Normothermic ex vivo liver machine perfusión en ratón

Resumen

Se creó un sistema normotérmico de perfusión hepática ex vivo (NEVLP) para hígados de ratón. Este sistema requiere experiencia en microcirugía, pero permite resultados de perfusión reproducibles. La capacidad de utilizar hígados de ratón facilita la investigación de vías moleculares para identificar nuevos aditivos de perfusión y permite la ejecución de experimentos centrados en la reparación de órganos.

Resumen

Este protocolo presenta un sistema NEVLP optimizado libre de eritrocitos utilizando hígados de ratón. La preservación ex vivo de hígados de ratón se logró mediante el empleo de cánulas modificadas y técnicas adaptadas de equipos comerciales convencionales de perfusión ex vivo . El sistema se utilizó para evaluar los resultados de preservación después de 12 h de perfusión. Los ratones C57BL / 6J sirvieron como donantes de hígado, y los hígados fueron explantados canulando la vena porta (PV) y el conducto biliar (BD), y posteriormente enjuagando el órgano con solución salina heparinizada tibia (37 ° C). Luego, los hígados explantados se transfirieron a la cámara de perfusión y se sometieron a perfusión normotérmica oxigenada de máquina (NEVLP). Las muestras de perfusión de entrada y salida se recogieron a intervalos de 3 h para el análisis de perfusión. Al finalizar la perfusión, se obtuvieron muestras de hígado para el análisis histológico, con integridad morfológica evaluada mediante Suzuki-Score modificado a través de tinción de Hematoxilina-Eosina (HE). Los experimentos de optimización arrojaron los siguientes hallazgos: (1) los ratones que pesaban más de 30 g se consideraron más adecuados para el experimento debido al mayor tamaño de su conducto biliar (BD). (2) una cánula de poliuretano de 2 Fr (diámetro exterior = 0,66 mm) fue más adecuada para canular la vena porta (PV) en comparación con una cánula de polipropileno. Esto se atribuyó al agarre mejorado del material de poliuretano, lo que resultó en un deslizamiento reducido del catéter durante la transferencia del cuerpo a la cámara del órgano. (3) para la canulación del conducto biliar (BD), se encontró que una cánula de poliuretano de 1 Fr (diámetro exterior = 0,33 mm) era más efectiva en comparación con la cánula de polipropileno UT - 03 (diámetro exterior = 0,30 mm). Con este protocolo optimizado, los hígados de ratón se conservaron con éxito durante 12 h sin un impacto significativo en la estructura histológica. La tinción de hematoxilina-eosina (HE) reveló una arquitectura morfológica bien conservada del hígado, caracterizada por hepatocitos predominantemente viables con núcleos claramente visibles y dilatación leve de sinusoides hepáticos.

Introducción

El trasplante de hígado representa el tratamiento estándar de oro para las personas con enfermedad hepática terminal. Lamentablemente, la demanda de órganos de donantes supera la oferta disponible, lo que lleva a una escasez significativa. En 2021, aproximadamente 24,936 pacientes estaban en la lista de espera para un injerto de hígado, mientras que solo 9,234 trasplantes se realizaron con éxito¹. La disparidad significativa entre la oferta y la demanda de injertos hepáticos destaca la necesidad apremiante de investigar estrategias alternativas para ampliar el grupo de donantes y mejorar la accesibilidad de los injertos hepáticos. Una forma de ampliar el grupo de donantes es utilizar donantes marginales². Los donantes marginales incluyen aquellos con edad avanzada, esteatosis moderada o grave. Aunque el trasplante de órganos marginales puede producir resultados favorables, los resultados generales siguen siendo subóptimos. Como resultado, el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas a mejorar la función de los donantes marginales está actualmente en marcha ^3,4.

Una de las estrategias es utilizar la máquina de perfusión, especialmente la perfusión normotérmica oxigenada de máquina, para mejorar la función de estos órganos marginales⁵. Sin embargo, todavía hay una comprensión limitada de los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos beneficiosos de la perfusión normotérmica oxigenada de la máquina (NEVLP). Los ratones, con su abundante disponibilidad de cepas modificadas genéticamente, sirven como modelos valiosos para investigar las vías moleculares. Por ejemplo, la importancia de las vías de autofagia en la mitigación de la lesión por isquemia-reperfusión hepática ha sido cada vez más reconocida ^6,7. Una vía molecular importante en la lesión por isquemia-reperfusión hepática es la vía miR-20b-5p/ATG7⁸. Actualmente, hay una serie de cepas de ratón knockout ATG y knock-out condicional disponibles, pero no hay cepas de rata correspondientes⁹.

Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo era generar una plataforma NEVLP miniaturizada para injertos hepáticos de ratón. Esta plataforma facilitaría la exploración y evaluación de posibles estrategias modificadas genéticamente destinadas a mejorar la funcionalidad del hígado del donante. Además, era esencial que el sistema fuera adecuado para la perfusión a largo plazo, permitiendo el tratamiento ex vivo del hígado, comúnmente conocido como "reparación de órganos".

Teniendo en cuenta la disponibilidad limitada de datos in vitro relevantes sobre la perfusión hepática en ratones, la revisión de la literatura se centró en estudios realizados en ratas. Se realizó una búsqueda sistemática de literatura que abarca de 2010 a 2022 utilizando palabras clave como "perfusión hepática normotérmica", "ex vivo o in vitro" y "ratas". Esta búsqueda tuvo como objetivo identificar las condiciones óptimas en roedores, lo que nos permitió determinar el enfoque más adecuado.

El sistema de perfusión consiste en un depósito amortiguador de vidrio sellado con camisa de agua, una bomba de rodillos peristáltica, un oxigenador, una trampa de burbujas, un intercambiador de calor, una cámara de órganos y un sistema de tubos de ciclo cerrado (Figura 1). El sistema garantiza un mantenimiento preciso de una temperatura de perfusión constante de 37 °C utilizando una máquina termostática dedicada. La bomba de rodillos peristálticos impulsa el flujo del perfusión en todo el circuito. El circuito de perfusión se inicia en el depósito aislado con camisa de agua. Posteriormente, el perfusato se dirige a través del oxigenador, que recibe una mezcla de gases de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono de una botella de gas dedicada. Después de la oxigenación, el perfusato pasa a través de la trampa de burbujas, en la que cualquier burbuja atrapada es redirigida de nuevo al depósito por la bomba peristáltica. El perfusión restante fluye a través del intercambiador de calor y entra en la cámara del órgano, desde donde regresa al depósito.

Aquí, informamos nuestras experiencias estableciendo un NEVLP para hígados de ratón y compartimos los resultados prometedores de un experimento piloto realizado utilizando el medio oxigenado sin portadores de oxígeno.

Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones y directrices alemanas actuales para el bienestar animal y las directrices ARRIVE para la presentación de informes de investigación con animales. El protocolo de experimentación animal fue aprobado por el Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turingia, Alemania (Número de aprobación: UKJ - 17 - 106).

NOTA: Se utilizaron ratones machos C57BL/6J con un peso de 34 ± 4 g (media ± error estándar de la media [SEM]) como donantes de hígado. Se mantuvieron en condiciones ambientales controladas (50% de humedad y 18 - 23 ° C) con acceso gratuito a comida de ratón estándar y agua. Durante todo el procedimiento quirúrgico, se mantuvo una frecuencia respiratoria superior a 60 respiraciones/min y la temperatura corporal se mantuvo por encima de 34 °C.

