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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Für die Leber von Mäusen wurde ein normothermisches ex vivo Leberperfusionssystem (NEVLP) entwickelt. Dieses System erfordert Erfahrung in der Mikrochirurgie, ermöglicht aber reproduzierbare Perfusionsergebnisse. Die Möglichkeit, Mäuselebern zu verwenden, erleichtert die Untersuchung molekularer Signalwege zur Identifizierung neuartiger Perfusat-Additive und ermöglicht die Durchführung von Experimenten, die sich auf die Reparatur von Organen konzentrieren.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein optimiertes erythrozytenfreies NEVLP-System unter Verwendung von Mauslebern dar. Die Ex-vivo-Konservierung von Mäuselebern wurde durch den Einsatz modifizierter Kanülen und Techniken erreicht, die von konventionellen kommerziellen Ex-vivo-Perfusionsgeräten übernommen wurden. Das System wurde verwendet, um die Konservierungsergebnisse nach 12 h Perfusion zu bewerten. C57BL/6J-Mäuse dienten als Leberspender, und die Lebern wurden explantiert, indem die Pfortader (PV) und der Gallengang (BD) kanüliert und das Organ anschließend mit warmer (37 °C) heparinisierter Kochsalzlösung gespült wurde. Anschließend wurden die explantierten Lebern in die Perfusionskammer überführt und einer normothermen oxygenierten maschinellen Perfusion (NEVLP) unterzogen. Die Einlass- und Auslassproben des Perfusats wurden in Abständen von 3 Stunden zur Perfusatanalyse entnommen. Nach Abschluss der Perfusion wurden Leberproben zur histologischen Analyse entnommen, wobei die morphologische Integrität mittels modifiziertem Suzuki-Score durch Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung beurteilt wurde. Die Optimierungsexperimente ergaben folgende Ergebnisse: (1) Mäuse mit einem Gewicht von über 30 g wurden aufgrund der größeren Größe ihres Gallengangs (BD) als besser geeignet für das Experiment erachtet. (2) Eine 2 Fr (Außendurchmesser = 0,66 mm) Polyurethankanüle war im Vergleich zu einer Polypropylenkanüle besser für die Kanülierung der Pfortader (PV) geeignet. Dies wurde auf die verbesserte Griffigkeit des Polyurethanmaterials zurückgeführt, die zu einem geringeren Katheterschlupf während des Transfers vom Körper in die Organkammer führte. (3) Für die Kanülierung des Gallengangs (BD) erwies sich eine 1 Fr (Außendurchmesser = 0,33 mm) Polyurethankanüle als wirksamer als die Polypropylenkanüle UT - 03 (Außendurchmesser = 0,30 mm). Mit diesem optimierten Protokoll konnten Mauslebern erfolgreich für eine Dauer von 12 Stunden konserviert werden, ohne dass die histologische Struktur signifikant beeinflusst wurde. Die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung ergab eine gut erhaltene morphologische Architektur der Leber, die durch überwiegend lebensfähige Hepatozyten mit deutlich sichtbaren Zellkernen und eine leichte Dilatation der hepatischen Sinusoide gekennzeichnet ist.

Einleitung

Die Lebertransplantation stellt den Goldstandard für die Behandlung von Personen mit Lebererkrankungen im Endstadium dar. Bedauerlicherweise übersteigt die Nachfrage nach Spenderorganen das verfügbare Angebot, was zu einer erheblichen Verknappung führt. Im Jahr 2021 standen etwa 24.936 Patienten auf der Warteliste für ein Lebertransplantat, während nur 9.234 Transplantationen erfolgreich durchgeführt wurden1. Die erhebliche Diskrepanz zwischen Angebot und Nachfrage nach Lebertransplantaten unterstreicht die dringende Notwendigkeit, alternative Strategien zur Erweiterung des Spenderpools und zur Verbesserung der Zugänglichkeit von Lebertransplantaten zu untersuchen. Eine Möglichkeit, den Spenderpool zu erweitern, ist der Einsatz von marginalen Spendern2. Zu den marginalen Spendern gehören Personen mit fortgeschrittenem, mittelschwerer oder schwerer Steatose. Obwohl die Transplantation von marginalen Organen zu günstigen Ergebnissen führen kann, bleiben die Gesamtergebnisse suboptimal. Daher ist derzeit die Entwicklung therapeutischer Strategien im Gange, die darauf abzielen, die Funktion marginaler Spender zu verbessern 3,4.

