Sıçan Canlı İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Yoğunluk ve Boyuna Dağılımın Konfokal Mikroskopi ile Analizi

Özet

Burada, mitokondriyal ağ taraması için konfokal mikroskopi kullanarak canlı iskelet kası görüntüleme ile mitokondriyal yoğunluk ve uzunlamasına dağılımdaki değişiklikleri analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Mitokondri, hücrelerin metabolik gereksinimlerine göre uzatılabilen, parçalanabilen ve yenilenebilen bir organeldir. Mitokondriyal ağın yeniden şekillenmesi, sağlıklı mitokondrinin hücresel talepleri karşılamasına izin verir; Ancak bu kapasitenin kaybı farklı patolojilerin gelişmesi veya ilerlemesi ile ilişkilendirilmiştir. İskelet kasında, diğerlerinin yanı sıra egzersiz, yaşlanma ve obezite gibi fizyolojik ve patolojik durumlarda mitokondriyal yoğunluk ve dağılım değişiklikleri gözlenir. Bu nedenle, mitokondriyal ağın incelenmesi, bu koşullarla ilgili mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.

Burada, sıçanlardan alınan canlı iskelet kası liflerinin mitokondri görüntülemesi için bir protokol açıklanmaktadır. Lifler, rahatlatıcı bir çözelti içinde manuel olarak diseke edilir ve mitokondrinin floresan canlı hücre görüntüleme göstergesi (tetrametilrodamin etil ester, TMRE) ile inkübe edilir. Mitokondri sinyali, intermiyofibriler mitokondriyal (IMF) ağın konfokal görüntülerini elde etmek için XYZ tarama modu kullanılarak konfokal mikroskopi ile kaydedilir. Bundan sonra, konfokal görüntüler eşikleme ve ikilileştirme ile işlenir. İkili konfokal görüntü, mitokondri için pozitif pikselleri hesaba katar ve bunlar daha sonra mitokondriyal yoğunluğu elde etmek için sayılır. İskelet kasındaki mitokondriyal ağ, T-tübüllerinkine (TT) benzer periyodik bir uzunlamasına dağılıma sahip olan yüksek yoğunluklu bir IMF popülasyonu ile karakterize edilir. Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT), TT'nin dağılımını değerlendirmek için gerçekleştirilen ve dağılım sıklığını ve organizasyon seviyesini bulmayı sağlayan standart bir analiz tekniğidir. Bu protokolde, iskelet kasındaki uzunlamasına mitokondriyal dağılımın analizi için FFT algoritmasının uygulanması açıklanmaktadır.

Giriş

Mitokondri, esas olarak uzaması (füzyon) ve parçalanması (fisyon) arasındaki denge ile düzenlenen oldukça dinamik ağlar ^{oluşturur.1,2,} Mitofusin 1 ve ² (Mfn1 ve Mfn2) ve Optik protein atrofisi 1 (Opa1), dış mitokondriyal zarın ve iç zarın füzyonunu düzenler, sırasıyla ^1,2. Dinamin ile ilişkili protein (Drp1), Ser616^3'te fosforile edildiğinde ağırlıklı olarak mitokondriyal fisyonu düzenler.

İskelet kasında, mitokondriyal ağın, farklı hücre bölgelerine (miyofibriller, sarkolemma ve çekirdekler) yakınlıklarına bağlı olarak yapısal olarak iyi tanımlanmış alt popülasyonlarda düzenlendiği iyi ^{bilinmektedir4,5}. Sarkolemmanın hemen altında bulunan mitokondrilere subsarkolemmal mitokondri (SSM), kasılma filamentleri arasında bulunanlara intermiyofibriler mitokondri (IMF) ve çekirdeklerin etrafındaki mitokondriyal alt popülasyona perinükleer mitokondri ağı (PMN) denir. Ayrıca, bu mitokondriyal alt popülasyonların bölgeye özgü işlevlere sahip olduğu ve metabolik olarak özelleştiği öne sürülmüştür ^4,5.

Metabolik ve kasılma fonksiyonuna izin veren hücresel enerji homeostazının korunması, büyük ölçüde mitokondriyal ağ (örneğin, IMF ve SSM etkileşimi) aracılığıyla belirli bölgelerdeki etkileşime ve iletişime ^{bağlıdır4,6}. Mitokondri ağ etkileşimlerine ek olarak, mitokondri diğer organellerle de etkileşime girerek yapısal ve fonksiyonel kompleksler oluşturabilir. Bu bağlamda, IMF'nin sarkoplazmik retikulumun (SR) bitişiğinde ve enine tübüller (TT) tarafından oluşturulan Ca²⁺ salım birimlerinin (CRU) yakınında bulunabileceği ^{gösterilmiştir7}. Bu gerçek, mitokondriyal^Ca2+ alımının ATP sentezini ve apoptozu düzenlemedeki rolü nedeniyle önemlidir. Son zamanlarda, sitozolik Ca²⁺ geçişlerinin düzenlenmesinde potansiyel bir rol de önerilmiştir⁸.

