Analisi della densità mitocondriale e della distribuzione longitudinale nelle fibre muscolari scheletriche vive di ratto mediante microscopia confocale

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare i cambiamenti nella densità mitocondriale e nella distribuzione longitudinale mediante imaging del muscolo scheletrico vivo utilizzando la microscopia confocale per la scansione della rete mitocondriale.

Abstract

Il mitocondrio è un organello che può essere allungato, frammentato e rinnovato in base alle esigenze metaboliche delle cellule. Il rimodellamento della rete mitocondriale consente ai mitocondri sani di soddisfare le richieste cellulari; Tuttavia, la perdita di questa capacità è stata correlata allo sviluppo o alla progressione di diverse patologie. Nel muscolo scheletrico, si osservano cambiamenti nella densità mitocondriale e nella distribuzione in condizioni fisiologiche e patologiche come l'esercizio fisico, l'invecchiamento e l'obesità, tra gli altri. Pertanto, lo studio della rete mitocondriale può fornire una migliore comprensione dei meccanismi legati a tali condizioni.

Qui, viene descritto un protocollo per l'imaging mitocondriale di fibre muscolari scheletriche vive di ratti. Le fibre vengono sezionate manualmente in una soluzione rilassante e incubate con un indicatore fluorescente di imaging su cellule vive dei mitocondri (estere etilico tetrametilrodamina, TMRE). Il segnale mitocondriale viene registrato mediante microscopia confocale utilizzando la modalità di scansione XYZ per ottenere immagini confocali della rete mitocondriale intermiofibrillare (IMF). Successivamente, le immagini confocali vengono elaborate mediante thresholding e binarizzazione. L'immagine confocale binarizzata tiene conto dei pixel positivi per i mitocondri, che vengono poi contati per ottenere la densità mitocondriale. La rete mitocondriale nel muscolo scheletrico è caratterizzata da un'alta densità di popolazione IMF, che ha una distribuzione longitudinale periodica simile a quella dei tubuli T (TT). La Fast Fourier Transform (FFT) è una tecnica di analisi standard eseguita per valutare la distribuzione delle TT che permette di trovare la frequenza di distribuzione e il livello della loro organizzazione. In questo protocollo viene descritta l'implementazione dell'algoritmo FFT per l'analisi della distribuzione mitocondriale longitudinale nel muscolo scheletrico.

Introduzione

I mitocondri formano reti altamente dinamiche che sono regolate principalmente dall'equilibrio tra il loro allungamento (fusione) e frammentazione (fissione)1,2, che sono modulate dall'espressione e dall'attività di proteine come la Mitofusina 1 e ² (Mfn1 e Mfn2), e l'atrofia della proteina ottica ¹ (Opa1), che regolano la fusione della membrana mitocondriale esterna e della membrana interna^, rispettivamente ^1,2. La proteina correlata alla dinamina (Drp1) regola prevalentemente la fissione mitocondriale quando è fosforilata nel Ser616³.

Nel muscolo scheletrico, è stato ben stabilito che la rete mitocondriale è organizzata in sottopopolazioni strutturalmente ben definite in base alla loro vicinanza a diverse regioni cellulari (miofibrille, sarcolemmi e nuclei)^4,5. I mitocondri situati proprio sotto il sarcolemma sono chiamati mitocondri subsarcolemmali (SSM), quelli situati tra i filamenti contrattili sono chiamati mitocondri intermiofibrillari (IMF) e la sottopopolazione mitocondriale intorno ai nuclei è chiamata rete mitocondriale perinucleare (PMN). Inoltre, è stato suggerito che queste sottopopolazioni mitocondriali abbiano funzioni regionali-specifiche e siano metabolicamente specializzate ^4,5.

Il mantenimento dell'omeostasi energetica cellulare, che consente la funzione metabolica e contrattile, dipende in larga misura dall'interazione e dalla comunicazione su siti specifici attraverso la rete mitocondriale (ad esempio, l'interazione IMF e SSM)^4,6. Oltre alle interazioni della rete mitocondriale, il mitocondrio può interagire anche con altri organelli, formando complessi strutturali e funzionali. A questo proposito, è stato dimostrato che l'IMF può essere localizzato adiacente al reticolo sarcoplasmatico (SR) e in prossimità delle unità di rilascio di Ca²⁺ (CRU), formate dai tubuli trasversali (TT)⁷. Questo fatto è rilevante a causa del ruolo dell'assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ nella regolazione della sintesi di ATP e dell'apoptosi. Recentemente, è stato anche suggerito un potenziale ruolo nella regolazione dei transienti citosolici di Ca^{2+ 8}.

Le TT sono invaginazioni di sarcolemmi che hanno una distribuzione periodica lungo l'asse longitudinale dei cardiomiociti e delle fibre muscolari scheletriche ^9,10, simile alla distribuzione IMF 5. I cambiamenti nella distribuzione delle TT hanno importanti implicazioni fisiologiche, dato il loro ruolo nella funzione contrattile. Tuttavia, questi cambiamenti sono stati valutati principalmente nei cardiomiociti. L'utilizzo dell'analisi FFT (Fast Fourier Transform) consente la conversione di segnali periodici dal dominio della distanza al dominio della frequenza, ottenendo uno spettro FFT che indica la frequenza e la regolarità del segnale^11,12,13. Sebbene vi siano prove che l'organizzazione della rete mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche sia essenziale per l'adattamento a diverse condizioni metaboliche, poiché durante la rigenerazione dopo una lesione muscolare^14,15, la maggior parte delle analisi viene eseguita qualitativamente.

Inoltre, dato che la disfunzione mitocondriale è stata associata a diverse malattie legate al muscolo scheletrico (ad esempio, atrofia da disuso)² e non muscolari, in particolare le malattie metaboliche, e la perdita associata di massa muscolare (ad esempio, atrofia)¹⁶, la valutazione quantitativa della rete mitocondriale e della distribuzione nel muscolo scheletrico assume rilevanza. Recentemente, una differenza significativa nella distribuzione longitudinale dei mitocondri delle fibre muscolari gastrocnemie tra un gruppo obeso (Ob; Zucker fa/fa ratti), e un gruppo magro (Lean; Zucker +/+ ratti) è stato identificato attraverso FFT¹⁷. Questo studio ha dimostrato l'utilità della FFT nell'analisi della distribuzione mitocondriale. Pertanto, questo protocollo presenta una metodologia per studiare i mitocondri nelle fibre muscolari scheletriche vive da immagini ottenute mediante microscopia confocale a fluorescenza. La densità mitocondriale viene quantificata mediante la soglia di fondo e viene descritta anche l'analisi della distribuzione mitocondriale longitudinale mediante analisi FFT. Nella Figura 1 viene presentato uno schema del flusso di lavoro.

