusina 1 y 2 (Mfn1 y Mfn2), y la atrofia de la proteína óptica 1 (Opa1), que regulan la fusión de la membrana mitocondrial externa y la membrana interna, respectivamente 1,2. La proteína relacionada con la dinamina (Drp1) regula predominantemente la fisión mitocondrial cuando se fosforila en el Ser6163.

En el músculo esquelético, se ha establecido que la red mitocondrial está organizada en subpoblaciones estructuralmente bien definidas en función de su proximidad a diferentes regiones celulares (miofibrillas, sarcolemas y núcleos)4,5. Las mitocondrias ubicadas justo debajo del sarcolema se denominan mitocondrias subsarcolemales (SSM), las ubicadas entre los filamentos contráctiles se denominan mitocondrias intermiofibrilares (IMF) y la subpoblación mitocondrial alrededor de los núcleos se denomina red mitocondrial perinuclear (PMN). Además, se ha sugerido que estas subpoblaciones mitocondriales tienen funciones específicas de la región y están metabólicamente especializadas 4,5.

El mantenimiento de la homeostasis energética celular, que permite la función metabólica y contráctil, depende en gran medida de la interacción y comunicación en sitios específicos a través de la red mitocondrial (por ejemplo, interacción IMF y SSM)4,6. Además de las interacciones de la red mitocondrial, la mitocondria también puede interactuar con otros orgánulos, formando complejos estructurales y funcionales. En este sentido, se ha demostrado que la IMF puede localizarse adyacente al retículo sarcoplásmico (RS) y en las proximidades de las unidades de liberación de Ca2+ (CRU), formadas por los túbulos transversales (TT)7. Este hecho es relevante debido al papel de la captación mitocondrial de Ca2+ en la regulación de la síntesis de ATP y la apoptosis. Recientemente, también se ha sugerido un papel potencial en la regulación de los transitorios citosólicos de Ca2+ 8.

Las TT son invaginaciones de sarcolema que tienen una distribución periódica a lo largo del eje longitudinal de los cardiomiocitos y las fibras del músculo esquelético 9,10, similar a la distribución IMF 5. Los cambios en la distribución de los TT tienen importantes implicaciones fisiológicas, dado su papel en la función contráctil. Sin embargo, estos cambios se han evaluado principalmente en cardiomiocitos. El uso del análisis de la transformada rápida de Fourier (FFT) permite la conversión de señales periódicas del dominio de la distancia al dominio de la frecuencia, lo que da como resultado un espectro FFT que indica la frecuencia y la regularidad de la señal11,12,13. A pesar de que existe evidencia de que la organización de la red mitocondrial en las fibras del músculo esquelético es esencial para la adaptación a diferentes condiciones metabólicas, como durante la regeneración después de una lesión muscular14,15, la mayoría de los análisis se realizan cualitativamente.

Además, dado que la disfunción mitocondrial se ha asociado con varias enfermedades relacionadas con el músculo esquelético (p. ej., atrofia por desuso)2 y no musculares, en particular enfermedades metabólicas, y la pérdida de masa muscular asociada (es decir, atrofia)16, la evaluación cuantitativa de la red mitocondrial y la distribución en el músculo esquelético cobra relevancia. Recientemente, se ha observado una diferencia significativa en la distribución longitudinal de las mitocondrias de las fibras musculares gastrocnemias entre un grupo obeso (Ob; Zucker fa/fa rats), y un grupo magro (Lean; Zucker +/+ ratas) se identificó a través de FFT17. Este estudio demostró la utilidad de la FFT en el análisis de la distribución mitocondrial. Por lo tanto, este protocolo presenta una metodología para estudiar las mitocondrias en fibras musculares esqueléticas vivas a partir de imágenes obtenidas por microscopía confocal de fluorescencia. La densidad mitocondrial se cuantifica mediante umbrales de fondo, y también se describe el análisis de la distribución mitocondrial longitudinal mediante análisis FFT. En la Figura 1 se presenta un esquema de flujo de trabajo.

Protocolo

Todos los procedimientos de experimentación animal fueron evaluados y aprobados por el Comité de Uso y Cuidado Animal (CICUAL) del Tecnológico de Monterrey (Protocolo 2019-007). Para este estudio se utilizaron ratas Zucker macho (+/+ y fa/fa) de 12 a 13 semanas de edad. Los animales se mantuvieron en condiciones de cría estándar (ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, 40-60% de humedad) y tuvieron acceso a comida (comida estándar para ratas) y agua ad libitum.

1. Composición de la solución

  1. Prepare una solución fresca de Relax mezclando los componentes que se muestran en la Tabla 1. Ajuste el pH a 7.3 usando hidróxido de sodio (NaOH).
  2. Calcule la concentración de calcio libre en la solución Relax utilizando un programa de simulación para determinar la concentración de metal libre.
  3. Preparar un caldo de 5 mM de éster metílico de tetrametilrodamina (TMRE) en dimetilsulfóxido (DMSO) y una posterior dilución de 0,1 mM en DMSO.