TT, IMF dağılımına^benzer şekilde, kardiyomiyositlerin ve iskelet kası liflerinin^{uzunlamasına ekseni 9,10} boyunca periyodik bir dağılıma sahip olan sarkolemma istilalarıdır 5. TT'nin dağılımındaki değişiklikler, kasılma fonksiyonundaki rolleri göz önüne alındığında önemli fizyolojik etkilere sahiptir. Bununla birlikte, bu değişiklikler esas olarak kardiyomiyositlerde değerlendirilmiştir. Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) analizinin kullanılması, periyodik sinyallerin mesafe alanından frekans alanına dönüştürülmesine izin verir, bu da^11,12,13 sinyalinin frekansını ve düzenliliğini gösteren bir FFT spektrumu ile sonuçlanır. İskelet kası liflerinde mitokondriyal ağın organizasyonunun, kas yaralanması sonrası rejenerasyon sırasında olduğu gibi farklı metabolik koşullara adaptasyon için gerekli olduğuna dair kanıtlar olmasına rağmen^14,15, çoğu analiz kalitatif olarak gerçekleştirilir.

Ek olarak, mitokondriyal disfonksiyonun iskelet kası ile ilgili çeşitli (örneğin, kullanılmama atrofisi)² ve kas dışı hastalıklar, özellikle metabolik hastalıklar ve ilişkili kas kütlesi kaybı (yani atrofi)¹⁶ ile ilişkili olduğu göz önüne alındığında, mitokondriyal ağın ve iskelet kasındaki dağılımın kantitatif değerlendirmesi önem taşır. Son zamanlarda, obez bir grup arasında gastroknemius kas liflerinin mitokondrilerinin uzunlamasına dağılımında önemli bir fark (Ob; Zucker fa /fa sıçanları) ve yalın bir grup (Yalın; Zucker +/+ sıçanları) FFT¹⁷ ile tanımlandı. Bu çalışma, FFT'nin mitokondriyal dağılımı analiz etmedeki yararlılığını göstermiştir. Bu nedenle, bu protokol, floresan konfokal mikroskopi ile elde edilen görüntülerden canlı iskelet kası liflerinde mitokondriyi incelemek için bir metodoloji sunar. Mitokondriyal yoğunluk, arka plan eşiklemesi ile ölçülür ve FFT analizi ile uzunlamasına mitokondriyal dağılımın analizi de açıklanmaktadır. Şekil 1'de bir iş akışı şeması sunulmuştur.

Protokol

Tüm hayvan deney prosedürleri, Tecnologico de Monterrey'in Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi (CICUAL) tarafından değerlendirilmiş ve onaylanmıştır (Protokol 2019-007). Bu çalışma için 12 ila 13 haftalık erkek Zucker (+/+ ve fa/fa) sıçanları kullanıldı. Hayvanlar standart hayvancılık koşullarında (12 saat / 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü,% 40-60 nem) tutuldu ve yiyeceğe (standart sıçan yemi) ve suya ad libitum'a erişimleri vardı.

1. Çözelti bileşimi

1. Tablo 1'de gösterilen bileşenleri karıştırarak taze Relax solüsyonu hazırlayın. Sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak pH'ı 7.3'e ayarlayın.
2. Serbest metal konsantrasyonunu belirlemek için bir simülasyon programı kullanarak Relax çözeltisindeki serbest kalsiyum konsantrasyonunu hesaplayın.
3. Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 5 mM'lik bir tetrametilrodamin metil ester (TMRE) stoğu ve ardından DMSO'da 0.1 mM'lik bir seyreltme hazırlayın.

2. Gastroknemius kas lifi demetlerinin diseksiyonu

1. Hayvanı indüksiyon odasının içine yerleştirin ve kapağı kapatın. Oksijen kaynağını açın, gaz akış hızını 0,5 L/dk'ya ayarlayın ve anesteziyi indüklemek için buharlaştırıcıyı %4 sevoflurana ayarlayın.
2. Sıçan uykuya daldıktan sonra, anesteziyi korurken odanın dışına sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Refleks eksikliğini doğrulamak için ayak parmağını veya kuyruğu sıkıştırın.
3. Makasla karın derisini ve kaslarını kesin. Ardından, kalbe erişmek için göğüs kafesini kesin.
4. Kardiyektomi yapmak için, kalbi forseps ile en üstteki damarlardan ve arterlerden kavrayın ve kan damarlarını makasla kesin. Kalbi çıkarın.
5. Ötenaziden hemen sonra, arka ayağı etanol ile dezenfekte edin ve bir tıraş makinesi kullanarak tıraş edin.
6. Arka ayağı tutun ve Aşil tendonu seviyesinde deriden makasla bir kesi yapın.
7. Arka ayağı proksimal tibia seviyesinde makasla kesin. Sırt pozisyonunda 3 mL buz gibi soğuk Relax solüsyonu içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Kasların kurumasını önlemek için yeterli solüsyonla örtün.
8. Aşil tendonunu tanımlayın, forseps ile dikkatlice kaldırın ve kasları iris makası ile kemikten uzaklaştırın. Diseksiyonun bu adımından itibaren bir stereomikroskop kullanın.
9. Arka ayağın arkasındaki ana kütle olan tüm gastroknemius kasını tanımlayın ve ayırın.
10. İnce uçlu forseps ile kası çevreleyen bağ ve yağ dokusunu inceleyin ve atın. Kasın lateral başını buz gibi soğuk Relax solüsyonu ile yeni bir Petri kabına aktarın (bkz. Şekil 2A).
11. Kası bir ucundan forseps ile nazikçe tutun ve mikromakasla dikkatlice demetlere ayırın. Demetleri her zaman forseps ile bir ucundan tutarak manipüle edin.
    NOT: Demetler yaklaşık 10 mm uzunluğunda ve 2 mm genişliğindedir.
12. Lif demetlerini 2 mL buz gibi soğuk Relax solüsyonu içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Yalnızca pürüzsüz bir görünüme sahip, bir uçtan diğer uca tamamlanmış ve kısaltılmamış olanları seçin (Şekil 2B).