Eine der Strategien besteht darin, die maschinelle Perfusion, insbesondere die normotherme sauerstoffhaltige maschinelle Perfusion, zu nutzen, um die Funktion dieser marginalen Organe zu verbessern5. Es gibt jedoch noch ein begrenztes Verständnis der molekularen Mechanismen, die den positiven Effekten der normothermen oxygenierten maschinellen Perfusion (NEVLP) zugrunde liegen. Mäuse mit ihrer reichlichen Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Stämmen dienen als wertvolle Modelle für die Untersuchung molekularer Signalwege. So wurde beispielsweise die Bedeutung von Autophagie-Signalwegen bei der Linderung von Leberischämie-Reperfusionsschäden zunehmend anerkannt 6,7. Ein wichtiger molekularer Signalweg bei der hepatischen Ischämie-Reperfusions-Schädigung ist der miR-20b-5p/ATG7-Signalweg8. Derzeit gibt es eine Reihe von ATG-Knockout- und bedingten Knockout-Mausstämmen, aber keine entsprechenden Rattenstämme9.

Vor diesem Hintergrund war es das Ziel, eine miniaturisierte NEVLP-Plattform für Lebertransplantate von Mäusen zu generieren. Diese Plattform würde die Erforschung und Bewertung potenzieller genetisch veränderter Strategien zur Verbesserung der Funktionalität der Leber des Spenders erleichtern. Darüber hinaus war es wichtig, dass das System für eine langfristige Perfusion geeignet ist, um die Ex-vivo-Behandlung der Leber zu ermöglichen, die gemeinhin als "Organreparatur" bezeichnet wird.

In Anbetracht der begrenzten Verfügbarkeit relevanter In-vitro-Daten zur Leberperfusion von Mäusen konzentrierte sich die Literaturrecherche auf Studien, die an Ratten durchgeführt wurden. Eine systematische Literaturrecherche aus den Jahren 2010 bis 2022 wurde anhand von Schlagworten wie "normotherme Leberperfusion", "ex vivo oder in vitro" und "Ratten" durchgeführt. Diese Suche zielte darauf ab, optimale Bedingungen für Nagetiere zu identifizieren, so dass wir den am besten geeigneten Ansatz bestimmen konnten.

Das Perfusionssystem besteht aus einem abgedichteten, wasserummantelten Glaspufferreservoir, einer peristaltischen Rollenpumpe, einem Oxygenator, einer Blasenfalle, einem Wärmetauscher, einer Orgelkammer und einem geschlossenen Schlauchsystem (Abbildung 1). Das System gewährleistet die präzise Aufrechterhaltung einer konstanten Perfusionstemperatur von 37 °C mit einer speziellen thermostatischen Maschine. Die peristaltische Rollenpumpe treibt den Durchfluss des Perfusats durch den gesamten Kreislauf. Der Perfusionskreislauf beginnt am isolierten, wasserummantelten Reservoir. Anschließend wird das Perfusat durch den Oxygenator geleitet, der aus einer speziellen Gasflasche ein Gasgemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid erhält. Nach der Sauerstoffanreicherung durchläuft das Perfusat die Blasenfalle, in der alle eingeschlossenen Blasen von der Peristaltikpumpe zurück in das Reservoir geleitet werden. Das verbleibende Perfusat fließt durch den Wärmetauscher und gelangt in den Orgelraum, von wo aus es in den Vorratsbehälter zurückkehrt.

Hier berichten wir über unsere Erfahrungen bei der Etablierung eines NEVLP für Mauslebern und teilen die vielversprechenden Ergebnisse eines Pilotversuchs, das mit dem sauerstoffhaltigen Medium ohne Sauerstoffträger durchgeführt wurde.

Protokoll

Die Tierversuche wurden nach den aktuellen deutschen Vorschriften und Richtlinien für den Tierschutz und den ARRIVE-Richtlinien für die Berichterstattung über Tierversuche durchgeführt. Das Tierversuchsprotokoll wurde vom Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Deutschland genehmigt (Zulassungsnummer: UKJ - 17 - 106).

HINWEIS: Als Leberspender wurden männliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 34 ± 4 g (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts [REM]) verwendet. Sie wurden unter kontrollierten Umgebungsbedingungen (50 % Luftfeuchtigkeit und 18 - 23 °C) mit freiem Zugang zu Standard-Mäusefutter und Wasser gehalten. Während des gesamten chirurgischen Eingriffs wurde eine Atemfrequenz von mehr als 60 Atemzügen/min aufrechterhalten und die Körpertemperatur über 34 °C gehalten.