2. Disección de los haces de fibras musculares del gastrocnemio

  1. Coloque al animal dentro de la cámara de inducción y cierre la tapa. Encienda la fuente de oxígeno, ajuste el caudal de gas a 0,5 L/min y ajuste el vaporizador al 4% de sevoflurano para inducir la anestesia.
  2. Una vez que la rata esté dormida, colóquela fuera de la cámara en posición supina mientras mantiene la anestesia. Pellizca el dedo del pie o la cola para verificar la falta de reflejos.
  3. Con unas tijeras, corta la piel y los músculos del abdomen. Luego, corte la caja torácica para acceder al corazón.
  4. Para realizar una cardiectomía, agarre el corazón de las venas y arterias superiores con fórceps y corte los vasos sanguíneos con unas tijeras. Retira el corazón.
  5. Inmediatamente después de la eutanasia, desinfecte la extremidad posterior con etanol y aféitela con una máquina de afeitar.
  6. Sostenga el pie trasero y haga una incisión con unas tijeras a través de la piel a nivel del tendón de Aquiles.
  7. Cortar la extremidad posterior con unas tijeras a la altura de la tibia proximal. Transfiéralo a una placa de Petri de 60 mm que contenga 3 ml de solución helada de Relax en posición dorsal. Cúbrelo con suficiente solución para evitar que los músculos se sequen.
  8. Identifique el tendón de Aquiles, levántelo cuidadosamente con fórceps y diseccione los músculos del hueso con unas tijeras de iris. Utilice un microscopio estereoscópico a partir de este paso de la disección.
  9. Identifique y separe todo el músculo gastrocnemio, el bulto principal en la parte posterior de la extremidad posterior.
  10. Disecciona y desecha el tejido conectivo y graso que rodea el músculo con pinzas de punta fina. Transfiera la cabeza lateral del músculo a una nueva placa de Petri con una solución Relax helada (ver Figura 2A).
  11. Sostenga suavemente el músculo con pinzas desde un extremo y sepárelo cuidadosamente en manojos con unas microtijeras. Siempre manipule los paquetes sosteniéndolos suavemente en un extremo con fórceps.
    NOTA: Los paquetes miden aproximadamente 10 mm de largo y 2 mm de ancho.
  12. Transfiera los haces de fibra a una nueva placa de Petri con 2 ml de solución Relax helada. Seleccione solo los que tengan una apariencia lisa, estén completos de un extremo a otro y no estén acortados (Figura 2B).

3. Adquisición de imágenes de células vivas de mitocondrias en músculo esquelético mediante microscopía confocal

  1. Incubar las fibras en 2,5 × 10-4 mM TMRE en solución Relax durante 20 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Con las concentraciones de trabajo recomendadas de TMRE, se espera que esté en modo de no enfriamiento. Protéjase de la exposición a la luz a partir de este momento.
  2. Durante el tiempo de incubación:
    1. Abra el software estándar del microscopio confocal, seleccione el marco de configuración y, en el cuadro de diálogo de configuración de hardware , seleccione láser y marque la opción HeNe 543 .
    2. En el marco de adquisición, seleccione el cuadro de diálogo de adquisición y, en el modo de adquisición, seleccione el panel XYZ.
    3. En el cuadro de diálogo XY, seleccione el formato 512 x 512, la velocidad de 400 Hz y active el panel estenopeico. En el cuadro de diálogo estenopeico que se muestra, seleccione AU para la unidad y agregue un valor de 3 Airy para el estenopeico.
      NOTA: Considere la posibilidad de reducir el tamaño del orificio más cercano al criterio óptimo de 1 Airy, si se conserva una señal de fluorescencia adecuada.
    4. En el cuadro de diálogo Configuración de trayectoria del haz , seleccione un objetivo de inmersión en agua de 20x y una apertura numérica (NA) de 0,7 (20x/0,7 IMM) y seleccione la ventana de longitud de onda de emisión de 576-700 nm. Seleccione DD488/543 y el 15% de la potencia del láser para el láser 543.
      NOTA: Se recomienda encarecidamente una lente de objetivo de inmersión en agua para el escaneo de imágenes en vivo (si está disponible). Ya que se consigue un índice de refracción similar del medio de inmersión y del medio de incubación.
  3. Después de 20 minutos de incubación, cambie el medio de incubación dos veces. Asegúrese de que las imágenes confocales se adquieran dentro de los 20-30 minutos posteriores a la incubación.
  4. Prepare la cámara de grabación con un cubreobjetos de 0,15 mm de vidrio de borosilicato.
    NOTA: Seleccione el espesor del cubreobjetos en función de la cámara de grabación disponible, teniendo en cuenta que el espesor suele oscilar entre 0,15 y 0,22 mm para un rendimiento óptimo.
  5. Agregue 200 μL de solución Relax a la cámara de registro y transfiera los haces de fibras.
  6. En el microscopio confocal, utilice el modo de campo claro para identificar fibras viables para el registro fluorescente de las mitocondrias. Las fibras viables están completas, no contraídas y tienen un patrón de estrías intacto.
  7. Separe los haces de fibras entre sí y alinéelos con pinzas. Seleccione los que estén más cerca del cubreobjetos.
  8. Escanee la fluorescencia usando el botón live para ajustar la ganancia y el desplazamiento en la consola del Panel de control teniendo en cuenta lo siguiente:
    1. Seleccione valores de intensidad fluorescente bajos para un fondo de casi 0 unidades arbitrarias (U.A.).
    2. Seleccione un nivel de ganancia entre 100 y 200 U.A. para evitar la saturación del sistema de grabación. Por lo tanto, no registre los niveles de fluorescencia más altos.
    3. Seleccione un tamaño de píxel de 150-190 nm para adquirir todo el ancho de la fibra, ajustando el factor de zoom en el cuadro de diálogo XY .
      NOTA: Considere la posibilidad de utilizar el tamaño de píxel más cercano a los criterios de Nyquist (90 nm), lo que permite el escaneo de todo el ancho de la fibra.
  9. En el cuadro de diálogo Pila Z, ajuste la distancia Z para adquirir la señal de fluorescencia a partir de una profundidad de fibra de 15 μm (botón de inicio) hasta 22 μm (botón de finalización). Seleccione 3 μm como tamaño de paso Z.
  10. Haga clic en el botón Inicio para adquirir las imágenes confocales. Obtenga una pila Z compuesta por tres imágenes confocales adquiridas a 15, 18 y 21 μm de profundidad.