3. Konfokal mikroskopi ile iskelet kasında mitokondrinin canlı hücre görüntüleme kazanımı

1. Lifleri 2,5 × ^10-4 mM TMRE'de Relax solüsyonunda oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
   NOT: TMRE'nin önerilen çalışma konsantrasyonları ile söndürülmeyen modda olması beklenir. Bu noktadan itibaren ışığa maruz kalmaktan koruyun.
2. Kuluçka süresi boyunca:
   1. Konfokal mikroskop standart yazılımını açın, konfigürasyon çerçevesini seçin ve donanım konfigürasyonu iletişim kutusunda lazeri seçin ve HeNe 543 seçeneğini işaretleyin.
   2. Alma çerçevesinde, alma iletişim kutusunu seçin ve alma modunda XYZ panelini seçin.
   3. XY iletişim kutusunda, 512 x 512 biçimini, 400 Hz hızını seçin ve iğne deliği panelini işaretleyin. Görüntülenen iğne deliği iletişim kutusunda, birim için AU'yu seçin ve iğne deliği için 3 Airy değerini ekleyin.
      NOT: Yeterli bir floresan sinyali korunuyorsa, 1 Airy optimal kriterine en yakın iğne deliği boyutunu azaltmayı düşünün.
   4. Işın Yolu Ayarları iletişim kutusunda, 20x suya daldırma hedefi ve 0,7 (20x/0,7 IMM) sayısal açıklık (NA) seçin ve 576-700 nm emisyon dalga boyu penceresini seçin. 543 lazer için DD488/543'ü ve lazer gücünün %15'ini seçin.
      NOT: Canlı görüntüleme taraması için suya daldırmalı objektif lens şiddetle tavsiye edilir (varsa). Daldırma ortamının ve inkübasyon ortamının benzer bir kırılma indisi elde edildiğinden.
3. 20 dakikalık inkübasyondan sonra, inkübasyon ortamını iki kez değiştirin. Konfokal görüntülerin inkübasyondan sonra 20-30 dakika içinde elde edildiğinden emin olun.
4. Kayıt odasını 0,15 mm'lik bir borosilikat cam lamel ile hazırlayın.
   NOT: Optimum performans için kalınlığın genellikle 0.15 ila 0.22 mm arasında değiştiğini göz önünde bulundurarak, lamel kalınlığını mevcut kayıt odasına göre seçin.
5. Kayıt odasına 200 μL Relax solüsyonu ekleyin ve fiber demetlerini aktarın.
6. Konfokal mikroskopta, mitokondrinin floresan kaydı için canlı lifleri tanımlamak için parlak alan modunu kullanın. Canlı lifler tamdır, büzülmez ve sağlam bir çizgilenme modeline sahiptir.
7. Lif demetlerini birbirinden ayırın ve forseps ile hizalayın. Lamel en yakın olanları seçin.
8. Aşağıdakileri göz önünde bulundurarak Kontrol Paneli konsolunda kazancı ve ofseti ayarlamak için canlı düğmeyi kullanarak floresansı tarayın:
   1. Yaklaşık 0 Keyfi Birimden (AU) oluşan bir arka plan için düşük floresan yoğunluk değerlerini seçin.
   2. 100 ile 200 AU arasında bir kazanç seviyesi seçin.kayıt sisteminin doygunluğunu önlemek için. Bu nedenle, en yüksek floresan seviyelerini kaydetmeyin.
   3. Fiberin tam genişliğini elde etmek için 150-190 nm'lik bir piksel boyutu seçin ve XY iletişim kutusunda yakınlaştırma faktörünü ayarlayın.
      NOT: Fiberin tam genişliğinin taranmasına izin veren Nyquist kriterlerine (90 nm) daha yakın piksel boyutunu kullanmayı düşünün.
9. Z yığını iletişim kutusunda, 15 μm fiber derinliğinden (başlangıç düğmesi) başlayarak 22 μm'ye (bitiş düğmesi) kadar floresan sinyalini almak için Z mesafesini ayarlayın. Z adımı boyutu olarak 3 μm'yi seçin.
10. Tıkla Başlama Konfokal görüntüleri elde etmek için düğmesine basın. 15, 18 ve 21 μm derinlikte elde edilen üç konfokal görüntüden oluşan bir Z-yığını elde edin.