1. Preparación

1. Configuración de la tabla de operaciones
   1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y consumibles para fines de esterilización.
   2. Encienda todos los equipos, incluida la tabla de calentamiento y la electrocoagulación.
   3. Introducir una jeringa de 50 ml con 25 ml de solución salina heparinizada (2.500 U/L) en una incubadora tibia (37 °C).
   4. Coloque los instrumentos quirúrgicos, la sutura de seda 6 - 0, el aplicador de algodón pequeño estéril, la solución salina veterinaria (500 ml) y las esponjas de gasa no tejida (10 cm x 10 cm) en la mesa de operaciones apropiadamente.
   5. Coloque una aguja de 26 G en la mesa de operaciones para crear un pequeño orificio en la tapa del tubo de microcentrífuga de 0,5 ml para recibir el tubo biliar para la recolección de bilis.
   6. Coloque la cánula (cánula de poliuretano 1 Fr o cánula de polietileno UT - 03) y un tubo de microcentrífuga esterilizado de 0,5 ml para la recolección de bilis en la mesa de operaciones.
2. Cánula de vena porta hecha a sí misma
   1. Sujete la cánula 2 Fr con fórceps y perfore la pared con una aguja de 30 G a una distancia de 1 cm del extremo de la cánula. Empuje la aguja a través de la cánula hasta que la punta de la aguja se haga visible.
   2. Recorte la punta de la cánula dando como resultado un triángulo afilado.
3. Preparación de solución salina heparinizada
   1. Preparar 25 mL de solución salina heparinizada con una concentración final de 2.500 UI/mL.
   2. Retire todas las burbujas de aire y coloque la jeringa en la incubadora a 40 °C.
4. Demostración del sistema de perfusión
   1. Consulte la Figura 1 para conocer los componentes principales del sistema de perfusión de la máquina.
5. Configuración de la cámara del órgano
   1. Consulte la figura 2 para el diseño de la cámara del órgano.
6. Configuración del sistema de perfusión
   1. Active el programa de gráficos de laboratorio para el monitoreo de la presión.
   2. Conecte el calibrador de presión y el sensor de presión a nivel de la cámara del órgano.
   3. Ajuste el calibrador de presión para que lea 0 mmHg y compruebe el valor correspondiente en el software de control de presión.
   4. Ajuste el calibrador de presión para que lea 20 mmHg y vuelva a comprobar el valor correspondiente en el software de control de presión.
   5. Encienda el baño maría y precaliente la cámara del órgano a 40 °C.
   6. Enjuague todo el sistema de plomería dos veces con agua desionizada destilada durante 30 minutos cada una, asegurando la eliminación completa de la solución desinfectante.
   7. Inicie la circulación de la solución desinfectante en todo el sistema durante una duración de 20 minutos para garantizar una desinfección completa.
   8. Encienda la mezcla de gases (95% de oxígeno (_O2) y 5% de dióxido de carbono (CO₂).
7. Relleno de perfusión
   1. Complementar 250 ml de medio E de Williams con 50 ml de suero bovino fetal, 3 ml de penicilina/estreptomicina (1 mg/ml), 0,17 ml de insulina (100 IE/ml), 0,34 ml de heparina (5000 U/ml) y 0,07 ml de hidrocortisona (100 mg/2 ml) para preparar el medio E de Williams completo.
   2. Agregue volúmenes iguales (150 ml) de perfusión al depósito y a la cámara del órgano para cebar el sistema.
      NOTA: Se debe prestar especial atención a mantener la esterilidad durante el proceso de llenado. El perfusato se bombea constantemente a través de estos dos componentes clave de la máquina de recirculación cerrada de perfusión.
   3. Encienda la bomba peristáltica a velocidad media (15 ml/min) para cebar el sistema de perfusión con el medio oxigenado.