4. Análisis de la densidad mitocondrial

  1. En la plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas18, abra el archivo Z-stack y gire las imágenes para colocar la fibra horizontalmente, como se muestra en la Figura 3B.
  2. Seleccione aleatoriamente una región rectangular de interés (ROI) que incluya el área ocupada por las mitocondrias (ROImito). Seleccione tamaños de mito ROI que van de 65 a 90 μm para X. Para Y, el tamaño dependerá del ancho de la fibra, evitando su periferia.
  3. Duplique la pila Z con el mitode ROI seleccionado y guárdela como una nueva pila Z (Mito-stack) en formato TIFF. Guarde la posición MITO de ROI seleccionada en la pila original con la herramienta Administrador de ROI.
  4. Calcule el umbral para la resta de fondo de la siguiente manera:
    1. Utilice el método abreviado comando+mayús+t para abrir el cuadro de diálogo Umbral .
    2. Seleccione el algoritmo de umbral Otsu |Blanco y negro | Opción de fondo oscuro . Observe que la imagen ahora está binarizada.
    3. En el cuadro de diálogo Umbral , observe el histograma de la distribución de la intensidad de fluorescencia y el valor de umbral que se muestra.
      NOTA: Los píxeles positivos para mitocondrias tienen valores de intensidad de fluorescencia mayores que el umbral y aparecen como píxeles blancos en la imagen binaria.
    4. Aplique el umbral a la pila de imágenes binarias seleccionando Aplicar. En el cuadro de diálogo Convertir pila a binario que se muestra, seleccione las opciones Calcular umbral para cada imagen, Fondo negro, Crear nueva pila y haga clic en Aceptar.
  5. Observe que se genera una pila con las tres imágenes binarias (BinDMito-stack). Guárdalo en formato TIFF.
  6. Calcule la densidad mitocondrial en la pila BinDMito de la siguiente manera:
    1. Seleccione el menú Analizar . A continuación, haga clic en Histograma. En el cuadro de diálogo Histograma que se muestra, haga clic en Sí para incluir todas las imágenes de la pila para su análisis.
    2. En el cuadro de diálogo Histograma de pila , haga clic en Lista para obtener los datos del histograma. Transfiera los datos del histograma a una hoja de cálculo.
    3. En una hoja de cálculo, identifique los mitopíxeles que son los que tienen el valor 255 . Calcule la densidad mitocondrial usando la ecuación (1):
      Densidad mitocondrial = figure-protocol-11035 × 100 (1)
      El total de píxeles se identifica como N en el cuadro de diálogo Histograma o se calcula sumando en la hoja de cálculo el recuento de píxeles del histograma.
    4. Para calcular el área ocupada por las mitocondrias (μm2), multiplique los mitopíxeles de la pila BinDMito por el tamaño del píxel.

5. Análisis de la distribución mitocondrial mediante transformada rápida de Fourier

  1. En la plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas, abra la pila BinDMito y dibuje un ROI rectangular de 256 píxeles de ancho y 5 μm de alto. Ubique un ROI en una posición central y otro en una posición lateral, como se muestra en la Figura 4A,B.
  2. Utilice la herramienta Administrador de ROI para configurar los ROI para el análisis FFT y guárdelo.
    NOTA: De acuerdo con las necesidades del análisis, se pueden seleccionar otros ROI en diferentes posiciones y se pueden modificar sus tamaños. Sin embargo, el ancho debe ser igual a 2n píxeles para realizar FFT (por ejemplo, 128, 256, 512 píxeles).
  3. Obtenga el perfil de trazado de los ROI utilizando el comando de acceso directo + k y transfiera los datos a una hoja de cálculo.
  4. En la hoja de cálculo, rellene las columnas B y C con los datos obtenidos del perfil de trazado. La columna B contiene la distancia en μm, y la columna C el valor de gris correspondiente de la intensidad de fluorescencia (U.A.).
  5. La columna D corresponde a la frecuencia FFT (evento/μm), que se rellenará de la siguiente manera:
    1. Calcule la frecuencia de muestreo (Fs): Fs = 1/Δ d, donde Δd es el paso de distancia (el segundo valor de B).
    2. Calcule Δ Fs: Δ Fs= Fs/N, donde N es el número de puntos de datos de B (256).
    3. Calcule el valor de parada de la frecuencia FFT (S ): S = (N/2) ×ΔFs.
    4. Rellene la columna D de la siguiente manera:
      1. El primer valor de la columna D es igual a 0.
      2. Seleccione la segunda celda de la columna D, vaya al menú de inicio, seleccione relleno y haga clic en serie. Seleccione columnas. Para el valor del paso, utilice el Δ Fs. calculado. Para el valor de parada, utilice la S calculada.
    5. A continuación, rellene la columna E con los valores complejos FFT de la siguiente manera:
      1. Inserte 0 en la primera celda de la columna C, porque la distancia 0 debe coincidir con una señal 0 para el cálculo de la FFT.
      2. A continuación, vaya al menú Datos , haga clic en Análisis de datos y seleccione Análisis de Fourier.
      3. En la nueva ventana, seleccione el rango de puntos de datos de la señal fluorescente descrito en la columna C para el rango de entrada.
        NOTA: El número de puntos de datos debe ser de 2n (por ejemplo, 256 o 128 puntos de datos de señal fluorescente).
      4. Seleccione el rango correspondiente de la E para el rango de salida.
      5. Seleccione Aceptar y deje que los valores complejos FFT se completen automáticamente.
  6. Rellene la columna F con la magnitud FFT de la siguiente manera:
    1. Utilice la función IMABS para devolver el valor absoluto en F a partir del número complejo en E y multiplíquelo por 2/N para normalizar (ecuación (2)):
      Magnitud FFT = (IM.ABS (E1... En) × (2/N) (2)
  7. Grafique el espectro FFT utilizando la magnitud FFT en F, en función de la frecuencia FFT en D, hasta S. Encuentre el punto del pico máximo y su frecuencia FFT correspondiente.
  8. Convierta la frecuencia FFT del pico máximo en distancia con la ecuación (3). Esta distancia calculada representa la distancia longitudinal de la distribución mitocondrial.
    Distancia (μm) = 1/frecuencia FFT (3)
    NOTA: Debido a la simetría FFT, no trace la frecuencia FFT más allá del valor S , que corresponde a la mitad de los puntos de datos, evitando la duplicación del espectro FFT.

