Analyse der mitochondrialen Dichte und Längsverteilung in lebenden Skelettmuskelfasern von Ratten mittels konfokaler Mikroskopie

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Analyse von Veränderungen der mitochondrialen Dichte und der longitudinalen Verteilung mittels Live-Skelettmuskel-Bildgebung unter Verwendung konfokaler Mikroskopie für das mitochondriale Netzwerkscanning vor.

Zusammenfassung

Das Mitochondrium ist ein Organell, das je nach den Stoffwechselanforderungen der Zellen verlängert, fragmentiert und erneuert werden kann. Der Umbau des mitochondrialen Netzwerks ermöglicht es gesunden Mitochondrien, den zellulären Bedarf zu decken. Der Verlust dieser Fähigkeit wurde jedoch mit der Entwicklung oder dem Fortschreiten verschiedener Pathologien in Verbindung gebracht. In der Skelettmuskulatur werden Veränderungen der mitochondrialen Dichte und -Verteilung unter physiologischen und pathologischen Bedingungen wie Bewegung, Alterung und Fettleibigkeit beobachtet. Daher kann die Untersuchung des mitochondrialen Netzwerks zu einem besseren Verständnis der Mechanismen im Zusammenhang mit diesen Erkrankungen beitragen.

Hier wird ein Protokoll für die Mitochondrien-Bildgebung von lebenden Skelettmuskelfasern von Ratten beschrieben. Die Fasern werden manuell in einer entspannenden Lösung präpariert und mit einem fluoreszierenden Live-Cell-Imaging-Indikator für Mitochondrien (Tetramethylrhodaminethylester, TMRE) inkubiert. Das Mitochondriensignal wird durch konfokale Mikroskopie im XYZ-Scan-Modus aufgezeichnet, um konfokale Bilder des intermyofibrillären mitochondrialen Netzwerks (IMF) zu erhalten. Danach werden die konfokalen Bilder durch Schwellwertbildung und Binarisierung verarbeitet. Das binarisierte konfokale Bild berücksichtigt die positiven Pixel für die Mitochondrien, die dann gezählt werden, um die mitochondriale Dichte zu erhalten. Das mitochondriale Netzwerk im Skelettmuskel zeichnet sich durch eine hohe Dichte an IMF-Population aus, die eine periodische Längsverteilung ähnlich der von T-Tubuli (TT) aufweist. Die Fast-Fourier-Transformation (FFT) ist eine Standardanalysetechnik, die durchgeführt wird, um die Verteilung von TT zu bewerten, die es ermöglicht, die Verteilungshäufigkeit und das Niveau ihrer Organisation zu bestimmen. In diesem Protokoll wird die Implementierung des FFT-Algorithmus zur Analyse der longitudinalen mitochondrialen Verteilung in der Skelettmuskulatur beschrieben.

Einleitung

Mitochondrien bilden hochdynamische Netzwerke, die hauptsächlich durch das Gleichgewicht zwischen ihrer Dehnung (Fusion) und Fragmentierung (Spaltung)1,2 reguliert werden^, die durch die Expression und Aktivität von Proteinen wie Mitofusin 1 und ² (Mfn1 und Mfn2) und der optischen Proteinatrophie ¹ (Opa1) moduliert werden, die die Verschmelzung der äußeren Mitochondrienmembran und der inneren Membran regulieren. bzw. ^1,2. Das Dynamin-verwandte Protein (Drp1) reguliert hauptsächlich die mitochondriale Spaltung, wenn es im Ser616³ phosphoryliert wird.

In der Skelettmuskulatur ist bekannt, dass das mitochondriale Netzwerk aufgrund ihrer Nähe zu verschiedenen Zellregionen (Myofibrillen, Sarkolemma und Zellkerne) in strukturell gut definierten Subpopulationen angeordnet ^ist4,5. Die Mitochondrien, die sich direkt unter dem Sarkolemma befinden, werden als subsarkolemmale Mitochondrien (SSM) bezeichnet, diejenigen, die sich zwischen den kontraktilen Filamenten befinden, als intermyofibrilläre Mitochondrien (IMF) und die mitochondriale Subpopulation um die Kerne herum als perinukleäres Mitochondriennetzwerk (PMN). Darüber hinaus wurde vermutet, dass diese mitochondrialen Subpopulationen regionenspezifische Funktionen haben und metabolisch spezialisiert sind ^4,5.

Die Aufrechterhaltung der zellulären Energiehomöostase, die eine metabolische und kontraktile Funktion ermöglicht, hängt in hohem Maße von der Interaktion und Kommunikation an bestimmten Stellen über das mitochondriale Netzwerk ab (z. B. IMF- und SSM-Interaktion)^4,6. Zusätzlich zu den Netzwerkinteraktionen der Mitochondrien können die Mitochondrien auch mit anderen Organellen interagieren und strukturelle und funktionelle Komplexe bilden. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass IMF neben dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) und in der Nähe der Ca²⁺ Freisetzungseinheiten (CRU) lokalisiert werden kann, die von den transversalen Tubuli (TT) gebildet ^werden7. Diese Tatsache ist aufgrund der Rolle der mitochondrialen Ca2⁺-Aufnahme bei der Regulierung der ATP-Synthese und Apoptose relevant. Kürzlich wurde auch eine mögliche Rolle bei der Regulierung zytosolischer^Ca2+-Transienten vorgeschlagen⁸.