Protocollo

Tutte le procedure di sperimentazione animale sono state valutate e approvate dal Comitato per l'uso e la cura degli animali (CICUAL) del Tecnologico de Monterrey (Protocollo 2019-007). Per questo studio sono stati utilizzati ratti maschi Zucker (+/+ e fa/fa) di età compresa tra 12 e 13 settimane. Gli animali sono stati tenuti in condizioni di allevamento standard (ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore, umidità del 40-60%) e hanno avuto accesso al cibo (cibo standard per ratti) e all'acqua ad libitum.

1. Composizione della soluzione

1. Preparare la soluzione fresca di Relax mescolando i componenti indicati nella Tabella 1. Regolare il pH a 7,3 utilizzando idrossido di sodio (NaOH).
2. Calcolare la concentrazione di calcio libero nella soluzione Relax utilizzando un programma di simulazione per determinare la concentrazione di metallo libero.
3. Preparare una scorta di 5 mM di estere metilico di tetrametilrodamina (TMRE) in dimetilsolfossido (DMSO) e una successiva diluizione di 0,1 mM in DMSO.

2. Dissezione dei fasci di fibre muscolari del gastrocnemio

1. Posizionare l'animale all'interno della camera di induzione e chiudere il coperchio. Accendere la fonte di ossigeno, impostare la portata del gas a 0,5 L/min e impostare il vaporizzatore al 4% di sevoflurano per indurre l'anestesia.
2. Una volta che il ratto si è addormentato, posizionalo fuori dalla camera in posizione supina mantenendo l'anestesia. Pizzica la punta o la coda per verificare la mancanza di riflessi.
3. Con le forbici, taglia la pelle e i muscoli dell'addome. Quindi, taglia la gabbia toracica per accedere al cuore.
4. Per eseguire una cardiectomia, afferrare il cuore dalle vene e dalle arterie più alte con una pinza e tagliare i vasi sanguigni con le forbici. Togliete il cuore.
5. Subito dopo l'eutanasia, disinfettare l'arto posteriore con etanolo e raderlo con una macchina da barba.
6. Tenere il retropiede e praticare un'incisione con le forbici attraverso la pelle a livello del tendine d'Achille.
7. Tagliare l'arto posteriore con le forbici a livello della tibia prossimale. Trasferirlo in una capsula di Petri da 60 mm contenente 3 ml di soluzione Relax ghiacciata in posizione dorsale. Coprilo con una soluzione sufficiente per evitare che i muscoli si secchino.
8. Identifica il tendine d'Achille, sollevalo con cura con una pinza e seziona i muscoli lontano dall'osso con le forbici dell'iride. Utilizzare uno stereomicroscopio da questa fase in poi della dissezione.
9. Identificare e separare l'intero muscolo gastrocnemio, la massa principale nella parte posteriore dell'arto posteriore.
10. Sezionare e scartare il tessuto connettivo e adiposo che circonda il muscolo con una pinza a punta fine. Trasferire la testa laterale del muscolo in una nuova capsula di Petri con soluzione Relax ghiacciata (vedere la Figura 2A).
11. Tenere delicatamente il muscolo con una pinza da un'estremità e separarlo con cura in fasci con microforbici. Manipolare sempre i fasci tenendoli delicatamente a un'estremità con una pinza.
    NOTA: I fasci sono lunghi circa 10 mm e larghi 2 mm.
12. Trasferire i fasci di fibre in una nuova capsula di Petri con 2 ml di soluzione Relax ghiacciata. Selezionare solo quelli che hanno un aspetto liscio, sono completi da un'estremità all'altra e non sono accorciati (Figura 2B).

3. Acquisizione di immagini da cellule vive dei mitocondri nel muscolo scheletrico mediante microscopia confocale

1. Incubare le fibre in 2,5 × ^10-4 mM di TMRE in soluzione Relax per 20 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Con le concentrazioni di lavoro raccomandate di TMRE, ci si aspetta che sia in modalità non estinguente. Proteggere dall'esposizione alla luce da questo punto in poi.
2. Durante il periodo di incubazione:
   1. Aprire il software standard del microscopio confocale, selezionare il framework di configurazione, quindi nella finestra di dialogo di configurazione hardware selezionare laser e selezionare l'opzione HeNe 543 .
   2. Nel framework di acquisizione, selezionare la finestra di dialogo di acquisizione e, nella modalità di acquisizione, selezionare il pannello XYZ.
   3. Nella finestra di dialogo XY, selezionate il formato 512 x 512, la velocità di 400 Hz e il pannello stenopeico. Nella finestra di dialogo stenopeica visualizzata, selezionare AU per unità e aggiungere un valore di 3 Airy per il foro stenopeico.
      NOTA: Prendere in considerazione la possibilità di ridurre la dimensione del foro stenopeico più vicina al criterio ottimale di 1 Airy, se viene conservato un segnale di fluorescenza adeguato.
   4. Nella finestra di dialogo Impostazioni percorso fascio , selezionare un obiettivo di immersione in acqua di 20x e un'apertura numerica (NA) di 0,7 (20x/0,7 IMM), quindi selezionare la finestra della lunghezza d'onda di emissione di 576-700 nm. Selezionare DD488/543 e il 15% della potenza laser per il laser 543.
      NOTA: Si consiglia vivamente di utilizzare un obiettivo a immersione in acqua per la scansione di immagini dal vivo (se disponibile). Poiché si ottiene un indice di rifrazione simile del mezzo di immersione e del mezzo di incubazione.
3. Dopo 20 minuti di incubazione, sostituire due volte il mezzo di incubazione. Assicurarsi che le immagini confocali vengano acquisite entro 20-30 minuti dall'incubazione.
4. Preparare la camera di registrazione con un vetrino coprioggetti da 0,15 mm di vetro borosilicato.
   NOTA: Selezionare lo spessore del vetrino coprioggetto in base alla camera di registrazione disponibile, considerando che lo spessore di solito varia da 0,15 a 0,22 mm per prestazioni ottimali.
5. Aggiungere 200 μL di soluzione Relax alla camera di registrazione e trasferire i fasci di fibre.
6. Nel microscopio confocale, utilizzare la modalità in campo chiaro per identificare le fibre vitali per la registrazione fluorescente dei mitocondri. Le fibre vitali sono complete, non contratte e hanno un modello di striatura intatto.
7. Separare i fasci di fibre l'uno dall'altro e allinearli con una pinza. Seleziona quelli che sono più vicini al vetrino coprioggetto.
8. Scansiona la fluorescenza utilizzando il pulsante live per regolare il guadagno e l'offset nella console del pannello di controllo considerando quanto segue:
   1. Selezionare bassi valori di intensità fluorescente per uno sfondo di quasi 0 Unità Arbitrarie (U.A.).
   2. Selezionare un livello di guadagno compreso tra 100 e 200 U.A. per evitare la saturazione del sistema di registrazione. Quindi, non registrare i livelli di fluorescenza più alti.
   3. Selezionare una dimensione dei pixel di 150-190 nm per acquisire l'intera larghezza della fibra, regolando il fattore di zoom nella finestra di dialogo XY .
      NOTA: Prendere in considerazione l'utilizzo di una dimensione dei pixel più vicina ai criteri di Nyquist (90 nm), che consente la scansione dell'intera larghezza della fibra.
9. Nella finestra di dialogo Stack Z, regolare la distanza Z per acquisire il segnale di fluorescenza a partire da una profondità della fibra di 15 μm (pulsante di inizio) fino a 22 μm (pulsante di fine). Selezionare 3 μm come dimensione del passo Z.
10. Fare clic sul pulsante Start per acquisire le immagini confocali. Ottenere una Z-stack composta da tre immagini confocali acquisite a 15, 18 e 21 μm di profondità.