6. Pasos opcionales de preprocesamiento para reducir el ruido de la imagen antes del análisis de la imagen

  1. Aplique un filtro de mediana o una deconvolución 2D de la siguiente manera:
    1. Para el filtro mediano:
      1. Seleccionar proceso | Filtra y haz clic en la opción Mediana .
      2. En el cuadro de diálogo Mediana que se muestra, seleccione 2.0 para Radio y haga clic en Aceptar. Elija Yes (Sí ) para aplicar el proceso a todas las imágenes de la pila de mitos.
      3. Observe la reducción del ruido en las imágenes.
    2. Para la deconvolución 2D:
      1. Genere una función de dispersión de puntos (PSF) teórica.
      2. Descargue el complemento PSF_Generator.jar y coloque el archivo en la carpeta "Complementos".
      3. En el cuadro de diálogo del generador de PSF , haga clic en la opción Modelo óptico 3D de Born & Wolf, introduzca el valor de inmersión del índice de refracción de 1,33 utilizado durante el escaneo confocal y seleccione Mejor para la opción de cálculo de precisión .
      4. Captura 576 nm para la longitud de onda de emisión, el NA de la lente objetivo utilizada de 0,7 y el paso Z de 3.000 nm.
      5. Capture el tamaño de píxel XY de la imagen confocal que se va a deconvolucir, así como el tamaño XYZ que indica el número de píxeles de X e Y y el número de pasos Z (3 para este protocolo).
      6. En el menú Visualización del generador de PSF, haga clic en la opción lineal, seleccione Resolución de 8 bits y, a continuación, seleccione la opción grises para la tabla de búsqueda (LUT).
      7. Ejecute el generador de PSF y guarde el PSF teórico creado en formato TIFF.
      8. Realice una suma de cortes del PSF creado abriendo la herramienta Proyecto Z de la opción Pilas que se encuentra en el menú Imagen .
      9. En el cuadro de diálogo ZProjection que se muestra, seleccione Sumar sectores para el tipo de proyección y haga clic en Aceptar. Guarde el nuevo PSF en formato TIFF.
        NOTA: Se puede utilizar una PSF obtenida experimentalmente mediante microesferas fluorescentes de barrido confocal con un diámetro conocido en lugar de la PSF teórica.
      10. Descarga el plugin "DeconvolutionLab_2.jar"19 y colócalo en la carpeta del plugin.
      11. Haz clic en el menú Plugins. A continuación, haga clic en DeconvolutionLab2.
      12. Separe las imágenes confocales de la pila de mitos utilizando la herramienta Imágenes para apilar desde la opción Pilas ubicada en el menú Imagen y guárdela en formato TIFF.
      13. En el cuadro de diálogo DeconvolutionLab2 , seleccione una de las imágenes obtenidas de la pila Mito. Seleccione el PSF teórico creado y seleccione el algoritmo Richardson-Lucy con 15 iteraciones.
      14. Ejecute DeconvolutionLab2, verifique la mejora de la señal y la reducción de ruido en la imagen y guárdela en formato TIFF.
  2. Continúe con el paso 4.4 para el análisis de imágenes.
  3. Para la creación de umbrales de las imágenes deconvolutadas, conviértalas en una máscara de 8 bits durante el proceso de creación de umbrales. Cree una pila con las imágenes binarias y deconvoneadas seleccionando Imágenes para apilar en la herramienta Pilas del menú Imagen .
  4. Para el análisis FFT de imágenes deconvoneadas, el perfil de trazado contiene la distancia en unidades de píxeles. Transforme las unidades de píxel a μm de la siguiente manera:
    1. En la hoja de cálculo, después de completar el paso 5.4, transfiera los datos de B a A. A continuación, rellena B con la distancia en μm multiplicando cada número de píxel de A por el tamaño de píxel.

Resultados Representativos

Siguiendo el presente protocolo, se puede lograr el análisis de la densidad y distribución de las mitocondrias en músculo esquelético vivo. El protocolo se divide en tres etapas principales: disección del haz muscular esquelético, exploración por microscopía confocal y análisis de imágenes. La descripción general del flujo de trabajo se presenta en la Figura 1. La Figura 2A muestra un músculo gastrocnemio de rata entero en una placa de Petri, marcando la cabeza lateral de la que se obtienen las fibras, mientras que la Figura 2B muestra los haces de fibras en la solución Relax. Mediante microscopía confocal, se pueden registrar las mitocondrias a lo largo de la profundidad de la fibra muscular esquelética viva utilizando el indicador fluorescente TMRE. TMRE es un fluoróforo catiónico lipofílico que se acumula selectivamente dentro de las mitocondrias de acuerdo con el potencial de membrana mitocondrial20.