TT sind Einstülpungen des Sarkolemmas mit einer periodischen Verteilung entlang der Längsachse von Kardiomyozyten und Skelettmuskelfasern ^9,10, ähnlich der IMF-Verteilung 5. Veränderungen in der Verteilung von TT haben wichtige physiologische Implikationen, da sie eine Rolle bei der kontraktilen Funktion spielen. Diese Veränderungen wurden jedoch hauptsächlich in Kardiomyozyten untersucht. Die Verwendung der Fast-Fourier-Transformation (FFT) ermöglicht die Umwandlung periodischer Signale aus dem Entfernungsbereich in den Frequenzbereich, was zu einem FFT-Spektrum führt, das die Frequenz und die Regelmäßigkeit des Signals^{angibt 11,12,13}. Obwohl es Hinweise darauf gibt, dass die Organisation des mitochondrialen Netzwerks in Skelettmuskelfasern für die Anpassung an verschiedene Stoffwechselbedingungen, wie z.B. bei der Regeneration nach Muskelverletzungen, essentiell ist^14,15, werden die meisten Analysen qualitativ durchgeführt.

Angesichts der Tatsache, dass die mitochondriale Dysfunktion mit mehreren skelettmuskelbezogenen (z. B. Nichtgebrauchsatrophie)² und nicht-muskulären Erkrankungen, insbesondere Stoffwechselerkrankungen, und dem damit verbundenen Verlust von Muskelmasse (d. h. Atrophie)¹⁶ in Verbindung gebracht wurde, ist die quantitative Bewertung des mitochondrialen Netzwerks und der Verteilung in der Skelettmuskulatur von Bedeutung. In jüngster Zeit wurde ein signifikanter Unterschied in der longitudinalen Verteilung der Mitochondrien der Gastrocnemius-Muskelfasern zwischen einer adipösen Gruppe (Ob; Zucker fa/fa Ratten) und eine schlanke Gruppe (Lean; Zucker +/+ Ratten) wurde durch FFT¹⁷ identifiziert. Diese Studie zeigte die Nützlichkeit der FFT bei der Analyse der mitochondrialen Verteilung. Daher stellt dieses Protokoll eine Methodik zur Untersuchung von Mitochondrien in lebenden Skelettmuskelfasern anhand von Bildern dar, die durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie gewonnen wurden. Die mitochondriale Dichte wird durch Hintergrundschwellen quantifiziert, und die Analyse der longitudinalen mitochondrialen Verteilung mittels FFT-Analyse wird ebenfalls beschrieben. Ein Workflow-Schema ist in Abbildung 1 dargestellt.

Protokoll

Alle Tierversuchsverfahren wurden vom Animal Use and Care Committee (CICUAL) des Tecnologico de Monterrey (Protokoll 2019-007) bewertet und genehmigt. Für diese Studie wurden männliche Zucker (+/+ und fa/fa) Ratten im Alter von 12 bis 13 Wochen verwendet. Die Tiere wurden unter normalen Haltungsbedingungen gehalten (12 h/12 h Hell-Dunkel-Zyklus, 40-60% Luftfeuchtigkeit) und hatten Zugang zu Futter (Standard-Rattenfutter) und Wasser ad libitum.

1. Zusammensetzung der Lösung

1. Bereiten Sie eine frische Relax-Lösung vor, indem Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit Natriumhydroxid (NaOH) auf 7,3 ein.
2. Berechnen Sie die Konzentration des freien Kalziums in der Relax-Lösung mit einem Simulationsprogramm zur Bestimmung der Konzentration des freien Metalls.
3. Bereiten Sie einen 5 mM Tetramethylrhodaminmethylester (TMRE)-Stamm in Dimethylsulfoxid (DMSO) und eine anschließende Verdünnung von 0,1 mM in DMSO vor.

2. Dissektion der Gastrocnemius-Muskelfaserbündel

1. Legen Sie das Tier in die Induktionskammer und schließen Sie den Deckel. Schalten Sie die Sauerstoffquelle ein, stellen Sie die Gasdurchflussrate auf 0,5 l/min ein und stellen Sie den Verdampfer auf 4% Sevofluran ein, um eine Anästhesie einzuleiten.
2. Sobald die Ratte schläft, legen Sie sie außerhalb der Kammer in Rückenlage unter Beibehaltung der Narkose. Kneifen Sie den Zeh oder den Schwanz zusammen, um das Fehlen von Reflexen zu überprüfen.
3. Schneide mit einer Schere durch die Haut und die Muskeln des Bauches. Durchtrennen Sie dann den Brustkorb, um Zugang zum Herzen zu erhalten.
4. Um eine Kardiektomie durchzuführen, fassen Sie das Herz aus den obersten Venen und Arterien mit einer Zange und schneiden Sie die Blutgefäße mit einer Schere durch. Entferne das Herz.
5. Unmittelbar nach der Euthanasie desinfizieren Sie die Hintergliedmaße mit Ethanol und rasieren Sie sie mit einer Rasiermaschine.
6. Halten Sie den Rückfuß fest und machen Sie mit einer Schere einen Schnitt durch die Haut auf Höhe der Achillessehne.
7. Schneiden Sie die Hintergliedmaße mit einer Schere auf Höhe des proximalen Schienbeins ab. Füllen Sie es in eine 60-mm-Petrischale mit 3 ml eiskalter Relax-Lösung in Rückenposition. Bedecken Sie es mit ausreichend Lösung, um ein Austrocknen der Muskeln zu verhindern.
8. Identifizieren Sie die Achillessehne, heben Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette an und trennen Sie die Muskeln mit einer Irisschere vom Knochen weg. Verwenden Sie ab diesem Schritt nach der Präparation ein Stereomikroskop.
9. Identifizieren und trennen Sie den gesamten Gastrocnemius-Muskel, die Hauptmasse an der Rückseite der Hintergliedmaße.
10. Das Binde- und Fettgewebe, das den Muskel umgibt, mit einer Pinzette mit feiner Spitze sezieren und verwerfen. Übertragen Sie den seitlichen Muskelkopf in eine neue Petrischale mit eiskalter Relax-Lösung (siehe Abbildung 2A).
11. Halten Sie den Muskel vorsichtig mit einer Pinzette an einem Ende fest und trennen Sie ihn vorsichtig mit einer Mikroschere in Bündel. Manipulieren Sie Bündel immer, indem Sie sie vorsichtig an einem Ende mit einer Pinzette festhalten.
    HINWEIS: Die Bündel sind ca. 10 mm lang und 2 mm breit.
12. Überführen Sie die Ballaststoffbündel in eine neue Petrischale mit 2 ml eiskalter Relax-Lösung. Wählen Sie nur diejenigen aus, die ein glattes Erscheinungsbild haben, von einem Ende zum anderen vollständig sind und nicht gekürzt sind (Abbildung 2B).