4. Analisi della densità mitocondriale

1. Nella piattaforma open source per l'analisi delle immagini biologiche¹⁸ aprire il file Z-stack e ruotare le immagini per posizionare la fibra orizzontalmente, come mostrato nella Figura 3B.
2. Selezionare in modo casuale una regione rettangolare di interesse (ROI) che includa l'area occupata dai mitocondri (_mitomo ROI). Seleziona dimensioni _{del ROI mito} comprese tra 65 e 90 μm per X. Per Y, la dimensione dipenderà dalla larghezza della fibra, evitando la sua periferia.
3. Duplicare lo Z-stack con il _mitoROI selezionato e salvarlo come nuovo Z-stack (Mito-stack) in formato TIFF. Salvare la posizione del _{mito ROI} selezionata nello stack originale con lo strumento ROI Manager.
4. Calcola la soglia per la sottrazione di sfondo come segue:
   1. Utilizzare il comando di scelta rapida +Maiusc+t per aprire la finestra di dialogo Soglia .
   2. Selezionare l'algoritmo di soglia Otsu |B&N | Opzione sfondo scuro . Si noti che l'immagine è ora binarizzata.
   3. Nella finestra di dialogo Soglia , osservare l'istogramma della distribuzione dell'intensità della fluorescenza e il valore di soglia visualizzato.
      NOTA: i pixel positivi ai mitocondri hanno valori di intensità di fluorescenza superiori alla soglia e appaiono come pixel bianchi nell'immagine binaria.
   4. Applicare la soglia allo stack di immagini binarie selezionando Applica. Nella finestra di dialogo Converti pila in binario visualizzata, selezionare le opzioni Calcola soglia per ogni immagine, Sfondo nero, Crea nuova pila e fare clic su OK.
5. Si noti che viene generato uno stack con le tre immagini binarie (BinDMito-stack). Salvalo in formato TIFF.
6. Calcolare la densità mitocondriale nello stack BinDMito-stack come segue:
   1. Selezionare il menu Analizza . Quindi, fai clic su Istogramma. Nella finestra di dialogo dell'istogramma visualizzata, fare clic su Sì per includere tutte le immagini della pila per l'analisi.
   2. Nella finestra di dialogo Istogramma dello stack, fare clic su Elenco per ottenere i dati dell'istogramma. Trasferisci i dati dell'istogramma in un foglio di calcolo.
   3. In un foglio di calcolo, identifica i mito-pixel con il valore 255 . Calcolare Densità mitocondriale usando l'equazione (1):
      Densità mitocondriale = × 100 (1)
      I pixel totali vengono identificati come N nella finestra di dialogo Istogramma o calcolati sommando nel foglio di calcolo il numero di pixel dell'istogramma.
   4. Per calcolare l'area occupata dai mitocondri (μm²), moltiplicare i mito-pixel dello stack BinDMito per la dimensione dei pixel.