Se puede obtener una imagen confocal óptima de IMF seleccionando una distancia Z superior a 15 μm de profundidad dentro de la fibra (Figura 3A). La Figura 3B muestra imágenes confocales XY representativas de mitocondrias cargadas con TMRE adquiridas a lo largo de la distancia Z de las fibras musculares gastrocnemias (15 a 21 μm). Las imágenes confocales se procesaron mediante umbral para transformarlas en imágenes binarias que permitieran el análisis mitocondrial. La Figura 3B (panel izquierdo) muestra una fibra de una rata Lean ejercitada. Representa un registro confocal esperado de las mitocondrias de la fibra del músculo esquelético, ya que tiene un patrón consistente a lo largo de la fibra. Por el contrario, seleccionamos una fibra de una rata Ob (Figura 3B, panel derecho) que muestra alteraciones sustanciales en el contenido y distribución mitocondrial. La Figura 3C muestra la cuantificación del área de fibra ocupada por las mitocondrias expresada como densidad mitocondrial, obtenida a partir de cada imagen binarizada (mostrada en el panel B). Como era de esperarse, la fibra Ob presentó una menor densidad mitocondrial. Se cuantificó consistentemente a lo largo de la distancia Z analizada, que también se observa en la Figura 3D cuando se calcula la densidad mitocondrial por pila conformada por las tres imágenes confocales adquiridas a 15, 18 y 21 μm.

Al igual que el análisis de la densidad mitocondrial, el barrido confocal de un indicador fluorescente para la obtención de imágenes de células vivas, como TMRE, permite estudiar la organización longitudinal de las mitocondrias en el músculo esquelético vivo. IMF presenta una organización periódica en la banda I cercana a TT7, que puede ser analizada por FFT para cuantificar la frecuencia de la señal mitocondrial y el nivel de organización17. En la Figura 4 se muestran las diferencias en la organización de la IMF encontradas en gastrocnemios derivados de ratas Lean y Ob y cómo la FFT permite encontrar los cambios en la distribución de la señal mitocondrial. Las Figuras 4A, B exhiben ROI longitudinales seleccionadas en una posición central y lateral en la fibra para el análisis FFT. Antes de realizar FFT, se calcula el umbral para la sustracción de fondo. A continuación, la imagen se binariza; Estos procedimientos eliminan las variaciones en los niveles de intensidad de fluorescencia de la señal mitocondrial. La imagen binaria proporciona el perfil gráfico de la distribución de fluorescencia necesaria para realizar la FFT.

La Figura 4C, D muestra los ROI seleccionados en los paneles A y B con sus perfiles de trazado (paneles superiores). A partir de los perfiles de las parcelas, se pueden observar diferencias en la distribución de fluorescencia entre las fibras derivadas de ratas Lean y Ob, así como las variaciones entre ROIs dentro de la misma fibra. Para cada perfil de parcela, se presenta su respectivo espectro FFT (paneles inferiores). El pico del espectro FFT máximo indica la frecuencia FFT (eje X) de la distribución de la señal mitocondrial a lo largo del eje longitudinal. Se puede transformar en un valor de distancia cercano a 2 μm en los ROI lateral y central de la rata Lean. Cabe destacar que la magnitud FFT del pico es un índice de la regularidad de la señal mitocondrial, y los cambios en esta amplitud revelan alteraciones en la distribución mitocondrial.

La Figura 4E, F muestra las diferencias en el espectro FFT entre las fibras Lean y derivadas de Ob donde se analizaron las ROI laterales y centrales, respectivamente. En las ROI laterales (Figura 4E) la frecuencia de distribución longitudinal mitocondrial fue similar en las fibras magras y derivadas de Ob; sin embargo, la amplitud del pico máximo de FFT en las fibras derivadas de Ob fue mayor, lo que concuerda con la mayor regularidad de la señal observada en la imagen de la Figura 4B. Sin embargo, el ROI central (Figura 4F) del Ob se observa como un ejemplo de una reducción crítica del pico de FFT en comparación con el Lean cuando está presente una alteración importante de la distribución mitocondrial.

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Figura 1: Esquema para el análisis mitocondrial en músculo esquelético mediante microscopía confocal. Este esquema resume los pasos principales del protocolo en tres fases separadas. La primera fase, la disección de los haces de fibras musculares del gastrocnemio, se subdivide en tres pasos posteriores, el aislamiento del músculo gastrocnemio, seguido de la disección mecánica del músculo en haces para finalmente hacer una selección visual de los viables. La segunda fase consiste en la adquisición de imágenes de células vivas mediante microscopía confocal, que consiste en la incubación con el fluoróforo (TMRE) durante 20 min a temperatura ambiente para colocar las fibras en la cámara. Posteriormente, se realizan los ajustes apropiados en el microscopio para llevar a cabo la adquisición de las imágenes confocales. Durante la tercera fase, se lleva a cabo el procesamiento de imágenes confocales y el análisis de datos. Empezando por el procesamiento de imágenes, donde se requiere un umbral para generar imágenes binarias a partir de las cuales se realizan cálculos de densidad mitocondrial y distribución mitocondrial por FFT. Abreviaturas: TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina; FFT = Transformada rápida de Fourier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Disección del haz de músculo esquelético. (A ) Cabeza de gastrocnemio lateral de rata disecada (flecha negra) en una placa de Petri con solución Relax. (B) Imagen representativa de los haces de fibras musculares de gastrocnemio en la solución Relax antes de la carga de TMRE. Abreviatura: TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Análisis de densidad mitocondrial. (A) Ilustración que representa la distancia Z recomendada para el escaneo confocal de las mitocondrias IMF en fibras musculares esqueléticas. (B) Serie de imágenes confocales de mitocondrias cargadas con TMRE en fibras musculares esqueléticas, obtenidas de una rata Zucker +/+ ejercitada (Lean) y de una rata Zucker fa/fa obesa (Ob) registradas en la distancia Z (de 15 a 21 μm de profundidad). Las imágenes se procesaron mediante umbrales y se transformaron en imágenes binarias. (C) Calculó la mitodensidad de los cortes confocales obtenidos a diferentes distancias Z observadas en el panel B. (D) La mitodensidad obtenida de la pila compuesta por las imágenes observadas en el panel B. Las imágenes del panel B son de 65 x 50 μm. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: Mitodensidad = Densidad mitocondrial; IMF = mitocondrias intermiofibrilares; Ob = Obeso; SSM = mitocondrias subsarcolemales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Análisis de la distribución mitocondrial por FFT. Imágenes confocales representativas de mitocondrias cargadas con el indicador fluorescente TMRE adquiridas a 21 μm de la profundidad de las fibras del músculo esquelético obtenidas de una rata Zucker +/+ ejercitada (Lean, panel A) y de una rata Zucker fa/fa obesa (Ob, panel B). Las imágenes se procesaron mediante umbrales y se transformaron en imágenes binarias. ROI lateral y central del panel A (panel C) y panel B (panel D) con sus respectivos perfiles de gráficos de intensidad de fluorescencia (gráfico superior) y espectro FFT (gráfico inferior). La FFT se calculó a partir de ROI con 256 píxeles de ancho, lo que corresponde a un tamaño de ROI de 39 x 5 μm en el panel A y un tamaño de ROI de 50 x 5 μm en el panel B. El panel E muestra las diferencias del espectro FFT encontradas entre las mitocondrias derivadas de ratas Lean y Ob en el ROI lateral, mientras que el panel F muestra las diferencias del espectro FFT del ROI central. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: A.U. = Unidades arbitrarias; FFT = Transformada rápida de Fourier; ROI = regiones de interés; Ob = Obeso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ReactivoConcentración final en 100 mLAcción 
K-aspartato100 mM
Kcl20 mM
HEPES20 mM
Ácido L-glutámico3 mM
Ácido málico3 mM
EGTA0,1 mM10 mM
MgCl21 mM de Mg2+ libre
CaCl20,00002 mM de Ca2+ libre
Fosfocreatina di-Na5 mM500 mM
Creatina fosfoquinasa5 U/mL200 U/mL
MgATP5 mM
pH 7,3 (con NaOH)