3. Live-Cell-Imaging-Aufnahme von Mitochondrien im Skelettmuskel mittels konfokaler Mikroskopie

1. Inkubieren Sie die Fasern in 2,5 × 10-4 mM TMRE in ^{Relax-Lösung} für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Bei den empfohlenen Arbeitskonzentrationen von TMRE wird erwartet, dass es sich in einem Nicht-Abschreckmodus befindet. Ab diesem Zeitpunkt vor Lichteinwirkung schützen.
2. Während der Inkubationszeit:
   1. Öffnen Sie die Standardsoftware für konfokale Mikroskope, wählen Sie das Konfigurationsframework aus, wählen Sie im Hardwarekonfigurationsdialogfeld Laser aus und aktivieren Sie die Option HeNe 543 .
   2. Wählen Sie im Erfassungsframework das Dialogfeld "Erfassung" aus, und wählen Sie im Erfassungsmodus den Bereich "XYZ" aus.
   3. Wählen Sie im Dialogfeld "XY" das Format 512 x 512, die Geschwindigkeit von 400 Hz und das Kontrollkästchen " Lochblende" aus. Wählen Sie im angezeigten Dialogfeld "Lochblende" AU als Einheit aus, und fügen Sie den Wert 3 Airy für die Lochblende hinzu.
      HINWEIS: Erwägen Sie, die Lochblende zu reduzieren, die dem optimalen Kriterium von 1 Airy am nächsten kommt, wenn ein ausreichendes Fluoreszenzsignal erhalten bleibt.
   4. Wählen Sie im Dialogfeld " Strahlwegeinstellungen " ein Wasserimmersionsobjektiv von 20x und eine numerische Apertur (NA) von 0,7 (20x/0,7 IMM) aus, und wählen Sie das Emissionswellenlängenfenster von 576-700 nm. Wählen Sie DD488/543 und 15 % der Laserleistung für den 543-Laser.
      HINWEIS: Ein Wasserimmersionsobjektiv für das Scannen von Live-Bildern wird dringend empfohlen (falls verfügbar). Da wird ein ähnlicher Brechungsindex des Immersionsmediums und des Inkubationsmediums erreicht.
3. Nach 20 Minuten Inkubation wird das Inkubationsmedium zweimal ausgetauscht. Stellen Sie sicher, dass die konfokalen Bilder innerhalb von 20-30 Minuten nach der Inkubation aufgenommen werden.
4. Bereiten Sie die Aufnahmekammer mit einem 0,15 mm dicken Deckglas aus Borosilikatglas vor.
   HINWEIS: Wählen Sie die Dicke des Deckglases entsprechend der verfügbaren Aufzeichnungskammer aus, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Dicke normalerweise zwischen 0,15 und 0,22 mm liegt, um eine optimale Leistung zu erzielen.
5. Geben Sie 200 μl Relax-Lösung in die Aufzeichnungskammer und übertragen Sie die Faserbündel.
6. Verwenden Sie im konfokalen Mikroskop den Hellfeldmodus, um lebensfähige Fasern für die Fluoreszenzaufzeichnung von Mitochondrien zu identifizieren. Lebensfähige Fasern sind vollständig, nicht kontrahiert und weisen ein intaktes Streifenmuster auf.
7. Trennen Sie die Faserbündel voneinander und richten Sie sie mit einer Pinzette aus. Wählen Sie diejenigen aus, die dem Deckglas am nächsten sind.
8. Scannen Sie die Fluoreszenz mit der Live-Taste , um die Verstärkung und den Offset in der Systemsteuerung unter Berücksichtigung der folgenden Punkte anzupassen:
   1. Wählen Sie niedrige Fluoreszenzintensitätswerte für einen Hintergrund von fast 0 Arbitrary Units (A.E.).
   2. Wählen Sie einen Verstärkungspegel zwischen 100 und 200 AE. um eine Sättigung des Aufzeichnungssystems zu vermeiden. Zeichnen Sie daher nicht die höchsten Fluoreszenzwerte auf.
   3. Wählen Sie eine Pixelgröße von 150 bis 190 nm aus, um die volle Breite der Faser zu erfassen, und passen Sie den Zoomfaktor im Dialogfeld XY an.
      HINWEIS: Erwägen Sie, die Pixelgröße näher an den Nyquist-Kriterien (90 nm) zu verwenden, was das Scannen der gesamten Breite der Faser ermöglicht.
9. Passen Sie im Dialogfeld Z-Stapel den Z-Abstand an, um das Fluoreszenzsignal ab einer Fasertiefe von 15 μm (Start-Taste) bis 22 μm (End-Taste) zu erfassen. Wählen Sie 3 μm als Z-Schrittweite.
10. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die konfokalen Bilder aufzunehmen. Erhalten Sie einen Z-Stapel, der aus drei konfokalen Bildern besteht, die in einer Tiefe von 15, 18 und 21 μm aufgenommen wurden.