4. Mitokondriyal yoğunluğun analizi

1. Biyolojik görüntü analizi için açık kaynaklı platformda¹⁸ Z-stack dosyasını açın ve Şekil 3B'de gösterildiği gibi fiberi yatay olarak yerleştirmek için görüntüleri döndürün.
2. Mitokondrinin (ROI _mito) kapladığı alanı içeren dikdörtgen bir ilgi alanını (ROI) rastgele seçin. X için 65 ila 90 μm arasında değişen ROI_mito boyutlarını seçin. Y için boyut, çevresinden kaçınarak lif genişliğine bağlı olacaktır.
3. Z yığınını seçilen ROI_mito ile çoğaltın ve TIFF formatında yeni bir Z yığını (Mito yığını) olarak kaydedin. ROI Manager aracıyla orijinal yığında seçilen ROI_mito konumunu kaydedin.
4. Arka plan çıkarma eşiğini aşağıdaki gibi hesaplayın:
   1. Eşik iletişim kutusunu açmak için command+shift+t kısayolunu kullanın.
   2. Eşik algoritmasını seçin Otsu |S&B | Koyu arka plan seçeneği. Görüntünün artık ikili hale getirildiğini gözlemleyin.
   3. Eşik iletişim kutusunda, floresan yoğunluğu dağılımının histogramına ve görüntülenen eşik değerine bakın.
      NOT: Mitokondri pozitif pikseller, eşikten daha büyük floresan yoğunluğu değerlerine sahiptir ve ikili görüntüde beyaz pikseller olarak görünür.
   4. Uygula'yı seçerek eşiği ikili görüntü yığınına uygulayın. Görüntülenen Yığını İkiliye Dönüştür iletişim kutusunda, Her görüntü için eşiği hesapla, Siyah arka plan, Yeni yığın oluştur seçeneklerini belirleyin ve Tamam'ı tıklatın.
5. Üç ikili görüntü içeren bir yığının oluşturulduğunu gözlemleyin (BinDMito-yığını). TIFF formatında kaydedin.
6. BinDMito yığınındaki mitokondriyal yoğunluğu aşağıdaki gibi hesaplayın:
   1. Analiz menüsünü seçin. Ardından, Histogram'ı tıklayın. Görüntülenen histogram iletişim kutusunda, yığının tüm görüntülerini analiz için dahil etmek üzere Evet'i tıklatın.
   2. Yığın Histogramı iletişim kutusunda, histogram verilerini almak için Liste'yi tıklatın. Histogram verilerini bir elektronik tabloya aktarın.
   3. Bir e-tabloda, 255 değerine sahip Mito piksellerini belirleyin. Denklem (1) kullanarak Mitokondriyal yoğunluğu hesaplayın:
      Mitokondriyal yoğunluk = × 100 (1)
      Toplam pikseller, Histogram iletişim kutusunda N olarak tanımlanır veya elektronik tabloda histogramın piksel sayısı toplanarak hesaplanır.
   4. Mitokondrinin kapladığı alanı hesaplamak için (^μm2), BinDMito yığınının Mito piksellerini piksel boyutuyla çarpın.

5. Hızlı Fourier Dönüşümü ile mitokondriyal dağılımın analizi

1. Biyolojik görüntü analizi için açık kaynaklı platformda, BinDMito yığınını açın ve 256 piksel genişliğinde ve 5 μm yüksekliğinde dikdörtgen bir ROI çizin. Şekil 4A,B'de gösterildiği gibi, bir ROI'yi merkezi bir konumda ve diğerini yanal konumda bulun.
2. FFT analizi için ROI'leri yapılandırmak ve kaydetmek için ROI Manager aracını kullanın.
   NOT: Analizin gerekliliklerine göre, diğer ROI'ler farklı pozisyonlarda seçilebilir ve boyutları değiştirilebilir. Bununla birlikte, FFT gerçekleştirmek için genişliğin 2ⁿ piksele eşit olması gerekir (örneğin, 128, 256, 512 piksel).
3. Command + k kısayolunu kullanarak ROI'lerin çizim profilini elde edin ve verileri bir elektronik tabloya aktarın.
4. Elektronik tabloda, B ve C sütunlarını çizim profilinden elde edilen verilerle doldurun. B sütunu μm cinsinden mesafeyi içerir ve C sütunu floresan yoğunluğunun (AU) karşılık gelen gri değerini içerir.
5. D sütunu, aşağıdaki gibi doldurulacak olan FFT frekansına (olay/μm) karşılık gelir:
   1. Örnekleme frekansını (Fs) hesaplayın: Fs = 1/Δ d, burada Δd mesafe adımıdır (B'nin ikinci değeri).
   2. ΔFs'yi hesaplayın: Δ Fs= Fs/N, burada N, B'nin (256) veri noktalarının sayısıdır.
   3. FFT frekansının (S) durdurma değerini hesaplayın: S = (N/2) ×ΔFs.
   4. D sütununu aşağıdaki gibi doldurun:
      1. D sütununun ilk değeri 0'a eşittir.
      2. D sütunundaki ikinci hücreyi seçin, ana menüye gidin, doldur'u seçin ve seri'ye tıklayın. Sütunları seçin. Adım değeri için hesaplanan Δ Fs'yi kullanın. Durdurma değeri için hesaplanan S'yi kullanın.
   5. Ardından, E sütununu FFT karmaşık değerleriyle aşağıdaki gibi doldurun:
      1. FFT'nin hesaplanması için 0 mesafesinin 0 sinyaliyle çakışması gerektiğinden, C sütununun ilk hücresine 0 ekleyin.
      2. Ardından, Veri menüsüne gidin, Veri Analizi'ne tıklayın ve Fourier Analizi'ni seçin.
      3. Yeni pencerede, giriş aralığı için C sütununda açıklanan floresan sinyalin veri noktaları aralığını seçin.
         NOT: Veri noktalarının sayısı 2ⁿ olmalıdır (örneğin, floresan sinyalin 256 veya 128 veri noktası).
      4. Çıkış aralığı için karşılık gelen E aralığını seçin.
      5. Tamam'ı seçin ve FFT karmaşık değerlerinin otomatik olarak doldurulmasına izin verin.
6. F sütununu FFT büyüklüğü ile aşağıdaki gibi doldurun:
   1. E'deki karmaşık sayıdan F'deki mutlak değeri döndürmek ve normalleştirmek için 2/N ile çarpmak için IMABS işlevini kullanın (denklem (2)):
      FFT büyüklüğü = (IM.ABS (E₁... E_n) × (2/N) (2)
7. FFT spektrumunu, S'ye kadar D'deki FFT frekansının bir fonksiyonu olarak F'deki FFT büyüklüğünü kullanarak çizin.
8. Maksimum tepe noktasının FFT frekansını denklem (3) ile mesafeye dönüştürün. Bu hesaplanan mesafe, mitokondriyal dağılımın uzunlamasına mesafesini temsil eder.
   Mesafe (μm) = 1/FFT frekansı (3)
   NOT: FFT simetrisi nedeniyle, FFT spektrumunun tekrarlanmasını önlemek için FFT frekansını veri noktalarının yarısına karşılık gelen S değerinin ötesine çizmeyin.