Tabla 1: Reactivos de solución relajante y concentración.

Figura complementaria S1: Efecto de los métodos de preprocesamiento de imágenes. (A) Imágenes confocales representativas de mitocondrias cargadas con el indicador fluorescente TMRE adquiridas a una profundidad de 18 μm en fibras musculares esqueléticas obtenidas de una rata Zucker +/+ ejercitada (Lean, panel superior) y de una rata Zucker fa/fa obesa (panel inferior), junto con sus respectivas imágenes obesas obtenidas después del preprocesamiento utilizando el umbral de Otsu, el filtro mediano y el umbral de Otsu, y deconvolución 2D y umbral de Otsu. (B) Perfil gráfico de la mitodensidad obtenido a partir de las imágenes confocales (panel A) después del preprocesamiento con diferentes métodos. Las imágenes del panel A son de 65 x 50 μm. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: 2D-Decon = deconvolución 2D; Mitodensidad = Densidad mitocondrial. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Las mitocondrias son orgánulos con una alta capacidad de remodelación. Su contenido, densidad y distribución pueden modificarse rápidamente a través de la activación de los mecanismos de fusión y fisión mitocondrial, conocidos como dinámica mitocondrial1, y el equilibrio entre los mecanismos de recambio mitocondrial: la biogénesis mitocondrial y la vía especializada de degradación de las mitocondrias, mitofagia21,22. El contenido y la morfología mitocondrial pueden variar según el tipo de célula y la etapa de desarrollo y pueden ser remodelados bajo diferentes estímulos fisiológicos y patológicos 17,22,23,24. Por lo tanto, el estudio de la morfología mitocondrial ha sido relevante durante más de medio siglo25. Cabe destacar que el análisis de las mitocondrias a través de microscopía electrónica ha sido la técnica estándar aplicada en múltiples estudios26.

Los estudios fluorescentes por microscopía confocal han ganado relevancia en los últimos años debido a su capacidad para obtener imágenes de células vivas de mitocondrias a diferentes profundidades de fibra, lo que podría ayudar a comprender mejor el papel de las mitocondrias en el músculo esquelético en diferentes condiciones adaptativas y desadaptativas27. En este estudio se describe una metodología para el análisis de la densidad y distribución mitocondrial en fibras musculares esqueléticas vivas mediante microscopía confocal. Uno de los principales desafíos de trabajar con fibras musculares esqueléticas vivas es evitar la contracción desde los procesos de aislamiento hasta el registro confocal mitocondrial. Para lograr este objetivo, se utiliza una solución17 de Relax con alto contenido de Mg y ATP para mantener las fibras relajadas durante al menos 2 h, lo que da tiempo suficiente para llevar a cabo el proceso de aislamiento de fibras, la carga de fluoróforos y la adquisición de la señal mitocondrial por microscopía confocal. Un punto crítico del protocolo es la obtención mecánica de las fibras, ya que requiere de alta precisión y tejido fresco; Sin embargo, es posible obtener haces de fibras viables a partir del músculo de rata con esta técnica previamente utilizada y reportada28. La obtención de fibras intactas permite preservar el sarcolema y el ambiente intracelular, manteniendo la diafonía metabólica y funcional entre las estructuras celulares28,29.

A diferencia del trabajo con tejidos o células fijas, la adquisición de imágenes fluorescentes de células vivas mediante microscopía confocal permite monitorizar en tiempo real el efecto de diversas condiciones experimentales. El presente protocolo se puede utilizar para explorar los cambios en la densidad y distribución mitocondrial en tiempo real y explorar las diferencias entre los grupos experimentales, como los ejemplos presentados aquí entre las fibras derivadas de Lean y Ob (Figura 3 y Figura 4). Siempre se debe tener en cuenta que la obtención de imágenes de células vivas implica la estandarización de condiciones óptimas de trabajo con un daño celular menor. El tiempo de trabajo, la calidad de las soluciones utilizadas, los parámetros de adquisición y la exposición de los láseres deben controlarse con precisión. Por lo tanto, a continuación se mencionan consideraciones esenciales.