5. Analisi della distribuzione mitocondriale mediante trasformata di Fourier veloce

1. Nella piattaforma open source per l'analisi delle immagini biologiche, apri lo stack BinDMito e disegna un ROI rettangolare di 256 pixel di larghezza e 5 μm di altezza. Individua un ROI in una posizione centrale e un altro in posizione laterale, come mostrato nella Figura 4A,B.
2. Utilizza lo strumento ROI Manager per configurare le ROI per l'analisi FFT e salvarle.
   NOTA: A seconda delle necessità dell'analisi, è possibile selezionare altri ROI in diverse posizioni e modificarne le dimensioni. Tuttavia, la larghezza deve essere uguale a 2ⁿ pixel per eseguire FFT (ad esempio, 128, 256, 512 pixel).
3. Ottenere il profilo grafico delle ROI utilizzando il comando di scelta rapida + k e trasferire i dati in un foglio di calcolo.
4. Nel foglio di calcolo, riempi le colonne B e C con i dati ottenuti dal profilo di plottaggio. La colonna B contiene la distanza in μm e la colonna C il corrispondente valore di grigio dell'intensità di fluorescenza (U.A.).
5. La colonna D corrisponde alla frequenza FFT (evento/μm), che verrà compilata come segue:
   1. Calcolare la frequenza di campionamento (Fs): Fs = 1/Δ d, dove Δ d è il passo di distanza (il secondo valore di B).
   2. Calcola Δ Fs: Δ Fs= Fs/N, dove N è il numero di punti dati di B (256).
   3. Calcolare il valore di stop della frequenza FFT (S): S = (N/2) ×ΔFs.
   4. Riempi la colonna D come segue:
      1. Il primo valore della colonna D è uguale a 0.
      2. Seleziona la seconda cella nella colonna D, vai al menu principale, seleziona Riempi e fai clic su serie. Selezionare le colonne. Per il valore del passo, utilizzare il Δ Fs calcolato. Per il valore di stop, utilizzare il valore S calcolato.
   5. Successivamente, riempi la colonna E con i valori complessi FFT come segue:
      1. Inserire 0 nella prima cella della colonna C, perché la distanza 0 deve coincidere con un segnale 0 per il calcolo della FFT.
      2. Quindi, vai al menu Dati , fai clic su Analisi dei dati e seleziona Analisi di Fourier.
      3. Nella nuova finestra, selezionare l'intervallo di punti dati del segnale fluorescente descritto nella colonna C per l'intervallo di ingresso.
         NOTA: Il numero di punti dati deve essere 2ⁿ (ad esempio, 256 o 128 punti dati di segnale fluorescente).
      4. Selezionare l'intervallo corrispondente di E per l'intervallo di uscita.
      5. Selezionare Ok e lasciare che i valori complessi FFT vengano compilati automaticamente.
6. Riempi la colonna F con la magnitudine FFT come segue:
   1. Usa la funzione IMABS per restituire il valore assoluto in F dal numero complesso in E e moltiplica per 2/N per normalizzare (equazione (2)):
      Magnitudo FFT = (IM.ABS (E₁... E_n) × (2/N) (2)
7. Tracciare lo spettro FFT utilizzando la magnitudine FFT in F, in funzione della frequenza FFT in D, fino a S. Trova il punto del picco massimo e la sua corrispondente frequenza FFT.
8. Convertire la frequenza FFT del picco massimo in distanza con l'equazione (3). Questa distanza calcolata rappresenta la distanza longitudinale della distribuzione mitocondriale.
   Distanza (μm) = 1/frequenza FFT (3)
   NOTA: A causa della simmetria FFT, non tracciare la frequenza FFT oltre il valore S , che corrisponde alla metà dei punti dati, evitando la duplicazione dello spettro FFT.

6. Fasi di pre-elaborazione opzionali per ridurre il rumore dell'immagine prima dell'analisi dell'immagine

1. Applicare un filtro mediano o una deconvoluzione 2D come indicato di seguito:
   1. Per il filtro mediano:
      1. Selezionare Processo | Filtri e fare clic sull'opzione Mediana .
      2. Nella finestra di dialogo Mediana visualizzata, selezionate 2.0 per Raggio (Radius) e fate clic su OK. Scegliere Sì per applicare il processo a tutte le immagini nello stack Mito.
      3. Osservare la riduzione del rumore nelle immagini.
   2. Per la deconvoluzione 2D:
      1. Generare una funzione di distribuzione dei punti (PSF) teorica.
      2. Scarica il plugin PSF_Generator.jar e inserisci il file nella cartella "Plugins".
      3. Nella finestra di dialogo Generatore PSF , fare clic sull'opzione Modello ottico 3D Born & Wolf, immettere il valore di immersione dell'indice di rifrazione pari a 1,33 utilizzato durante la scansione confocale e selezionare Migliore per l'opzione Calcolo precisione .
      4. Cattura 576 nm per la lunghezza d'onda di emissione, il NA dell'obiettivo utilizzato di 0,7 e il passo Z di 3.000 nm.
      5. Acquisire la dimensione dei pixel XY dell'immagine confocale da deconvolgere, nonché la dimensione XYZ che indica il numero di pixel di X e Y e il numero di passi Z (3 per questo protocollo).
      6. Nel menu Visualizzazione del generatore PSF, fare clic sull'opzione lineare, selezionare Risoluzione a 8 bit, quindi selezionare l'opzione grigi per la tabella di ricerca (LUT).
      7. Eseguire il generatore di PSF e salvare il PSF teorico creato in formato TIFF.
      8. Crea una somma delle sezioni del PSF creato aprendo lo strumento Progetto Z dell'opzione Pile che si trova nel menu Immagine .
      9. Nella finestra di dialogo ZProjection visualizzata, selezionare Somma sezioni per il tipo di proiezione e fare clic su OK. Salvare il nuovo file PSF in formato TIFF.
         NOTA: Al posto della PSF teorica può essere utilizzata una PSF ottenuta sperimentalmente mediante microsfere fluorescenti a scansione confocale con diametro noto.
      10. Scarica il plugin "DeconvolutionLab_2.jar"¹⁹ e inseriscilo nella cartella del plugin.
      11. Fare clic sul menu Plugin. Quindi, fai clic su DeconvolutionLab2.
      12. Separare le immagini confocali dalla pila Mito utilizzando lo strumento Immagini da impilare dall'opzione Pile situata nel menu Immagine e salvarla in formato TIFF.
      13. Nella finestra di dialogo DeconvolutionLab2 , selezionare una delle immagini ottenute dallo stack Mito. Selezionare la PSF teorica creata e selezionare l'algoritmo Richardson-Lucy con 15 iterazioni.
      14. Esegui DeconvolutionLab2, verifica il miglioramento del segnale e la riduzione del rumore nell'immagine e salvala in formato TIFF.
2. Continuare con il passaggio 4.4 per l'analisi delle immagini.
3. Per la definizione delle soglie delle immagini deconvolute, convertirle in una maschera a 8 bit durante il processo di soglia. Crea una pila con le immagini binarie e decontorte selezionando Immagini da impilare nello strumento Pile del menu Immagine .
4. Per l'analisi FFT di immagini deconvolute, il profilo del grafico contiene la distanza in unità di pixel. Trasformate le unità pixel in μm come segue:
   1. Nel foglio di calcolo, dopo aver completato il passaggio 5.4, trasferisci i dati da B ad A. Quindi, riempi B con la distanza in μm moltiplicando ogni numero di pixel da A per la dimensione del pixel.