6. Görüntü analizinden önce görüntü gürültüsünü azaltmak için isteğe bağlı ön işleme adımları

1. Aşağıdaki gibi bir medyan filtre veya 2B evrişim dekonvolüsyonu uygulayın:
   1. Medyan filtre için:
      1. İşlem Seç | Filtreler ve Medyan seçeneğine tıklayın.
      2. Görüntülenen Medyan iletişim kutusunda, Yarıçap için 2.0'ı seçin ve Tamam'ı tıklatın. İşlemi Mito yığınındaki tüm görüntülere uygulamak için Evet'i seçin.
      3. Görüntülerdeki gürültünün azaldığını gözlemleyin.
   2. 2D evrişim için:
      1. Teorik bir Nokta Yayılma Fonksiyonu (PSF) oluşturun.
      2. Eklentiyi PSF_Generator.jar indirin ve dosyayı "Eklentiler" klasörüne yerleştirin.
      3. PSF oluşturucu iletişim kutusunda, Born & Wolf 3D optik model seçeneğine tıklayın, konfokal tarama sırasında kullanılan 1.33 Kırılma indisi daldırma değerini girin ve Doğruluk hesaplama seçeneği için En İyisi'ni seçin.
      4. Emisyon dalga boyu için 576 nm, kullanılan objektif lensin NA değeri 0,7 ve Z adımı 3.000 nm'dir.
      5. Evrişimi kaldırılacak konfokal görüntünün XY piksel boyutunun yanı sıra X ve Y piksel sayısını ve Z adımlarının sayısını (bu protokol için 3) gösteren XYZ boyutunu yakalayın.
      6. PSF oluşturucunun Görüntü menüsünde doğrusal seçeneğine tıklayın, 8 bit çözünürlüğü seçin ve ardından arama tablosu (LUT) için griler seçeneğini belirleyin.
      7. PSF oluşturucuyu çalıştırın ve TIFF formatında oluşturulan teorik PSF'yi kaydedin.
      8. Görüntü menüsünde bulunan Yığınlar seçeneğinin Z Projesi aracını açarak oluşturulan PSF dilimlerinin toplamını yapın.
      9. Görüntülenen ZProjection iletişim kutusunda, Projeksiyon türü için Dilimleri topla'yı seçin ve Tamam'ı tıklatın. Yeni PSF'yi TIFF formatında kaydedin.
         NOT: Teorik PSF yerine bilinen bir çapa sahip konfokal taramalı floresan mikroboncuklar ile deneysel olarak elde edilen bir PSF kullanılabilir.
      10. "DeconvolutionLab_2.jar"¹⁹ eklentisini indirin ve eklenti klasörüne yerleştirin.
      11. Menüyü tıklayın Eklentiler. Ardından, DeconvolutionLab2'ye tıklayın.
      12. Görüntü menüsünde bulunan Yığınlar seçeneğinden istiflenecek görüntüler aracını kullanarak eş odaklı görüntüleri Mito yığınından ayırın ve TIFF formatında kaydedin.
      13. DeconvolutionLab2 iletişim kutusunda, Mito yığınından elde edilen görüntülerden birini seçin. Oluşturulan teorik PSF'yi seçin ve 15 yinelemeli Richardson-Lucy algoritmasını seçin.
      14. DeconvolutionLab2'yi çalıştırın, görüntüdeki sinyal iyileştirmesini ve gürültü azaltmayı doğrulayın ve TIFF formatında kaydedin.
2. Görüntü analizi için 4.4 adımıyla devam edin.
3. Evrişimi kaldırılmış görüntülerin eşiklenmesi için, eşikleme işlemi sırasında bunları 8 bitlik bir maskeye dönüştürün. Görüntü menüsünün Yığınlar aracında Yığınlanacak Görüntüler'i seçerek ikili ve evrişimsiz görüntülerle bir yığın oluşturun.
4. Evrişimsiz görüntülerin FFT analizi için, çizim profili piksel birimlerinde mesafe içerir. Piksel birimlerini aşağıdaki gibi μm'ye dönüştürün:
   1. Elektronik tabloda, 5.4 adımını tamamladıktan sonra verileri B'den A'ya aktarın. Ardından, A'daki her piksel sayısını piksel boyutuyla çarparak B'yi μm cinsinden mesafeyle doldurun.