Las mitocondrias de las fibras musculares no se pueden registrar completamente longitudinalmente mediante microscopía confocal debido al tamaño de la fibra y al daño de la fibra que puede causar la exposición prolongada al láser. Sin embargo, bajo esta técnica se registra una muestra representativa de la fibra. Aunque es posible registrar todo el espesor de la fibra muscular esquelética de una rata mediante microscopía confocal, esto implica un mayor tiempo de registro y exposición al rayo láser. En el caso de las ratas de control, no se han encontrado problemas con estas grabaciones. Sin embargo, las fibras de condiciones patológicas pueden ser más susceptibles al daño, como se observa en las fibras de ratas Ob. En consecuencia, se prefiere adquirir una pila de imágenes confocales representativas obtenidas a diferentes distancias Z. Cuando solo se registra una sección de espesor de fibra, se recomienda tomar la pila a la misma profundidad en todas las fibras ensayadas, ya que la distribución y densidad mitocondrial puede variar según su posición dentro de la fibra. Se recomienda la adquisición de la señal a una profundidad superior a 15 μm para obtener imágenes confocales representativas de IMF, evitando las poblaciones de MUS que se sitúan cerca de la periferia.

Durante la adquisición confocal, se deben tener en cuenta algunas consideraciones importantes. En primer lugar, la selección de la lente del objetivo de inmersión teniendo en cuenta el aumento, la alta NA y el medio de inmersión. Dado que las células se mantienen en un medio de incubación hidrófilo, el índice de refracción del medio de incubación e inmersión debe ser similar para obtener una buena señal y escanear profundamente en el tejido. Por lo general, se logra con una lente de objetivo de inmersión en agua. Las imágenes confocales de la Figura 3 y la Figura 4 se adquirieron con un objetivo de inmersión en agua de 20x y 0,7 NA. Este objetivo permite el registro de la fibra en toda su profundidad, pero se decidió el barrido a 15, 18 y 21 μm ya que se pueden obtener imágenes confocales representativas de IMF con señal de alta intensidad de fluorescencia y menor daño a la fibra. Se pueden considerar otros aumentos, como 40x y aceite como medio de inmersión, pero deben evaluarse.

En segundo lugar, el tamaño de píxel para la adquisición de imágenes se calcula de acuerdo con el teorema de Nyquist, que permite la selección de un tamaño de píxel apropiado que evita la sobremuestrea (mayor exposición al láser) y la submuestra (conduce a una menor resolución)30. El cálculo depende de las características de la lente del objetivo seleccionada y de la longitud de onda (~90 nm). Se puede ajustar con el zoom; Por lo tanto, solo una configuración de zoom proporciona un tamaño de píxel óptimode 30. Sin embargo, en la práctica, el zoom también depende de la zona de la muestra a analizar. Así, encontrar el equilibrio permite trabajar con un tamaño de píxel que se acerque más al criterio de Nyquist y que además se ajuste al área a analizar. La Figura 3 y la Figura 4 se adquirieron con un tamaño de píxel de 150 y 190 nm, lo que permitió analizar el ancho total de la fibra, que es de ~50-80 μm.

En tercer lugar, se debe utilizar un diámetro de agujero de alfiler adecuado que evite que la luz desenfocada llegue al detector. Normalmente, 1 Airy se considera el tamaño óptimo de estenopeico, ya que permite la detección de ~80% de los fotones que se originan en el plano de enfoque30. Sin embargo, algunas muestras biológicas teñidas que muestran bajos niveles de fluorescencia requieren un aumento estenopeico30. Las imágenes confocales de la Figura 3 y la Figura 4 se adquirieron con un tamaño estenopeico de 3 Airy debido a una señal baja capturada con un Airy más bajo. Es importante tener en cuenta que el aumento de la intensidad de la señal resultante del aumento del tamaño del estenopeico conduce a la reducción de la resolución debido al aumento de la luz capturada desenfocada. Por esta razón, recomendamos usar un tamaño de agujero de alfiler lo más cercano posible a 1 aireado.

Cuando se adquieren adecuadamente, las imágenes confocales pueden procesarse para obtener información cuantitativa sobre la densidad y distribución mitocondrial. En cualquier caso, el paso crítico de la imagen de procesamiento de los umbrales debe realizarse antes del análisis para mejorar la cuantificación de la señal. Durante este paso crucial, se define el valor de intensidad de fluorescencia que separa los píxeles positivos de las mitocondrias de los del fondo. El umbral se puede definir mediante un ajuste gaussiano del pico que representa las mitocondrias cuando el histograma de la imagen muestra dos picos, uno correspondiente al fondo y el otro a las mitocondrias. Sin embargo, no siempre se consigue una distribución bimodal en cada una de las imágenes, por lo que hay que aplicar otros métodos de umbral.