Risultati

Seguendo il presente protocollo, l'analisi della densità e della distribuzione dei mitocondri può essere ottenuta nel muscolo scheletrico vivo. Il protocollo è suddiviso in tre fasi principali: dissezione del fascio muscolare scheletrico, scansione al microscopio confocale e analisi delle immagini. La panoramica del flusso di lavoro è illustrata nella Figura 1. La Figura 2A mostra un muscolo gastrocnemio di ratto intero in una capsula di Petri, che segna la testa laterale da cui si ottengono le fibre, mentre la Figura 2B mostra i fasci di fibre nella soluzione Relax. Mediante microscopia confocale, i mitocondri possono essere registrati lungo la profondità della fibra muscolare scheletrica viva utilizzando l'indicatore fluorescente TMRE. TMRE è un fluoroforo cationico lipofilo che viene selettivamente accumulato all'interno dei mitocondri in base al potenziale di membrana mitocondriale²⁰.

Un'immagine confocale ottimale dell'IMF può essere ottenuta selezionando una distanza Z superiore a 15 μm di profondità all'interno della fibra (Figura 3A). La Figura 3B mostra immagini confocali XY rappresentative dei mitocondri carichi di TMRE acquisite lungo la distanza Z delle fibre muscolari gastrocnemie (da 15 a 21 μm). Le immagini confocali sono state elaborate mediante thresholding per trasformarle in immagini binarie per consentire l'analisi mitocondriale. La Figura 3B (pannello di sinistra) mostra una fibra di un ratto Lean esercitato. Rappresenta un record confocale previsto dei mitocondri delle fibre muscolari scheletriche poiché ha un modello coerente lungo la fibra. Al contrario, abbiamo selezionato una fibra da un ratto Ob (Figura 3B, pannello di destra) che mostra alterazioni sostanziali nel contenuto e nella distribuzione mitocondriale. La Figura 3C mostra la quantificazione dell'area delle fibre occupata dai mitocondri espressa come densità mitocondriale, ottenuta da ciascuna immagine binarizzata (mostrata nel pannello B). Come previsto, la fibra Ob presentava una densità mitocondriale inferiore. È stato quantificato in modo coerente lungo la distanza Z analizzata, che si osserva anche nella Figura 3D quando viene calcolata la densità mitocondriale per pila conforme alle tre immagini confocali acquisite a 15, 18 e 21 μm.

Analogamente all'analisi della densità mitocondriale, la scansione confocale di un indicatore fluorescente per l'imaging di cellule vive, come TMRE, consente di studiare l'organizzazione longitudinale dei mitocondri nel muscolo scheletrico vivo. L'IMF presenta un'organizzazione periodica in banda I vicina al TT⁷, che può essere analizzata da FFT per quantificare la frequenza del segnale mitocondriale e il livello di organizzazione¹⁷. La Figura 4 mostra le differenze nell'organizzazione dell'IMF riscontrate nei gastrocnemi derivati da ratti Lean e Ob e come la FFT permette di trovare i cambiamenti nella distribuzione del segnale mitocondriale. Le Figure 4A,B mostrano ROI longitudinali selezionate in posizione centrale e laterale nella fibra per l'analisi FFT. Prima di eseguire la FFT, viene calcolata la soglia per la sottrazione di background. Quindi, l'immagine viene binarizzata; Queste procedure eliminano le variazioni nei livelli di intensità della fluorescenza del segnale mitocondriale. L'immagine binaria fornisce il profilo grafico della distribuzione della fluorescenza necessario per eseguire la FFT.

La Figura 4C,D mostra le ROI selezionate nei pannelli A e B con i relativi profili di stampa (pannelli superiori). Dai profili del grafico, si possono osservare differenze nella distribuzione della fluorescenza tra le fibre derivate da ratti Lean e Ob, nonché le variazioni tra ROI all'interno della stessa fibra. Per ogni profilo di appezzamento, viene presentato il rispettivo spettro FFT (pannelli inferiori). Il picco dello spettro FFT massimo indica la frequenza FFT (asse X) della distribuzione del segnale mitocondriale lungo l'asse longitudinale. Può essere trasformato in un valore di distanza vicino a 2 μm nelle ROI laterali e centrali dal ratto Lean. In particolare, l'ampiezza FFT del picco è un indice della regolarità del segnale mitocondriale e i cambiamenti in questa ampiezza rivelano alterazioni nella distribuzione mitocondriale.

Le Figure 4E,F mostrano le differenze nello spettro FFT tra le fibre derivate da Lean e Ob in cui sono stati analizzati rispettivamente i ROI laterali e centrali. Nelle ROI laterali (Figura 4E) la frequenza della distribuzione longitudinale mitocondriale era simile nelle fibre magre e derivate da Ob; tuttavia, l'ampiezza del picco massimo di FFT nelle fibre derivate da Ob era più alta, il che è in accordo con la maggiore regolarità del segnale osservata nell'immagine in Figura 4B. Ciononostante, il ROI centrale (Figura 4F) dell'Ob è osservato come esempio di riduzione critica del picco FFT rispetto a Lean quando è presente un'importante alterazione della distribuzione mitocondriale.