4. Analyse der Mitochondriendichte

1. Öffnen Sie in der Open-Source-Plattform für die biologische Bildanalyse¹⁸ die Z-Stapel-Datei, und drehen Sie die Bilder, um die Faser horizontal zu platzieren, wie in 3B gezeigt.
2. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip eine rechteckige Region of Interest (ROI) aus, die die von den Mitochondrien eingenommene Fläche (ROI_mito) umfasst. Wählen Sie _{ROI-Mito-Größen} von 65 bis 90 μm für X. Bei Y hängt die Größe von der Breite der Faser ab, wobei die Peripherie vermieden wird.
3. Duplizieren Sie den Z-Stack mit dem ausgewählten _ROI-Mito und speichern Sie ihn als neuen Z-Stack (Mito-Stack) im TIFF-Format. Speichern Sie die _{ROI-Mito-Position,} die auf dem ursprünglichen Stack ausgewählt wurde, mit dem ROI-Manager-Tool.
4. Berechnen Sie den Schwellenwert für die Hintergrundsubtraktion wie folgt:
   1. Verwenden Sie die Tastenkombination Befehl+Umschalt+t , um das Dialogfeld Schwellenwert zu öffnen.
   2. Wählen Sie den Schwellwertalgorithmus Otsu |S/W | Option für dunklen Hintergrund . Beachten Sie, dass das Bild jetzt binarisiert ist.
   3. Beobachten Sie im Dialogfeld Schwellenwert das Histogramm der Fluoreszenzintensitätsverteilung und den angezeigten Schwellenwert .
      HINWEIS: Mitochondrien-positive Pixel haben Fluoreszenzintensitätswerte, die größer als der Schwellenwert sind, und erscheinen als weiße Pixel im Binärbild.
   4. Wenden Sie den Schwellenwert auf den Binärbildstapel an, indem Sie Anwenden auswählen. Wählen Sie im angezeigten Dialogfeld Stapel in Binär konvertieren die Optionen Schwellenwert für jedes Bild berechnen, Schwarzer Hintergrund, Neuen Stapel erstellen und klicken Sie auf OK.
5. Beachten Sie, dass ein Stack mit den drei Binärbildern erzeugt wird (BinDMito-stack). Speichern Sie es im TIFF-Format.
6. Berechnen Sie die Mitochondriendichte im BinDMito-Stack wie folgt:
   1. Wählen Sie das Menü Analysieren aus. Klicken Sie anschließend auf Histogramm. Klicken Sie im angezeigten Dialogfeld Histogramm auf Ja , um alle Bilder des Stapels in die Analyse einzubeziehen.
   2. Klicken Sie im Dialogfeld Histogramm des Stapels auf Liste , um die Histogrammdaten abzurufen. Übertragen Sie die Histogrammdaten in eine Tabelle.
   3. Identifizieren Sie in einer Tabelle die Mito-Pixel mit dem Wert 255 . Berechnen Sie die Mitochondriendichte mit Gleichung (1):
      Mitochondriale Dichte = × 100 (1)
      Die Gesamtzahl der Pixel wird im Dialogfeld Histogramm als N identifiziert oder berechnet, indem die Pixelanzahl des Histogramms in der Tabelle addiert wird.
   4. Um die von Mitochondrien eingenommene Fläche (μm²) zu berechnen, multiplizieren Sie die Mito-Pixel des BinDMito-Stacks mit der Pixelgröße.

5. Analyse der mitochondrialen Verteilung mittels Fast-Fourier-Transformation

1. Öffnen Sie in der Open-Source-Plattform für biologische Bildanalyse den BinDMito-Stack und zeichnen Sie einen rechteckigen ROI von 256 Pixeln Breite und 5 μm Höhe. Lokalisieren Sie einen ROI in einer zentralen Position und einen anderen in einer seitlichen Position, wie in Abbildung 4A,B gezeigt.
2. Verwenden Sie das ROI-Manager-Tool , um die ROIs für die FFT-Analyse zu konfigurieren und zu speichern.
   HINWEIS: Je nach den Erfordernissen der Analyse können andere ROIs in verschiedenen Positionen ausgewählt und ihre Größe geändert werden. Dennoch muss die Breite 2ⁿ Pixel betragen, um FFT durchzuführen (z. B. 128, 256, 512 Pixel).
3. Rufen Sie das Plotprofil der ROIs mit der Tastenkombination + k ab und übertragen Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation.
4. Füllen Sie in der Tabelle die Spalten B und C mit den Daten aus, die Sie aus dem Zeichnungsprofil erhalten haben. Die B-Spalte enthält den Abstand in μm und die C-Spalte den entsprechenden Grauwert der Fluoreszenzintensität (A.E.).
5. Die Spalte D entspricht der FFT-Frequenz (Ereignis/μm), die wie folgt gefüllt wird:
   1. Berechnen Sie die Abtastfrequenz (Fs): Fs = 1/Δ d, wobei Δ d der Distanzschritt (der zweite Wert von B) ist.
   2. Berechnen Sie die Δ Fs: Δ Fs= Fs/N, wobei N die Anzahl der Datenpunkte von B (256) ist.
   3. Berechnen Sie den Stoppwert der FFT-Frequenz (S): S = (N/2) ×ΔFs.
   4. Füllen Sie die Spalte D wie folgt aus:
      1. Der erste Wert der Spalte D ist gleich 0.
      2. Wählen Sie die zweite Zelle in der Spalte D aus, wechseln Sie zum Startmenü, wählen Sie Füllung aus, und klicken Sie auf Reihe. Wählen Sie Spalten aus. Verwenden Sie für den Schrittwert das berechnete Δ Fs. Verwenden Sie für den Stoppwert das berechnete S.
   5. Füllen Sie als Nächstes die Spalte E mit den komplexen FFT-Werten wie folgt:
      1. Fügen Sie 0 in die erste Zelle der Spalte C ein, da der Abstand 0 für die Berechnung der FFT mit einem Signal 0 zusammenfallen muss.
      2. Wechseln Sie dann zum Menü Daten , klicken Sie auf Datenanalyse, und wählen Sie Fourier-Analyse aus.
      3. Wählen Sie im neuen Fenster den Datenpunktbereich des Fluoreszenzsignals aus, der in Spalte C für den Eingangsbereich beschrieben ist.
         HINWEIS: Die Anzahl der Datenpunkte muss 2ⁿ betragen (z. B. 256 oder 128 Datenpunkte des Fluoreszenzsignals).
      4. Wählen Sie den entsprechenden Bereich des E für den Ausgabebereich aus.
      5. Wählen Sie OK und lassen Sie die komplexen FFT-Werte automatisch ausfüllen.
6. Füllen Sie die Spalte F wie folgt mit der FFT-Magnitude:
   1. Verwenden Sie die IMABS-Funktion , um den absoluten Wert in F aus der komplexen Zahl in E zurückzugeben, und multiplizieren Sie ihn mit 2/N , um ihn zu normalisieren (Gleichung (2)):
      FFT-Magnitude = (IM.ABS (E₁... E_n) × (2/N) (2)
7. Zeichnen Sie das FFT-Spektrum mit der FFT-Größe in F als Funktion der FFT-Frequenz in D bis S auf. Ermitteln Sie den Punkt des maximalen Peaks und die entsprechende FFT-Frequenz.
8. Rechne die FFT-Frequenz des maximalen Peaks mit Gleichung (3) in die Distanz um. Diese berechnete Distanz stellt die longitudinale Distanz der mitochondrialen Verteilung dar.
   Abstand (μm) = 1/FFT-Frequenz (3)
   HINWEIS: Aufgrund der FFT-Symmetrie sollte die FFT-Frequenz nicht über den S-Wert hinaus aufgetragen werden, der der Hälfte der Datenpunkte entspricht, um eine Duplizierung des FFT-Spektrums zu vermeiden.