En este protocolo, se describe la implementación del umbral de Otsu, que es un método no paramétrico y no supervisado diseñado para encontrar el valor umbral cuando los dos picos no están separados, u otros picos están presentes31. Otsu se puede aplicar fácilmente utilizando una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas; sin embargo, se pueden probar otros métodos de umbral. Se debe aplicar el mismo método de umbral a todas las imágenes confocales y debe calcularse de forma independiente para cada imagen confocal. Aplicar el umbral a una pila completa conduce a resultados incorrectos. Una vez obtenidas las imágenes binarias tras el proceso de umbralización, se puede realizar fácilmente el análisis de la densidad mitocondrial y de la FFT siguiendo las instrucciones descritas en este protocolo. Sin embargo, se debe tener cuidado al realizar ambos análisis para evitar incluir núcleos y capilares, ya que daría lugar a errores de cuantificación. En cuanto a la densidad, basta con restar los píxeles, o el área ocupada por los núcleos o capilares, a los píxeles o área total a analizar. Además, al realizar el análisis FFT, se debe verificar que la señal mitocondrial sea recta. Por el contrario, cuando la señal mitocondrial está inclinada, puede producir perfiles que no representan la distribución longitudinal mitocondrial, lo que produce datos incorrectos del espectro FFT. Además, se puede aplicar un paso de preprocesamiento para reducir el ruido en las imágenes. Este protocolo describe dos pasos de preprocesamiento opcionales mediante un filtro mediano y deconvolución 2D. Los efectos de estos métodos de preprocesamiento sobre la imagen y el contenido de densidad mitocondrial se presentan en la Figura Suplementaria S1. Es importante tener en cuenta que, si bien estos preprocesos pueden mejorar la calidad de la imagen, también pueden provocar la pérdida de ciertos detalles de la imagen. Por lo tanto, deben usarse con precaución y aplicarse de manera consistente a todas las imágenes que se analizan.

A pesar de sus ventajas, la microscopía confocal está limitada por una resolución lateral (XY) de 180-250 nm cuando se dan las condiciones óptimas para su adquisición32. El diámetro mitocondrial es de ~200-700 nm, cerca del límite de difracción de la microscopía confocal; por lo tanto, las estructuras submitocondriales no pueden ser detectadas adecuadamente33 y no pueden ser evaluadas por los análisis de densidad y FFT que se muestran en este protocolo. Se pueden explorar otras técnicas de microscopía de superresolución, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), la nanoscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED) o la microscopía de iluminación estructurada (SIM), para resolver estructuras submitocondriales32. En este protocolo, las imágenes confocales de las mitocondrias se obtienen utilizando el fluoróforo TMRE, que depende del potencial de membrana mitocondrial. Por lo tanto, la intensidad fluorescente mitocondrial puede variar según su potencial de membrana. Se realiza un proceso de umbral antes del análisis de datos para superar este problema. Todos los píxeles por encima de un umbral definido se consideran positivos para la señal mitocondrial independientemente de su valor de fluorescencia. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las mitocondrias con un potencial de membrana muy bajo no pueden resolverse con esta técnica. Por lo tanto, se recomiendan estudios complementarios de cuantificación del contenido de proteínas mitocondriales. Una ventaja del uso de TMRE es que las imágenes confocales también se pueden utilizar para el análisis del potencial de membrana mitocondrial, pero es necesario realizar controles adecuados con agentes de desacoplamiento como la carbonilcianuro-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP). Además, las instrucciones para el análisis de la densidad y distribución mitocondrial se pueden lograr utilizando indicadores fluorescentes verdes para las mitocondrias, que cargan las mitocondrias independientemente de su potencial de membrana, pero la estrategia de incubación y los ajustes de adquisición confocal deben estandarizarse.

Dado que la estructura de las mitocondrias está relacionada con funciones mitocondriales y celulares esenciales, el protocolo descrito aquí puede proporcionar información valiosa sobre su remodelación durante la enfermedad o por un daño de estrés particular. Podría contribuir a una mejor comprensión de las funciones clave del músculo esquelético gobernado por las mitocondrias, como la producción de energía, o en las que las mitocondrias juegan un papel importante en la interacción con otros orgánulos, como el acoplamiento contracción-metabolismo. Seguir las instrucciones del protocolo permite estimar la densidad mitocondrial y la distribución en el músculo esquelético vivo. Los pasos del protocolo se dividen en tres etapas principales centradas en la disección del haz muscular esquelético, la exploración con microscopía confocal y el análisis de imágenes, donde se incluyen instrucciones detalladas y consideraciones importantes. En particular, el protocolo se puede optimizar aún más para explorar pasos Z adicionales para la reconstrucción mitocondrial completa dentro de la fibra de acuerdo con las necesidades del usuario. Por ejemplo, los pasos de imagen y análisis confocal se pueden probar para estudiar estructuras celulares con una distribución similar, como TT en muestras vivas y fijas.

Divulgaciones

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Facultad de Medicina y el Instituto de Investigación de la Obesidad del Tecnológico de Monterrey. La Figura 3A fue creada con el software Scientific Image and Illustration.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichA6419
Borosilicate glass coverslipWarner Instruments64-0709
Calcium chlorideSigma-AldrichC5670
Confocal microscopeLeicaTCS SP5
Confocal microscope software Leica Application Suite Leica2.7.3.9723
Creatine PhosphokinaseSigma-AldrichC3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)Biomedical Imaging Group, EPFLhttp://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
Dimethyl SulfoxideSigma-AldrichD2650
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrateSigma-Aldrich11240
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acidSigma-AldrichE4378
ForcepsMiltexMH-18
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective Leica506517
HEPESSigma-AldrichH3375
Iris scissorsMiltex5-304
L-(-)-Malic acidSigma-AldrichM7397
L-glutamic acid monosodium salt hydrateSigma-AldrichG1626
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2393
MaxchelatorUC Davis Healthhttps://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm 
Micro scissorsMiltex18-1633
Open-source platform for biological-image analysis Fiji Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fijihttps://fiji.sc/
Phosphocreatine disodium salt hydrateSigma-AldrichP7936
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333
PSF Generator (PSF_Generator.jar)Biomedical Imaging Group, EPFLhttp://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ 
Recording chamberWarner InstrumentsRC-27N
Sodium hydroxideSigma-AldrichS5881
Spreadsheet Microsoft ExcelMicrosoft 
Stereo microscopeZeissStemi 508
Tetramethylrhodamine, ethyl esterInvitrogenT669

Referencias

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