Tartışmalar

Mitokondri, yüksek tadilat kapasitesine sahip organellerdir. İçerikleri, yoğunlukları ve dağılımları, mitokondriyal dinamikler¹ olarak bilinen mitokondriyal füzyon ve fisyon mekanizmalarının aktivasyonu ve mitokondriyal devir mekanizmaları arasındaki denge yoluyla hızla değiştirilebilir: mitokondriyal biyogenez ve özel mitokondri bozunma yolu, mitofaji^21,22. Mitokondriyal içerik ve morfoloji, hücre tipine ve gelişim evresine göre değişebilir ve farklı fizyolojik ve patolojik uyaranlar altında yeniden şekillenebilir 17,22,23,24. Bu nedenle, mitokondriyal morfolojinin incelenmesi yarım yüzyıldan fazla bir süredir geçerlidir²⁵. Özellikle, mitokondrinin elektron mikroskobu ile analizi, birçok çalışmada uygulanan standart teknik olmuştur²⁶.

Konfokal mikroskopi ile yapılan floresan çalışmaları, farklı adaptif ve maladaptif koşullarda iskelet kasında mitokondrinin rolünün daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilecek, farklı lif derinliklerinde mitokondrinin canlı hücre görüntüleme kapasiteleri nedeniyle son birkaç yılda önem kazanmıştır²⁷. Bu çalışmada, canlı iskelet kası liflerinde mitokondri yoğunluğu ve dağılımının konfokal mikroskopi ile analizi için bir metodoloji açıklanmaktadır. Canlı iskelet kası lifleriyle çalışmanın temel zorluklarından biri, izolasyon süreçlerinden mitokondriyal konfokal kayda kadar kasılmayı önlemektir. Bu amaca ulaşmak için, lifleri en az 2 saat boyunca gevşek tutmak için yüksek bir Mg ve ATP Relax çözeltisi¹⁷ kullanılır, bu da lif izolasyon işlemini, florofor yükünü ve konfokal mikroskopi ile mitokondriyal sinyalin alınmasını gerçekleştirmek için yeterli zaman verir. Protokolün kritik bir noktası, yüksek hassasiyet ve taze doku gerektirdiğinden liflerin mekanik olarak elde edilmesidir; Bununla birlikte, daha önce kullanılan ve bildirilen bu teknikle sıçan kasından canlı lif demetleri elde etmek mümkündür²⁸. Bozulmamış liflerin elde edilmesi, hücre yapıları arasındaki metabolik ve fonksiyonel karışmayı koruyarak sarkolemmanın ve hücre içi ortamın korunmasına izin verir^28,29.

Dokular veya sabit hücrelerle çalışmanın aksine, canlı hücre görüntüleme floresan görüntülerinin konfokal mikroskopi ile elde edilmesi, çeşitli deneysel koşulların etkisinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Mevcut protokol, mitokondriyal yoğunluk ve dağılımdaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak araştırmak ve burada Yalın ve Ob türevi lifler arasında sunulan örnekler gibi deney grupları arasındaki farklılıkları keşfetmek için kullanılabilir (Şekil 3 ve Şekil 4). Canlı hücre görüntülemenin, küçük hücre hasarı ile optimal çalışma koşullarının standartlaştırılması anlamına geldiği her zaman göz önünde bulundurulmalıdır. Çalışma süresi, kullanılan çözeltilerin kalitesi, elde etme parametreleri ve lazerlerin maruziyeti hassas bir şekilde kontrol edilmelidir. Bu nedenle, temel hususlar aşağıda belirtilmiştir.

Kas liflerinin mitokondrileri, lifin boyutu ve uzun lazer maruziyetinin neden olabileceği lifin hasarı nedeniyle konfokal mikroskopi ile tamamen uzunlamasına kaydedilemez. Bununla birlikte, bu teknik altında lifin temsili bir örneği kaydedilir. Bir sıçanın iskelet kası lifinin tüm kalınlığını konfokal mikroskopi ile kaydetmek mümkün olsa da, bu daha uzun bir kayıt süresi ve lazer ışınına maruz kalma anlamına gelir. Kontrol fareleri söz konusu olduğunda, bu kayıtlarla ilgili sorunlarla karşılaşılmamıştır. Bununla birlikte, patolojik koşullardan gelen lifler, Ob sıçanlarından elde edilen liflerde gözlemlendiği gibi hasara daha duyarlı olabilir. Sonuç olarak, farklı Z mesafelerinde elde edilen bir temsili konfokal görüntü yığınının elde edilmesi tercih edilir. Lif kalınlığının yalnızca bir bölümü kaydedildiğinde, mitokondriyal dağılım ve yoğunluk lif içindeki konumuna göre değişebileceğinden, test edilen tüm liflerde istifin aynı derinlikte alınması önerilir. IMF'nin temsili konfokal görüntülerini elde etmek için sinyalin 15 μm'nin üzerinde bir derinlikte alınması önerilir ve çevreye yakın olan SSM popülasyonlarından kaçınılır.