6. Optionale Vorverarbeitungsschritte zur Reduzierung des Bildrauschens vor der Bildanalyse

1. Wenden Sie einen Medianfilter oder eine 2D-Dekonvolution wie folgt an:
   1. Für den Medianfilter:
      1. Wählen Sie Prozess | Filtern Sie und klicken Sie auf die Option Median .
      2. Wählen Sie im angezeigten Dialogfeld Median die Option 2,0 für Radius aus, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie Ja, um den Prozess auf alle Bilder im Mito-Stack anzuwenden.
      3. Achten Sie auf die Reduzierung des Rauschens in den Bildern.
   2. Für die 2D-Dekonvolution:
      1. Generieren Sie eine theoretische Punkt-Spread-Funktion (PSF).
      2. Laden Sie die Plugin-PSF_Generator.jar herunter und legen Sie die Datei im Ordner "Plugins" ab.
      3. Klicken Sie im Dialogfeld " PSF-Generator " auf die Option Optisches 3D-Modell von Born & Wolf, geben Sie den Brechungsindex-Immersionswert von 1,33 ein, der während des konfokalen Scannens verwendet wird, und wählen Sie " Beste " für die Option "Genauigkeitsberechnung" aus.
      4. Erfassen Sie 576 nm für die Emissionswellenlänge, die NA der verwendeten Objektivlinse von 0,7 und den Z-Schritt von 3.000 nm.
      5. Erfassen Sie die Pixelgröße XY des zu dekonvoluzierenden konfokalen Bildes sowie die Größe XYZ , die die Anzahl der Pixel von X und Y und die Anzahl der Z-Schritte angibt (3 für dieses Protokoll).
      6. Klicken Sie im Menü "Anzeige" des PSF-Generators auf die Option "linear", wählen Sie "8 Bit" und dann die Option "Grau" für die Nachschlagetabelle (LUT).
      7. Führen Sie den PSF-Generator aus und speichern Sie die theoretische PSF, die im TIFF-Format erstellt wurde.
      8. Erstellen Sie eine Summe der Slices der PSF, die durch Öffnen des Z-Projekt-Werkzeugs der Option Stapel im Menü Bild erstellt wurden.
      9. Wählen Sie im angezeigten Dialogfeld ZProjection die Option Summensegmente für den Projektionstyp aus, und klicken Sie auf OK. Speichern Sie die neue PSF-Datei im TIFF-Format.
         ANMERKUNG: Anstelle der theoretischen PSF kann ein PSF verwendet werden, der experimentell durch konfokales Scanning fluoreszierende Mikrokügelchen mit bekanntem Durchmesser erhalten wurde.
      10. Laden Sie das Plugin "DeconvolutionLab_2.jar^"19 herunter und legen Sie es in den Plugin-Ordner.
      11. Klicken Sie auf das Menü Plugins. Klicken Sie anschließend auf DeconvolutionLab2.
      12. Trennen Sie die konfokalen Bilder vom Mito-Stapel mit dem Werkzeug Zu stapelnde Bilder aus der Option Stapel im Menü Bild und speichern Sie sie im TIFF-Format.
      13. Wählen Sie im Dialogfeld DeconvolutionLab2 eines der Bilder aus, die Sie aus dem Mito-Stack erhalten haben. Wählen Sie die erstellte theoretische PSF aus, und wählen Sie den Richardson-Lucy-Algorithmus mit 15 Iterationen aus.
      14. Führen Sie DeconvolutionLab2 aus, überprüfen Sie die Signalverbesserung und Rauschunterdrückung im Bild und speichern Sie es im TIFF-Format.
2. Fahren Sie mit Schritt 4.4 für die Bildanalyse fort.
3. Für die Schwellenwerte der dekonvolusierten Bilder konvertieren Sie diese während des Schwellwertvorgangs in eine 8-Bit-Maske. Erstellen Sie einen Stapel mit den binären und dekonvolutierten Bildern, indem Sie im Menü "Bild" im Werkzeug "Stapel" die Option "Zu stapelnde Bilder" auswählen.
4. Für die FFT-Analyse von dekonvolusierten Bildern enthält das Plotprofil den Abstand in Pixeleinheiten. Transformieren Sie die Pixeleinheiten wie folgt in μm :
   1. Übertragen Sie in der Tabelle nach Abschluss von Schritt 5.4 die Daten von B nach A. Füllen Sie als Nächstes B mit dem Abstand in μm , indem Sie jede Pixelzahl von A mit der Pixelgröße multiplizieren.