2. Explantación hepática

1. Preparación preoperatoria
   1. Pesa al animal. Preparar el analgésico buprenorfina (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg peso vivo).
   2. Conecte la cámara de inducción con la toma de corriente. Girar el oxígeno a 0,5 L/min. Convertir el isoflurano al 3%.
   3. Coloque al animal en la cámara hasta que se alcance la anestesia profunda (reflejo de enderezamiento positivo).
   4. Use una micro jeringa para aplicar una dosis de analgesia adaptada al peso corporal por vía subcutánea.
   5. Use una afeitadora eléctrica para recortar el pelaje de la piel abdominal.
   6. Transfiera el ratón a la mesa de operaciones y encienda el vaporizador de isoflurano al 2,5% para mantener la anestesia. Confirme la profundidad de la anestesia probando el reflejo interdigital del dedo del pie.
2. Preparación del abdomen del ratón.
   1. Coloque el ratón en posición supina.
   2. Prueba del reflejo interdigital para confirmar dos veces la profundidad apropiada de la anestesia. Fije las cuatro extremidades con cinta adhesiva.
   3. Desinfecte ambos lados del abdomen hasta la línea axilar media usando tres rondas consecutivas de yodo-alcohol. Use una gasa esterilizada no tejida para cubrir el área alrededor del campo quirúrgico.
   4. Haga una incisión transversal de 3 cm 1 cm por debajo de la xifoidea en el área abdominal del ratón con tijeras para bebés Metzenbaum y fórceps quirúrgicos.
   5. Extienda la incisión de la piel bilateralmente a la línea medioaxilar en ambos lados.
   6. Haga con cuidado una incisión longitudinal de 2 cm a lo largo de la línea alba con tijeras de resorte.
   7. Corte a través de la capa muscular abdominal con electrocoagulación y tijeras de resorte Vannas.
   8. Coloque cuidadosamente un trozo de gasa húmeda para proteger el hígado de la electrocoagulación.
   9. Use una sutura de seda 6 - 0 con la aguja redonda para retraer el proceso xifoide para una mejor exposición del ligamento coronario.
   10. Use dos retractores de costillas para exponer completamente la cavidad abdominal del ratón.
   11. Mueva cuidadosamente el intestino delgado fuera de la cavidad abdominal con un hisopo de algodón húmedo para exponer completamente el hilio.
3. Preparación del colédoco
   1. Transecto de los ligamentos falciforme, frénico y gastrohepático con tijeras afiladas.
   2. Libere cuidadosamente el conducto biliar común con pinzas curvas finas sin dientes.
      NOTA: El conducto biliar común se daña muy fácilmente y se rompe. Una vez que se rompe, no se puede canular. Debido a la dirección de la posición anatómica, es mejor usar pinzas curvas.
   3. Coloque dos bucles de sutura de seda 6 a 0 sobre el conducto biliar común en preparación para el siguiente paso.
4. Canulación del colédoco
   1. Perfore cuidadosamente el conducto biliar con una aguja de 30 G. Use pinzas curvas puntiagudas para agrandar el orificio pequeño y ajustarlo a la canulación del conducto biliar.
   2. Use pinzas de canulación de vasos para agarrar la cánula del conducto biliar y empujarla hacia el conducto biliar.
   3. Asegure dos veces la cánula con los bucles de sutura preestablecidos 6 - 0.
      NOTA: Durante la canulación se siente resistencia por bilis. Si la fuerza no está bien controlada, la cánula será empujada fuera del tracto biliar por la presión del flujo de salida de bilis. Ajuste cuidadosamente la profundidad de la cánula. Si es demasiado profundo, puede dañar el conducto biliar, y si no es lo suficientemente profundo, puede salirse.
   4. Observe el flujo de bilis en la cánula después de una canulación exitosa.
5. Preparación de la vena porta
   1. Sujete la vena porta con fórceps planos y libere cuidadosamente el tejido conectivo con fórceps curvos. No tire con fuerza para evitar causar desgarro de la vena porta. Una vez que la vena porta está dañada, es difícil volver a canular la vena porta.
   2. Diseccionar el PV justo superior a la bifurcación y colocar el primer asa de sutura usando una sutura de seda 6 - 0 en PV cerca de la confluencia para su uso posterior.
   3. Coloque el segundo asa de sutura para la fijación posterior de la PV lo más cerca posible del hilio hepático.
6. Canulación de la vena porta
   1. Use un clip arterial para cerrar la vena porta distal.
   2. Con mucho cuidado, perfore la vena porta con una de las cánulas de la vena porta anteriores. El flujo sanguíneo se puede observar claramente dentro de la cánula después de una punción exitosa.
   3. Asegure la cánula PV con el asa de sutura 6 - 0 precolocada.
7. Enrojecimiento del hígado
   1. Aumentar el isoflurano al 5% y sacrificar al ratón con una sobredosis de inhalación de isoflurano.
   2. Tome la solución salina de heparina precalentada de la incubadora. Retire todas las burbujas de aire formadas dentro de la solución salina heparinizada.
   3. Fije la jeringa con solución salina heparinizada precalentada en la bomba de la jeringa.
   4. Conecte el tubo de extensión de la bomba de la jeringa a la cánula de la vena porta, ajuste la velocidad a 2 ml / min y comience el lavado del hígado.
   5. Observe el color del hígado al final del procedimiento de lavado. Extirpe el hígado una vez que el color se vuelva amarillo homogéneo.
   6. Transección del diafragma, vena cava inferior suprahepática, vena cava infrahepática, arteria hepática, vena porta distal y cualquier tejido conectivo restante.
   7. Coloque el hígado en la placa de Petri.

3. Conexión hepática y de cámara

1. Transferencia hepática
   1. Transfiera cuidadosamente el hígado a la cámara del órgano con una placa de Petri.
   2. Mantenga una pequeña cantidad de solución salina en la placa de Petri para evitar que el hígado se seque.
      NOTA: La vena porta y el conducto biliar se pueden torcer fácilmente durante este procedimiento, lo que puede afectar la perfusión hepática y la recolección de bilis.
2. Conexión de cánula de la vena porta
   1. Infunda lentamente solución salina normal en la cánula de la vena porta con una jeringa para evacuar las burbujas de aire en la cánula.
   2. Conecte la cánula de la vena porta en el tubo de salida de perfusión en la cámara del órgano.
3. Conexión de la cánula del conducto biliar
   1. Guiar la cánula del conducto biliar del ratón a través de la válvula de una tapa de goma que está conectada a la cámara del órgano.
   2. Inserte la cánula del conducto biliar en un microtubo de 0,5 ml preparado previamente con un pequeño orificio en la tapa.
   3. Coloque el microtubo sobre arcilla fuera de la cámara del órgano.