Figura 1: Schema per l'analisi mitocondriale nel muscolo scheletrico mediante microscopia confocale. Questo schema riassume le fasi principali del protocollo in tre fasi separate. La prima fase, la dissezione dei fasci di fibre muscolari del gastrocnemio, è suddivisa in tre fasi successive, l'isolamento del muscolo gastrocnemio, seguito dalla dissezione meccanica del muscolo in fasci per effettuare infine una selezione visiva di quelli vitali. La seconda fase consiste nell'acquisizione di immagini di cellule vive mediante microscopia confocale, che consiste nell'incubazione con il fluoroforo (TMRE) per 20 minuti a temperatura ambiente per posizionare le fibre nella camera. Successivamente, vengono effettuate le impostazioni appropriate nel microscopio per condurre l'acquisizione delle immagini confocali. Durante la terza fase, vengono condotte l'elaborazione delle immagini confocali e l'analisi dei dati. A partire dall'elaborazione delle immagini, in cui è necessaria una soglia per generare immagini binarie da cui vengono eseguiti i calcoli della densità mitocondriale e la distribuzione mitocondriale per FFT. Abbreviazioni: TMRE = estere etilico di tetrametilrodamina; FFT = Trasformata di Fourier veloce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dissezione del fascio di muscolo scheletrico. (A ) Testa di gastrocnemio laterale di ratto sezionata (freccia nera) in una capsula di Petri con soluzione Relax. (B) Immagine rappresentativa dei fasci di fibre muscolari del gastrocnemio nella soluzione Relax prima del carico di TMRE. Abbreviazione: TMRE = estere etilico di tetrametilrodamina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi della densità mitocondriale. (A) Illustrazione che rappresenta la distanza Z raccomandata per la scansione confocale dei mitocondri IMF nelle fibre muscolari scheletriche. (B) Serie di immagini confocali di mitocondri carichi di TMRE nelle fibre muscolari scheletriche, ottenute da un ratto Zucker +/+ (Lean) esercitato e da un ratto Zucker fa/fa obeso (Ob) registrato alla distanza Z (da 15 a 21 μm di profondità). Le immagini sono state elaborate mediante thresholding e trasformate in immagini binarie. (C) Mito-densità calcolata delle fette confocali ottenute a diverse distanze Z osservate nel pannello B. (D) La mito-densità ottenuta dalla pila composta dalle immagini osservate nel pannello B. Le immagini nel pannello B sono 65 x 50 μm. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: Mito-densità = Densità mitocondriale; IMF = mitocondri intermiofibrillari; Ob = obeso; SSM = mitocondri subsarcolemmali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi della distribuzione mitocondriale mediante FFT. Immagini confocali rappresentative di mitocondri caricati con l'indicatore fluorescente TMRE acquisite a 21 μm della profondità delle fibre muscolari scheletriche ottenute da un ratto Zucker +/+ esercitato (Lean, pannello A) e da un ratto obeso Zucker fa/fa (Ob, pannello B). Le immagini sono state elaborate mediante thresholding e trasformate in immagini binarie. ROI laterali e centrali del pannello A (pannello C) e del pannello B (pannello D) con i rispettivi profili di intensità di fluorescenza (grafico superiore) e spettro FFT (grafico inferiore). La FFT è stata calcolata a partire da ROI con 256 pixel di larghezza, che corrisponde a una dimensione del ROI di 39 x 5 μm nel pannello A e a una dimensione del ROI di 50 x 5 μm nel pannello B. Il pannello E mostra le differenze dello spettro FFT riscontrate tra i mitocondri derivati da ratti Lean e Ob nella ROI laterale, mentre il pannello F mostra le differenze dello spettro FFT della ROI centrale. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: U.A. = Unità Arbitrarie; FFT = Trasformata di Fourier veloce; ROI = regioni di interesse; Ob = obeso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Reagente	Concentrazione finale in 100 mL	Ceppo
K-aspartato	100 mM
Kcl	20 millimetri
HEPES	20 millimetri
Acido L-glutammico	3 milioni di minuti
Acido malico	3 milioni di minuti
EGTA	0,1 millimetri	10 milioni di metri
MgCl2	1 mM libero Mg2+
CaCl2	0,00002 mM di Ca2+ libero
Fosfocreatina di-Na	5 milioni di metri	500 mM
Creatinfosfochinasi	5 U/mL	200 U/mL
MgATP	5 milioni di metri
pH 7,3 (con NaOH)

Tabella 1: Rilassare i reagenti della soluzione e la concentrazione.

Figura supplementare S1: Effetto dei metodi di pre-elaborazione delle immagini. (A) Immagini confocali rappresentative di mitocondri caricati con l'indicatore fluorescente TMRE acquisite a una profondità di 18 μm in fibre muscolari scheletriche ottenute da un ratto Zucker +/+ esercitato (Lean, pannello superiore) e da un ratto Zucker fa/fa obeso (pannello inferiore), insieme alle rispettive immagini ottenute dopo pre-trattamento utilizzando la soglia di Otsu, il filtro mediano e la soglia di Otsu, e la deconvoluzione 2D e la soglia di Otsu. (B) Tracciare il profilo della mito-densità ottenuta dalle immagini confocali (pannello A) dopo preprocessing con metodi diversi. Le immagini nel pannello A sono di 65 x 50 μm. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: 2D-Decon = deconvoluzione 2D; Mito-densità = Densità mitocondriale. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussione

I mitocondri sono organelli con un'elevata capacità di rimodellamento. Il loro contenuto, la loro densità e la loro distribuzione possono essere rapidamente modificati attraverso l'attivazione dei meccanismi di fusione e fissione mitocondriale, noti come dinamica mitocondriale¹, e l'equilibrio tra i meccanismi di turnover mitocondriale: la biogenesi mitocondriale e la via di degradazione dei mitocondri specializzata, la mitofagia^21,22. Il contenuto e la morfologia mitocondriale possono variare a seconda del tipo di cellula e dello stadio di sviluppo e possono essere rimodellati sotto diversi stimoli fisiologici e patologici 17,22,23,24. Pertanto, lo studio della morfologia mitocondriale è stato rilevante per oltre mezzo secolo²⁵. In particolare, l'analisi dei mitocondri attraverso la microscopia elettronica è stata la tecnica standard applicata in molteplici studi²⁶.

Gli studi di fluorescenza al microscopio confocale hanno acquisito rilevanza negli ultimi anni grazie alla loro capacità di imaging di mitocondri a diverse profondità di fibra, che potrebbero aiutare a comprendere meglio il ruolo dei mitocondri nel muscolo scheletrico in diverse condizioni adattative e disadattive²⁷. In questo studio viene descritta una metodologia per l'analisi della densità e della distribuzione dei mitocondri nelle fibre muscolari scheletriche vive mediante microscopia confocale. Una delle principali sfide del lavoro con le fibre muscolari scheletriche vive è quella di evitare la contrazione dai processi di isolamento fino alla registrazione confocale mitocondriale. Per raggiungere questo obiettivo, viene utilizzata una soluzione ad alto contenuto di Mg e ATP Relax¹⁷ per mantenere le fibre rilassate per almeno 2 ore, il che dà il tempo sufficiente per eseguire il processo di isolamento delle fibre, il carico di fluorofori e l'acquisizione del segnale mitocondriale mediante microscopia confocale. Un punto critico del protocollo è l'ottenimento meccanico delle fibre poiché richiede alta precisione e tessuto fresco; Tuttavia, è possibile ottenere fasci di fibre vitali dal muscolo di ratto con questa tecnica precedentemente utilizzata e riportata²⁸. L'ottenimento di fibre intatte permette di preservare il sarcolemma e l'ambiente intracellulare, mantenendo il crosstalk metabolico e funzionale tra le strutture cellulari^28,29.