Diskussion

Mitochondrien sind Organellen mit einer hohen Umbaukapazität. Ihr Inhalt, ihre Dichte und ihre Verteilung können durch die Aktivierung der mitochondrialen Fusions- und Spaltungsmechanismen, bekannt als mitochondriale Dynamik¹, und das Gleichgewicht zwischen den mitochondrialen Umsatzmechanismen, der mitochondrialen Biogenese und dem spezialisierten Mitochondrienabbauweg, der Mitophagie, schnell verändert werden^21,22. Der Gehalt und die Morphologie der Mitochondrien können je nach Zelltyp und Entwicklungsstadium variieren und können unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Stimuli umgebaut werden 17,22,23,24. Daher ist die Untersuchung der mitochondrialen Morphologie seit über einem halben Jahrhundert relevant²⁵. Insbesondere die Analyse von Mitochondrien durch Elektronenmikroskopie war die Standardtechnik, die in mehreren Studien angewendet wurde²⁶.

Fluoreszenzstudien mittels konfokaler Mikroskopie haben in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, da sie die Bildgebung von Mitochondrien in verschiedenen Fasertiefen in lebenden Zellen ermöglichen, was dazu beitragen könnte, die Rolle der Mitochondrien in der Skelettmuskulatur unter verschiedenen adaptiven und maladaptiven Bedingungen besser zu verstehen²⁷. In dieser Arbeit wird eine Methodik zur Analyse der Mitochondriendichte und -verteilung in lebenden Skelettmuskelfasern mittels konfokaler Mikroskopie beschrieben. Eine der größten Herausforderungen bei der Arbeit mit lebenden Skelettmuskelfasern besteht darin, eine Kontraktion von den Isolationsprozessen bis hin zur mitochondrialen konfokalen Ableitung zu vermeiden. Um dieses Ziel zu erreichen, wird eine hohe Mg- und ATP-Relax-Lösung¹⁷ verwendet, um die Fasern für mindestens 2 h entspannt zu halten, was genügend Zeit gibt, um den Faserisolationsprozess, die Fluorophorbelastung und die Erfassung des mitochondrialen Signals durch konfokale Mikroskopie durchzuführen. Ein kritischer Punkt des Protokolls ist die mechanische Gewinnung der Fasern, da dies eine hohe Präzision und frisches Gewebe erfordert. Es ist jedoch möglich, lebensfähige Faserbündel aus Rattenmuskeln mit dieser zuvor verwendeten und berichteten Technik²⁸ zu erhalten. Die Gewinnung intakter Fasern ermöglicht es, das Sarkolemma und die intrazelluläre Umgebung zu erhalten und die metabolische und funktionelle Wechselwirkung zwischen Zellstrukturen aufrechtzuerhalten^28,29.

Im Gegensatz zur Arbeit mit Geweben oder fixierten Zellen ermöglicht die Aufnahme von Fluoreszenzbildern mit konfokaler Mikroskopie die Echtzeitüberwachung der Auswirkungen verschiedener experimenteller Bedingungen. Das vorliegende Protokoll kann verwendet werden, um Veränderungen der mitochondrialen Dichte und Verteilung in Echtzeit zu untersuchen und Unterschiede zwischen experimentellen Gruppen zu untersuchen, wie z. B. die hier vorgestellten Beispiele zwischen Lean- und Ob-abgeleiteten Fasern (Abbildung 3 und Abbildung 4). Es sollte immer bedacht werden, dass die Bildgebung lebender Zellen die Standardisierung optimaler Arbeitsbedingungen mit geringfügigen Zellschäden impliziert. Die Arbeitszeit, die Qualität der verwendeten Lösungen, die Erfassungsparameter und die Belichtung der Laser müssen genau kontrolliert werden. Daher werden im Folgenden wesentliche Überlegungen angestellt.

Mitochondrien von Muskelfasern können aufgrund der Größe der Faser und der Schädigung der Faser, die durch eine lange Laserbelichtung verursacht werden kann, nicht vollständig longitudinal durch konfokale Mikroskopie erfasst werden. Dennoch wird bei dieser Technik eine repräsentative Probe der Faser aufgenommen. Obwohl es möglich ist, die gesamte Dicke der Skelettmuskelfaser einer Ratte durch konfokale Mikroskopie zu erfassen, bedeutet dies eine längere Aufnahmezeit und Exposition gegenüber dem Laserstrahl. Bei Kontrollratten traten keine Probleme mit diesen Aufzeichnungen auf. Fasern aus pathologischen Zuständen können jedoch anfälliger für Schäden sein, wie bei den Fasern von Ob-Ratten beobachtet wurde. Folglich wird die Aufnahme eines Stapels repräsentativer konfokaler Bilder, die bei unterschiedlichen Z-Entfernungen aufgenommen wurden, bevorzugt. Wenn nur ein Abschnitt der Faserdicke aufgezeichnet wird, wird empfohlen, den Stapel auf allen getesteten Fasern in der gleichen Tiefe zu nehmen, da die mitochondriale Verteilung und Dichte je nach Position innerhalb der Faser variieren kann. Es wird empfohlen, das Signal in einer Tiefe von über 15 μm zu erfassen, um repräsentative konfokale Bilder von IMF zu erhalten und SSM-Populationen zu vermeiden, die sich in der Nähe der Peripherie befinden.