Konfokal edinim sırasında bazı önemli hususlar dikkate alınmalıdır. İlk olarak, büyütme, yüksek NA ve daldırma ortamı dikkate alınarak daldırma objektif merceğinin seçimi. Hücreler hidrofilik bir inkübasyon ortamında tutulduğundan, iyi bir sinyal elde etmek ve dokuyu derinlemesine taramak için inkübasyon ve daldırma ortamının kırılma indisi benzer olmalıdır. Genellikle suya daldırma objektif lensi kullanılarak elde edilir. Şekil 3 ve Şekil 4'ün konfokal görüntüleri 20x, 0.7 NA suya daldırma objektifi ile elde edildi. Bu amaç, fiberin tüm derinliğinde kaydedilmesine izin verir, ancak IMF'nin temsili konfokal görüntüleri, yüksek floresan yoğunluğu sinyali ve küçük fiber hasarı ile elde edilebildiğinden, 15, 18 ve 21 μm'de taramaya karar verildi. 40x ve daldırma ortamı olarak yağ gibi diğer büyütmeler düşünülebilir, ancak değerlendirilmesi gerekir.

İkinci olarak, görüntüleme elde etmek için piksel boyutu, fazla örneklemeyi (daha yüksek lazer maruziyeti) ve yetersiz örneklemeyi (daha az çözünürlüğe yol açar) önleyen uygun bir piksel boyutunun seçilmesine izin veren Nyquist teoremine göre ^{hesaplanır30}. Hesaplama, seçilen objektif merceğin özelliklerine ve dalga boyuna (~90 nm) bağlıdır. Yakınlaştırma ile ayarlanabilir; Bu nedenle, yalnızca bir yakınlaştırma ayarı optimum piksel boyutu³⁰ sağlar. Bununla birlikte, pratikte, yakınlaştırma aynı zamanda analiz edilecek numunenin alanına da bağlıdır. Böylece dengeyi bulmak, Nyquist kriterine en yakın ve aynı zamanda analiz edilecek alana uyan bir piksel boyutuyla çalışmaya olanak tanır. Şekil 3 ve Şekil 4 , 150 ve 190 nm'lik bir piksel boyutuyla elde edildi, bu da fiberin ~50-80 μm olan tam genişliğinin analizine izin verdi.

Üçüncüsü, odak dışı ışığın dedektöre ulaşmasını önleyen uygun bir iğne deliği çapı kullanılmalıdır. Tipik olarak, 1 Airy,^{odak düzlemi 30'dan} kaynaklanan fotonların ~%80'inin algılanmasına izin verdiği için en uygun iğne deliği boyutu olarak kabul edilir. Bununla birlikte, düşük floresan seviyeleri gösteren bazı lekeli biyolojik numuneler, iğne deliği artışı^{gerektirir 30}. Şekil 3 ve Şekil 4'ün konfokal görüntüleri, daha düşük bir Airy ile yakalanan düşük sinyal nedeniyle 3 Airy iğne deliği boyutunda elde edildi. İğne deliği boyutunun arttırılmasından kaynaklanan sinyal yoğunluğundaki artışın, odak dışı yakalanan ışığın artması nedeniyle çözünürlüğün azalmasına yol açtığını dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, mümkün olduğunca 1 havadara yakın bir iğne deliği boyutu kullanmanızı öneririz.

Yeterince elde edildiğinde, mitokondriyal yoğunluk ve dağılım hakkında nicel bilgi elde etmek için konfokal görüntüler işlenebilir. Ne olursa olsun, sinyalin nicelleştirilmesini iyileştirmek için eşiklemenin kritik işleme görüntüsü adımının analizden önce gerçekleştirilmesi gerekir. Bu önemli adım sırasında, mitokondri için pozitif pikselleri arka plandakilerden ayıran floresan yoğunluk değeri tanımlanır. Eşik, görüntünün histogramı biri arka plana, diğeri mitokondriye karşılık gelen iki tepe noktası gösterdiğinde, mitokondriyi temsil eden zirvenin Gauss uyumu ile tanımlanabilir. Bununla birlikte, görüntülerin her birinde her zaman iki modlu bir dağılım elde edilemez, bu nedenle diğer eşikleme yöntemlerinin uygulanması gerekir.

Bu protokolde, iki tepe noktası ayrılmadığında veya diğer tepe noktaları mevcut olduğunda eşik değerini bulmak için tasarlanmış parametrik olmayan ve denetimsiz bir yöntem olan Otsu'nun eşik uygulamasının uygulanması açıklanmaktadır³¹. Otsu, biyolojik-görüntü analizi için açık kaynaklı bir platform kullanılarak kolayca uygulanabilir; Bununla birlikte, diğer eşikleme yöntemleri test edilebilir. Tüm konfokal görüntülere aynı eşikleme yöntemi uygulanmalı ve her bir konfokal görüntü için bağımsız olarak hesaplanmalıdır. Eşiğin tüm yığına uygulanması yanlış sonuçlara yol açar. Eşikleme işleminden sonra ikili görüntüler elde edildikten sonra, mitokondriyal yoğunluk ve FFT analizi, bu protokolde açıklanan talimatlar izlenerek kolayca gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, niceleme hatalarına yol açacağından, çekirdekleri ve kılcal damarları dahil etmekten kaçınmak için her iki analizi de yaparken dikkatli olunmalıdır. Yoğunluk ile ilgili olarak, analiz edilecek piksellerden veya toplam alandan pikselleri veya çekirdeklerin veya kılcal damarların kapladığı alanı çıkarmak yeterlidir. Ek olarak, FFT analizi yapılırken, mitokondri sinyalinin düz olduğu doğrulanmalıdır. Tersine, mitokondri sinyali eğildiğinde, mitokondriyal uzunlamasına dağılımı temsil etmeyen profiller üretebilir ve yanlış FFT spektrum verileri verebilir. Ek olarak, görüntülerdeki gürültüyü azaltmak için bir ön işleme adımı uygulanabilir. Bu protokol, bir medyan filtre ve 2B evrişim çözme kullanan iki isteğe bağlı ön işleme adımını açıklar. Bu ön işleme yöntemlerinin görüntü ve mitokondriyal yoğunluk içeriği üzerindeki etkileri Ek Şekil S1'de sunulmuştur. Bu ön işlemlerin görüntü kalitesini iyileştirebilse de, belirli görüntü ayrıntılarının kaybolmasına da neden olabileceğini dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, dikkatli kullanılmalı ve analiz edilen tüm görüntülere tutarlı bir şekilde uygulanmalıdır.