A differenza del lavoro con tessuti o cellule fisse, l'acquisizione di immagini fluorescenti per l'imaging di cellule vive mediante microscopia confocale consente il monitoraggio in tempo reale dell'effetto di diverse condizioni sperimentali. Il presente protocollo può essere utilizzato per esplorare i cambiamenti nella densità e nella distribuzione mitocondriale in tempo reale ed esplorare le differenze tra i gruppi sperimentali, come gli esempi qui presentati tra fibre derivate da Lean e Ob (Figura 3 e Figura 4). Va sempre considerato che l'imaging di cellule vive implica la standardizzazione di condizioni di lavoro ottimali con un danno cellulare minore. Il tempo di lavoro, la qualità delle soluzioni utilizzate, i parametri di acquisizione e l'esposizione dei laser devono essere finemente controllati. Di seguito, quindi, si riportano le considerazioni essenziali.

I mitocondri delle fibre muscolari non possono essere registrati interamente longitudinalmente dalla microscopia confocale a causa delle dimensioni della fibra e del danno della fibra che può essere causato da una lunga esposizione al laser. Tuttavia, con questa tecnica viene registrato un campione rappresentativo della fibra. Sebbene sia possibile registrare l'intero spessore della fibra muscolare scheletrica di un ratto mediante microscopia confocale, ciò implica un tempo di registrazione e un'esposizione al raggio laser più lunghi. Nel caso dei ratti di controllo, non sono stati riscontrati problemi con queste registrazioni. Tuttavia, le fibre provenienti da condizioni patologiche possono essere più suscettibili ai danni, come osservato nelle fibre dei ratti Ob. Di conseguenza, è preferibile acquisire una pila di immagini confocali rappresentative ottenute a diverse distanze Z. Quando viene registrata solo una sezione dello spessore della fibra, si consiglia di prelevare la pila alla stessa profondità su tutte le fibre testate poiché la distribuzione e la densità mitocondriale possono variare in base alla sua posizione all'interno della fibra. L'acquisizione del segnale ad una profondità superiore a 15 μm è raccomandata per ottenere immagini confocali rappresentative dell'FMI, evitando le popolazioni SSM che si trovano vicino alla periferia.

Durante l'acquisizione confocale, è necessario tenere conto di alcune importanti considerazioni. Innanzitutto, la selezione dell'obiettivo a immersione considerando l'ingrandimento, l'elevato NA e il mezzo di immersione. Poiché le cellule sono mantenute in un mezzo di incubazione idrofilo, l'indice di rifrazione del mezzo di incubazione e immersione deve essere simile per ottenere un buon segnale e scansionare in profondità nel tessuto. Di solito si ottiene utilizzando una lente dell'obiettivo a immersione in acqua. Le immagini confocali della Figura 3 e della Figura 4 sono state acquisite con un obiettivo a immersione in acqua 20x, 0,7 NA. Questo obiettivo consente di registrare la fibra in tutta la sua profondità, ma è stata decisa la scansione a 15, 18 e 21 μm poiché è possibile ottenere immagini confocali rappresentative dell'IMF con segnale ad alta intensità di fluorescenza e danni minori alla fibra. Altri ingrandimenti, come il 40x e l'olio come mezzo di immersione, possono essere presi in considerazione, ma devono essere valutati.

In secondo luogo, la dimensione dei pixel per l'acquisizione delle immagini viene calcolata in base al teorema di Nyquist, che consente la selezione di una dimensione dei pixel appropriata che evita il sovracampionamento (maggiore esposizione laser) e il sottocampionamento (porta a una minore risoluzione)³⁰. Il calcolo dipende dalle caratteristiche della lente dell'obiettivo selezionata e dalla lunghezza d'onda (~90 nm). Può essere regolato con lo zoom; Pertanto, solo un'impostazione di zoom fornisce una dimensione ottimale^{dei pixel 30}. Tuttavia, in pratica, lo zoom dipende anche dall'area del campione da analizzare. Pertanto, trovare l'equilibrio consente di lavorare con una dimensione dei pixel che si avvicina di più al criterio di Nyquist e che si adatta anche all'area da analizzare. La Figura 3 e la Figura 4 sono state acquisite con una dimensione dei pixel di 150 e 190 nm, che ha permesso di analizzare l'intera larghezza della fibra che è ~50-80 μm.

In terzo luogo, è necessario utilizzare un diametro stenopeico appropriato che impedisca alla luce sfocata di raggiungere il rilevatore. Tipicamente, 1 Airy è considerata la dimensione ottimale del foro stenopeico poiché consente la rilevazione di ~80% dei fotoni provenienti dal piano di fuoco³⁰. Tuttavia, alcuni campioni biologici colorati che mostrano bassi livelli di fluorescenza richiedono un aumento del foro stenopeico³⁰. Le immagini confocali della Figura 3 e della Figura 4 sono state acquisite con una dimensione del foro stenopeico di 3 Airy a causa di un segnale basso catturato con un Airy inferiore. È importante considerare che l'aumento dell'intensità del segnale derivante dall'aumento della dimensione del foro stenopeico porta alla riduzione della risoluzione a causa dell'aumento della luce catturata fuori fuoco. Per questo motivo, si consiglia di utilizzare una dimensione del foro stenopeico il più vicino possibile a 1 ariosa.

Se adeguatamente acquisite, le immagini confocali possono essere elaborate per ottenere informazioni quantitative sulla densità e la distribuzione mitocondriale. Indipendentemente da ciò, la fase critica di elaborazione dell'immagine di soglia deve essere eseguita prima dell'analisi per migliorare la quantificazione del segnale. Durante questo passaggio cruciale, viene definito il valore dell'intensità di fluorescenza che separa i pixel positivi per i mitocondri da quelli dello sfondo. La soglia può essere definita da un adattamento gaussiano del picco che rappresenta i mitocondri quando l'istogramma dell'immagine mostra due picchi, uno corrispondente allo sfondo e l'altro ai mitocondri. Tuttavia, non sempre si ottiene una distribuzione bimodale in ciascuna delle immagini, quindi è necessario applicare altri metodi di soglia.