Bei der konfokalen Aufnahme müssen einige wichtige Überlegungen berücksichtigt werden. Zunächst die Auswahl des Immersionsobjektivs unter Berücksichtigung der Vergrößerung, der hohen NA und des Immersionsmediums. Da die Zellen in einem hydrophilen Inkubationsmedium gehalten werden, muss der Brechungsindex des Inkubations- und Immersionsmediums ähnlich sein, um ein gutes Signal zu erhalten und tief in das Gewebe einzudringen. Dies wird in der Regel mit einem Wasserimmersionsobjektiv erreicht. Die konfokalen Bilder von Abbildung 3 und Abbildung 4 wurden mit einem 20-fachen, 0,7 NA Wasserimmersionsobjektiv aufgenommen. Dieses Objektiv ermöglicht die Aufnahme der Faser in ihrer gesamten Tiefe, aber es wurde für das Scannen bei 15, 18 und 21 μm entschieden, da repräsentative konfokale Bilder von IMF mit hohem Fluoreszenzintensitätssignal und geringer Faserbeschädigung erhalten werden können. Andere Vergrößerungen, wie z. B. 40x und Öl als Immersionsmedium, können in Betracht gezogen werden, müssen aber bewertet werden.

Zweitens wird die Pixelgröße für die Bildaufnahme nach dem Nyquist-Theorem berechnet, das die Auswahl einer geeigneten Pixelgröße ermöglicht, die Überabtastung (höhere Laserbelichtung) und Unterabtastung (führt zu geringerer Auflösung) ^vermeidet30. Die Berechnung hängt von den Eigenschaften des gewählten Objektivs und der Wellenlänge (~90 nm) ab. Es kann mit dem Zoom angepasst werden; Daher bietet nur eine Zoomeinstellung eine optimale Pixelgröße^{von 30}. Dennoch hängt der Zoom in der Praxis auch von der zu analysierenden Fläche der Probe ab. Das Finden der Balance ermöglicht es also, mit einer Pixelgröße zu arbeiten, die dem Nyquist-Kriterium am nächsten kommt und auch zu dem zu analysierenden Bereich passt. Abbildung 3 und Abbildung 4 wurden mit einer Pixelgröße von 150 und 190 nm aufgenommen, was eine Analyse der gesamten Breite der Faser von ~50-80 μm ermöglichte.

Drittens sollte ein geeigneter Lochblendendurchmesser verwendet werden, der verhindert, dass unscharfes Licht den Detektor erreicht. Typischerweise wird 1 Airy als die optimale Lochblendengröße angesehen, da sie die Detektion von ~80% der Photonen ermöglicht, die aus der Fokusebene³⁰ stammen. Einige gefärbte biologische Proben, die niedrige Fluoreszenzwerte aufweisen, erfordern jedoch eine Lochblende³⁰. Konfokale Bilder von Abbildung 3 und Abbildung 4 wurden mit einer Lochblendengröße von 3 Airy aufgenommen, da ein niedriges Signal mit einem niedrigeren Airy aufgenommen wurde. Es ist wichtig zu bedenken, dass der Anstieg der Signalintensität, der sich aus der Vergrößerung der Lochblenden ergibt, zu einer Verringerung der Auflösung aufgrund des erhöhten unscharfen eingefangenen Lichts führt. Aus diesem Grund empfehlen wir, eine Lochlochgröße zu verwenden, die so nah wie möglich an 1 airy liegt.

Bei entsprechender Aufnahme können konfokale Bilder verarbeitet werden, um quantitative Informationen über die Dichte und Verteilung der Mitochondrien zu erhalten. Unabhängig davon muss der kritische Verarbeitungsschritt des Bildes der Schwellwertbildung vor der Analyse durchgeführt werden, um die Quantifizierung des Signals zu verbessern. In diesem entscheidenden Schritt wird der Fluoreszenzintensitätswert definiert, der die positiven Pixel für Mitochondrien von denen des Hintergrunds trennt. Der Schwellenwert kann durch eine Gaußsche Anpassung des Peaks, der die Mitochondrien repräsentiert, definiert werden, wenn das Histogramm des Bildes zwei Peaks anzeigt, von denen einer dem Hintergrund und der andere den Mitochondrien entspricht. Allerdings wird nicht immer in jedem der Bilder eine bimodale Verteilung erreicht, so dass andere Schwellwertmethoden angewendet werden müssen.

In diesem Protokoll wird die Implementierung des Otsu-Schwellwerts beschrieben, bei dem es sich um ein nicht-parametrisches und unüberwachtes Verfahren handelt, das dazu bestimmt ist, den Schwellenwert zu finden, wenn die beiden Peaks nicht getrennt sind oder andere Peaks vorhanden sind³¹. Otsu kann einfach über eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder angewendet werden. Es können jedoch auch andere Schwellwertmethoden getestet werden. Die gleiche Schwellwertmethode muss auf alle konfokalen Bilder angewendet werden und muss für jedes konfokale Bild unabhängig berechnet werden. Das Anwenden des Schwellenwerts auf einen ganzen Stapel führt zu falschen Ergebnissen. Sobald die binären Bilder nach dem Schwellwertprozess erhalten sind, kann die Analyse der mitochondrialen Dichte und FFT einfach durchgeführt werden, indem die in diesem Protokoll beschriebenen Anweisungen befolgt werden. Bei der Durchführung beider Analysen sollte jedoch darauf geachtet werden, dass Kerne und Kapillaren nicht einbezogen werden, da dies zu Quantifizierungsfehlern führen würde. In Bezug auf die Dichte reicht es aus, die Pixel oder die Fläche, die von den Kernen oder Kapillaren eingenommen wird, von den zu analysierenden Pixeln oder der Gesamtfläche abzuziehen. Darüber hinaus muss bei der Durchführung der FFT-Analyse überprüft werden, ob das Mitochondriensignal gerade ist. Umgekehrt kann das Mitochondriensignal, wenn es gekippt ist, Profile erzeugen, die die mitochondriale Längsverteilung nicht repräsentieren, was zu falschen FFT-Spektrumdaten führt. Darüber hinaus kann ein Vorverarbeitungsschritt angewendet werden, um das Rauschen in den Bildern zu reduzieren. Dieses Protokoll beschreibt zwei optionale Vorverarbeitungsschritte mit einem Medianfilter und einer 2D-Dekonvolution. Die Auswirkungen dieser Vorverarbeitungsmethoden auf den Bild- und Mitochondriendichtegehalt sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Es ist wichtig zu bedenken, dass diese Vorprozesse zwar die Bildqualität verbessern können, aber auch zum Verlust bestimmter Bilddetails führen können. Daher sollten sie mit Vorsicht verwendet und konsequent auf alle analysierten Bilder angewendet werden.