4. Ajuste el caudal según la presión fotovoltaica

1. Encienda la bomba peristáltica a partir de 1 ml/min.
2. Compruebe la lectura de la presión de la vena porta para ajustar el caudal.
3. Mantenga la presión de la vena porta en el rango fisiológico entre 7 - 10 mmHg ajustando el caudal.
   NOTA: El caudal nominal puede variar ligeramente dependiendo del uso y posicionamiento de los tubos.

5. Recogida de muestras

1. Obtenga muestras de perfusión de entrada del tubo de entrada de la vena porta y muestras de perfusión de salida de la cámara del órgano en intervalos de 3 horas.
2. Recoger muestras de todos los lóbulos hepáticos para su análisis histológico al final del período de perfusión de 12 h.

Resultados

Establecimiento del procedimiento quirúrgico
Se utilizaron un total de 17 animales para este experimento: 14 ratones se emplearon para optimizar el proceso de obtención de órganos, incluida la canulación de la vena porta (PV) y el conducto biliar (BD), mientras que se utilizaron 3 ratones para validar el procedimiento (Tabla 1). Los resultados histológicos (Figura 3) se compararon para facilitar la identificación de la condición óptima de perfusi?...

Discusión

Pasos críticos en el protocolo
Los dos pasos cruciales en la explantación hepática son la canulación de la vena porta (PV) y la posterior canulación del conducto biliar (BD). Estos pasos son de suma importancia para garantizar el éxito de la recuperación de órganos y los procedimientos posteriores de perfusión o trasplante.

Desafíos y soluciones
La canulación PV presenta tres desafíos: lesión de la pared del vaso, desplazamiento del catéter...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 ml Micro Tube PP	Sarstedt	72699
1 Fr Rubber Cannula	Vygon	Sample Cannula
10 µL Micro Syringe	Hamilton	701N
2 Fr Rubber Cannula	Vygon	Sample Cannula
24 G Butterfly Cannula	Terumo	SR+OF2419
26 G Butterfly Cannula	Terumo	SR+DU2619WX
30 G Hypodermic Needle	Sterican	100246
50 ml Syringe Pump	Braun	110356
6-0 Perma-Hand Seide	Ethicon	639H
Arterial Clip	Braun	BH014R
Autoclavable Moist Chamber	Hugo Sachs Elektronik	73-4733
Big Cotton Applicator	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974018
Bubble Trap	Hugo-Sachs-Elektronik	V83163
Buprenovet (0.3 mg / ml)	Elanco	/
CIDEX OPA solution (2 L)	Cilag GmbH	20391
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C	ERBE	/
Fetal Bovine Serum(500 ml)	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide)	House Supply	/
Heating Circulating Baths	Harvard-Apparatus	75-0310
Heparin 5000 (I.E. /5 ml)	Braun	1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)	Pfizer	15427276
Insulin(100 IE / ml)	Sigma	I0516-5ML
Iris Scissors	Fine Science Instruments	15000-03
Isofluran (250 ml)	Cp-Pharma	1214
Membrane Oxygenator	Hugo Sachs Elektronik	T18728
Microsurgery Microscope	Leica	M60
Mouse Retractor Set	Carfil Quality	180000056
NanoZoomer 2.0 HT	Hamamatsu	/
Non-Woven Sponges	Kompressen	866110
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)	C.C.Pro	Z-13-M
Perfusion Extension Tube (30 cm)	Braun	4256000
Peristaltic Pump	Harvard-Apparatus	P-70
Petri Dishc 100x15 mm	VWR®	391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)	Livisto	799-416
Pressure Transducer Simulator	UTAH Medical Products	650-950
Reusable Blood Pressure Transducers	AD Instruments	MLT-0380/D
S & T Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Instruments	00608-11
Small Cotton Applicator	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974116
Straight Forceps 10 cm	Fine Science Instruments	00632-11
Suture Tying Forceps	Fine Science Instruments	11063-07
Syringe 50ml Original Perfusor	Braun	8728810F-06
UT - 03 Cannula	Unique Medical, Japan	/
Vannas Spring Scissors	Fine Science Instruments	15018-10
Veterinary Saline (500 ml)	WDT	18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 L	Harvard-Apparatus	73-3441
William's E Medium (500 ML)	Thermofischer Scientific	A1217601