In questo protocollo viene descritta l'implementazione della soglia di Otsu, che è un metodo non parametrico e non supervisionato progettato per trovare il valore di soglia quando i due picchi non sono separati o sono presenti altri picchi³¹. Otsu può essere facilmente applicato utilizzando una piattaforma open-source per l'analisi di immagini biologiche; Tuttavia, è possibile testare altri metodi di soglia. Lo stesso metodo di soglia deve essere applicato a tutte le immagini confocali e deve essere calcolato indipendentemente per ciascuna immagine confocale. L'applicazione della soglia a un intero stack porta a risultati errati. Una volta ottenute le immagini binarie dopo il processo di soglia, l'analisi della densità mitocondriale e della FFT può essere facilmente effettuata seguendo le istruzioni descritte in questo protocollo. Tuttavia, quando si eseguono entrambe le analisi, è necessario prestare attenzione per evitare di includere nuclei e capillari, in quanto ciò comporterebbe errori di quantificazione. Per quanto riguarda la densità, è sufficiente sottrarre i pixel, ovvero l'area occupata dai nuclei o dai capillari, dai pixel o dall'area totale da analizzare. Inoltre, quando si esegue l'analisi FFT, è necessario verificare che il segnale mitocondriale sia dritto. Al contrario, quando il segnale mitocondriale è inclinato, può produrre profili che non rappresentano la distribuzione longitudinale mitocondriale, producendo dati errati sullo spettro FFT. Inoltre, è possibile applicare una fase di pre-elaborazione per ridurre il rumore nelle immagini. Questo protocollo descrive due fasi di pre-elaborazione facoltative utilizzando un filtro mediano e la deconvoluzione 2D. Gli effetti di questi metodi di pre-elaborazione sull'immagine e sul contenuto di densità mitocondriale sono presentati nella Figura supplementare S1. È importante considerare che, sebbene queste pre-elaborazioni possano migliorare la qualità dell'immagine, possono anche comportare la perdita di alcuni dettagli dell'immagine. Pertanto, devono essere utilizzati con cautela e applicati in modo coerente a tutte le immagini analizzate.

Nonostante i suoi vantaggi, la microscopia confocale è limitata da una risoluzione laterale (XY) di 180-250 nm quando si verificano le condizioni ottimali per l'acquisizione³². Il diametro mitocondriale è ~200-700 nm, vicino al limite di diffrazione della microscopia confocale; pertanto, le strutture sub-mitocondriali non possono essere adeguatamente rilevate³³ e non possono essere valutate mediante analisi di densità e FFT mostrate in questo protocollo. Altre tecniche di microscopia a super-risoluzione, come la microscopia stocastica a ricostruzione ottica (STORM), la nanoscopia a deplezione di emissione stimolata (STED) o la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), possono essere esplorate per risolvere le strutture sub-mitocondriali³². In questo protocollo, le immagini confocali dei mitocondri sono ottenute utilizzando il fluoroforo TMRE, che dipende dal potenziale di membrana mitocondriale. Pertanto, l'intensità della fluorescenza mitocondriale può variare in base al loro potenziale di membrana. Prima dell'analisi dei dati viene eseguito un processo di soglia per superare questo problema. Tutti i pixel al di sopra di una soglia definita sono considerati positivi per il segnale mitocondriale indipendentemente dal loro valore di fluorescenza. Tuttavia, va notato che i mitocondri con un potenziale di membrana molto basso non possono essere risolti con questa tecnica. Pertanto, si raccomandano studi complementari sulla quantificazione del contenuto proteico mitocondriale. Un vantaggio dell'utilizzo di TMRE è che le immagini confocali possono essere utilizzate anche per l'analisi del potenziale di membrana mitocondriale, ma è necessario eseguire controlli adeguati con agenti di disaccoppiamento come il carbonilcianuro-p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP). Inoltre, le istruzioni per l'analisi della densità e della distribuzione mitocondriale possono essere ottenute utilizzando indicatori fluorescenti verdi per i mitocondri, che caricano i mitocondri indipendentemente dal loro potenziale di membrana, ma la strategia di incubazione e le impostazioni di acquisizione confocale devono essere standardizzate.

Dato che la struttura dei mitocondri è correlata a funzioni mitocondriali e cellulari essenziali, il protocollo qui descritto può fornire preziose informazioni sul loro rimodellamento durante la malattia o da un particolare insulto da stress. Potrebbe contribuire a una migliore comprensione delle funzioni chiave del muscolo scheletrico governato dai mitocondri, come la produzione di energia, o in cui i mitocondri svolgono un ruolo importante nell'interazione con altri organelli, come l'accoppiamento contrazione-metabolismo. Seguire le istruzioni del protocollo consente di stimare la densità e la distribuzione mitocondriale nel muscolo scheletrico vivo. Le fasi del protocollo sono suddivise in tre fasi principali incentrate sulla dissezione del fascio muscolare scheletrico, sulla scansione al microscopio confocale e sull'analisi delle immagini, in cui sono incluse istruzioni dettagliate e considerazioni importanti. In particolare, il protocollo può essere ulteriormente ottimizzato per esplorare ulteriori passaggi Z per la ricostruzione mitocondriale completa all'interno della fibra in base alle esigenze dell'utente. Ad esempio, l'immagine confocale e le fasi di analisi possono essere testate per studiare strutture cellulari con distribuzione simile, come la TT in campioni vivi e fissi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A6419
Borosilicate glass coverslip	Warner Instruments	64-0709
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670
Confocal microscope	Leica	TCS SP5
Confocal microscope software Leica Application Suite	Leica	2.7.3.9723
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	C3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)	Biomedical Imaging Group, EPFL	http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate	Sigma-Aldrich	11240
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E4378
Forceps	Miltex	MH-18
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective	Leica	506517
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Iris scissors	Miltex	5-304
L-(-)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M7397
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G1626
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
Maxchelator	UC Davis Health	https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm
Micro scissors	Miltex	18-1633
Open-source platform for biological-image analysis Fiji	Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji	https://fiji.sc/
Phosphocreatine disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	P7936
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
PSF Generator (PSF_Generator.jar)	Biomedical Imaging Group, EPFL	http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/
Recording chamber	Warner Instruments	RC-27N
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spreadsheet Microsoft Excel	Microsoft
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 508
Tetramethylrhodamine, ethyl ester	Invitrogen	T669