Trotz ihrer Vorteile ist die konfokale Mikroskopie durch eine laterale Auflösung (XY) von 180-250 nm begrenzt, wenn die optimalen Bedingungen für die Erfassung erfüllt sind³². Der mitochondriale Durchmesser beträgt ~200-700 nm, nahe der Beugungsgrenze der konfokalen Mikroskopie; Daher können sub-mitochondriale Strukturen nicht adäquat detektiert werden³³ und können nicht durch Dichte- und FFT-Analysen bewertet werden, die in diesem Protokoll gezeigt werden. Andere hochauflösende Techniken der Mikroskopie, wie z. B. die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), die Sted-Nanoskopie (Stimulated Emission Depletion) oder die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), können erforscht werden, um submitochondriale Strukturen aufzulösen³². In diesem Protokoll werden die konfokalen Bilder der Mitochondrien mit dem Fluorophor TMRE aufgenommen, der vom mitochondrialen Membranpotential abhängt. Daher kann die mitochondriale Fluoreszenzintensität je nach ihrem Membranpotenzial variieren. Vor der Datenanalyse wird ein Schwellenwertprozess durchgeführt, um dieses Problem zu beheben. Alle Pixel, die über einem definierten Schwellenwert liegen, werden unabhängig von ihrem Fluoreszenzwert als positiv für das mitochondriale Signal angesehen. Dennoch muss beachtet werden, dass Mitochondrien mit einem sehr geringen Membranpotential mit dieser Technik nicht aufgelöst werden können. Daher werden ergänzende Studien zur Quantifizierung des mitochondrialen Proteingehalts empfohlen. Ein Vorteil der TMRE besteht darin, dass konfokale Bilder auch für die Analyse des mitochondrialen Membranpotentials verwendet werden können, jedoch müssen geeignete Kontrollen mit Entkopplungsmitteln wie Carbonylcyanid-p-Trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) durchgeführt werden. Darüber hinaus können die Anweisungen für die Analyse der mitochondrialen Dichte und Verteilung mit grün fluoreszierenden Indikatoren für Mitochondrien erreicht werden, die Mitochondrien unabhängig von ihrem Membranpotenzial belasten, aber die Inkubationsstrategie und die konfokalen Aufnahmeeinstellungen müssen standardisiert werden.

Angesichts der Tatsache, dass die Struktur der Mitochondrien mit wesentlichen mitochondrialen und zellulären Funktionen zusammenhängt, kann das hier beschriebene Protokoll wertvolle Informationen über ihren Umbau während einer Krankheit oder durch eine bestimmte Stressbelästigung liefern. Es könnte zu einem besseren Verständnis von Schlüsselfunktionen der Skelettmuskulatur beitragen, die von Mitochondrien gesteuert werden, wie z. B. die Energieproduktion, oder bei denen Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit anderen Organellen spielen, wie z. B. der Kontraktions-Stoffwechsel-Kopplung. Die Befolgung der Protokollanweisungen ermöglicht die Schätzung der mitochondrialen Dichte und Verteilung in der lebenden Skelettmuskulatur. Die Protokollschritte sind in drei Hauptphasen unterteilt, die sich auf die Dissektion von Skelettmuskelbündeln, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse konzentrieren, in denen detaillierte Anweisungen und wichtige Überlegungen enthalten sind. Insbesondere kann das Protokoll weiter optimiert werden, um zusätzliche Z-Schritte für die vollständige mitochondriale Rekonstruktion innerhalb der Faser entsprechend den Bedürfnissen des Benutzers zu erforschen. Zum Beispiel können die konfokalen Bild- und Analyseschritte getestet werden, um zelluläre Strukturen mit ähnlicher Verteilung zu untersuchen, wie z. B. TT in lebenden und fixierten Proben.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A6419
Borosilicate glass coverslip	Warner Instruments	64-0709
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670
Confocal microscope	Leica	TCS SP5
Confocal microscope software Leica Application Suite	Leica	2.7.3.9723
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	C3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)	Biomedical Imaging Group, EPFL	http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate	Sigma-Aldrich	11240
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E4378
Forceps	Miltex	MH-18
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective	Leica	506517
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Iris scissors	Miltex	5-304
L-(-)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M7397
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G1626
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
Maxchelator	UC Davis Health	https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm
Micro scissors	Miltex	18-1633
Open-source platform for biological-image analysis Fiji	Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji	https://fiji.sc/
Phosphocreatine disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	P7936
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
PSF Generator (PSF_Generator.jar)	Biomedical Imaging Group, EPFL	http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/
Recording chamber	Warner Instruments	RC-27N
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spreadsheet Microsoft Excel	Microsoft
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 508
Tetramethylrhodamine, ethyl ester	Invitrogen	T669