Avantajlarına rağmen, konfokal mikroskopi, edinim için en uygun koşullar uygulandığında 180-250 nm'lik bir yanal çözünürlük (XY) ile sınırlıdır³². Mitokondriyal çap ~ 200-700 nm'dir, konfokal mikroskobun kırınım sınırına yakındır; bu nedenle, alt mitokondriyal yapılar yeterince tespit edilemez³³ ve bu protokolde gösterilen yoğunluk ve FFT analizleri ile değerlendirilemez. Stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM), uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) nanoskopisi veya yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) gibi diğer süper çözünürlüklü mikroskopi teknikleri, alt mitokondriyal yapıları çözmek için araştırılabilir³². Bu protokolde, mitokondriyal membran potansiyeline bağlı olan florofor TMRE kullanılarak mitokondrinin konfokal görüntüleri elde edilir. Bu nedenle, mitokondriyal floresan yoğunluğu, membran potansiyellerine göre değişebilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için veri analizinden önce bir eşikleme işlemi gerçekleştirilir. Tanımlanmış bir eşiğin üzerindeki tüm pikseller, floresan değerlerinden bağımsız olarak mitokondriyal sinyal için pozitif olarak kabul edilir. Bununla birlikte, çok düşük zar potansiyeline sahip mitokondrinin bu teknikle çözülemeyeceğine dikkat edilmelidir. Bu nedenle, mitokondriyal protein içeriği miktarının tamamlayıcı çalışmaları önerilmektedir. TMRE kullanmanın bir avantajı, konfokal görüntülerin mitokondriyal membran potansiyel analizi için de kullanılabilmesidir, ancak karbonilsiyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon (FCCP) gibi ayırma ajanları ile yeterli kontrollerin yapılması gerekir. Ek olarak, mitokondriyal yoğunluk ve dağılım analizi talimatları, membran potansiyellerinden bağımsız olarak mitokondriyi yükleyen mitokondri için yeşil floresan göstergeler kullanılarak elde edilebilir, ancak inkübasyon stratejisi ve konfokal edinim ayarlarının standartlaştırılması gerekir.

Mitokondri yapısının temel mitokondriyal ve hücresel fonksiyonlarla ilişkili olduğu göz önüne alındığında, burada açıklanan protokol, hastalık sırasında veya belirli bir stres hakaretiyle yeniden şekillenmeleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Enerji üretimi gibi mitokondri tarafından yönetilen iskelet kasının temel işlevlerinin daha iyi anlaşılmasına veya mitokondrinin kasılma-metabolizma eşleşmesi gibi diğer organellerle etkileşimde önemli bir rol oynamasına katkıda bulunabilir. Protokol talimatlarını takip etmek, canlı iskelet kasında mitokondriyal yoğunluğun ve dağılımın tahmin edilmesini sağlar. Protokol adımları, iskelet kası demeti diseksiyonu, konfokal mikroskopi taraması ve görüntü analizine odaklanan, ayrıntılı talimatların ve önemli hususların dahil edildiği üç ana aşamaya ayrılmıştır. Özellikle, protokol, kullanıcının gereksinimlerine göre fiber içinde tam mitokondriyal rekonstrüksiyon için ek Z adımlarını keşfetmek üzere daha da optimize edilebilir. Örneğin, konfokal görüntü ve analiz adımları, canlı ve sabit numunelerde TT gibi benzer dağılıma sahip hücresel yapıları incelemek için test edilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A6419
Borosilicate glass coverslip	Warner Instruments	64-0709
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670
Confocal microscope	Leica	TCS SP5
Confocal microscope software Leica Application Suite	Leica	2.7.3.9723
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	C3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)	Biomedical Imaging Group, EPFL	http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate	Sigma-Aldrich	11240
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E4378
Forceps	Miltex	MH-18
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective	Leica	506517
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Iris scissors	Miltex	5-304
L-(-)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M7397
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G1626
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
Maxchelator	UC Davis Health	https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm
Micro scissors	Miltex	18-1633
Open-source platform for biological-image analysis Fiji	Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji	https://fiji.sc/
Phosphocreatine disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	P7936
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
PSF Generator (PSF_Generator.jar)	Biomedical Imaging Group, EPFL	http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/
Recording chamber	Warner Instruments	RC-27N
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spreadsheet Microsoft Excel	Microsoft
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 508
Tetramethylrhodamine, ethyl ester	Invitrogen	T669