1. Vorbereitung

  1. Einrichten des Operationstisches
    1. Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Verbrauchsmaterialien zu Sterilisationszwecken.
    2. Schalten Sie alle Geräte ein, einschließlich des Wärmebretts und der Elektrokoagulation.
    3. Eine 50-ml-Spritze mit 25 ml heparinisierter Kochsalzlösung (2.500 U/L) in einen warmen Inkubator (37 °C) geben.
    4. Legen Sie die chirurgischen Instrumente, das 6 - 0 Seidennahtmaterial, den sterilen kleinen Baumwollapplikator, die Veterinärkochsalzlösung (500 ml) und die Vliesmullschwämme (10 cm x 10 cm) entsprechend auf den Operationstisch.
    5. Legen Sie eine 26-g-Nadel auf den Operationstisch, um ein kleines Loch in den Deckel des 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens zu bohren, um das Gallenröhrchen zur Gallenentnahme aufzunehmen.
    6. Legen Sie die Kanüle (1 Fr Polyurethankanüle oder UT - 03 Polyethylenkanüle) und ein sterilisiertes 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zur Gallenentnahme auf den Operationstisch.
  2. Selbstgebaute Pfortaderkanüle
    1. Halten Sie die 2-Fr-Kanüle mit einer Pinzette fest und stechen Sie die Wand mit einer 30-G-Nadel in einem Abstand von 1 cm vom Ende der Kanüle ein. Schieben Sie die Nadel durch die Kanüle, bis die Nadelspitze sichtbar wird.
    2. Schneiden Sie die Spitze der Kanüle ab, sodass ein scharfes Dreieck entsteht.
  3. Herstellung von heparinisierter Kochsalzlösung
    1. Bereiten Sie 25 ml heparinisierte Kochsalzlösung mit einer Endkonzentration von 2.500 IU/ml vor.
    2. Entfernen Sie alle Luftblasen und legen Sie die Spritze in den 40 °C-Inkubator.
  4. Demonstration des Perfusionssystems
    1. In Abbildung 1 sind die Hauptkomponenten des maschinellen Perfusionssystems aufgeführt.
  5. Aufbau des Orgelraums
    1. Siehe Abbildung 2 für den Grundriss des Orgelraums.
  6. Aufbau des Perfusionssystems
    1. Schalten Sie das Lab-Chart-Programm für die Drucküberwachung ein.
    2. Verbinden Sie den Druckkalibrator und den Drucksensor auf der Ebene des Orgelraums.
    3. Stellen Sie den Druckkalibrator so ein, dass er 0 mmHg anzeigt, und überprüfen Sie den entsprechenden Wert in der Druckregelungssoftware.
    4. Stellen Sie den Druckkalibrator auf 20 mmHg ein und überprüfen Sie den entsprechenden Wert erneut in der Druckregelungssoftware.
    5. Schalten Sie das Wasserbad ein und wärmen Sie den Orgelraum auf 40 °C vor.
    6. Spülen Sie das gesamte Sanitärsystem zweimal 30 Minuten lang mit destilliertem deionisiertem Wasser, um sicherzustellen, dass die Desinfektionslösung vollständig entfernt wird.
    7. Initiieren Sie die Zirkulation der Desinfektionslösung im gesamten System für eine Dauer von 20 Minuten, um eine gründliche Desinfektion zu gewährleisten.
    8. Schalten Sie das Gasgemisch (95 % Sauerstoff (O2) und 5 % Kohlendioxid (CO2) ein.
  7. Perfusat-Füllung
    1. Ergänzen Sie 250 ml E-Medium von Williams mit 50 ml fötalem Kälberserum, 3 ml Penicillin/Streptomycin (1 mg/ml), 0,17 ml Insulin (100 IE/ml), 0,34 ml Heparin (5000 U/ml) und 0,07 ml Hydrocortison (100 mg/2 ml), um das vollständige E-Medium von Williams herzustellen.
    2. Geben Sie gleiche Volumina (150 ml) Perfusat in das Reservoir und die Orgelkammer, um das System vorzubereiten.
      HINWEIS: Besonderes Augenmerk muss auf die Aufrechterhaltung der Sterilität während des Füllvorgangs gelegt werden. Das Perfusat wird ständig durch diese beiden Schlüsselkomponenten der Perfusion der geschlossenen Umlaufmaschine gepumpt.
    3. Schalten Sie die Peristaltikpumpe bei mittlerer Geschwindigkeit (15 ml/min) ein, um das Perfusionssystem mit dem sauerstoffhaltigen Medium zu füllen.

2. Explantation der Leber

  1. Vorbereitung vor der Operation
    1. Wiegen Sie das Tier. Bereiten Sie das Analgetikum Buprenorphin (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg Körpergewicht) vor.
    2. Verbinden Sie die Induktionskammer mit der Steckdose. Drehen Sie den Sauerstoff auf 0,5 l/min. Verwandeln Sie Isofluran auf 3%.
    3. Legen Sie das Tier in die Kammer, bis eine tiefe Betäubung (Aufrichtungsreflex positiv) erreicht ist.
    4. Verwenden Sie eine Mikrospritze, um die an das Körpergewicht angepasste Dosis der Analgesie subkutan aufzutragen.
    5. Verwenden Sie einen Elektrorasierer, um das Fell auf der Bauchhaut zu trimmen.
    6. Legen Sie die Maus auf den Operationstisch und schalten Sie den Isofluran-Verdampfer auf 2,5 % ein, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Bestätigen Sie die Narkosetiefe, indem Sie den Zehenreflex zwischen den Zehen testen.
  2. Präparation des Mausabdomens
    1. Bringen Sie die Maus in Rückenlage.
    2. Testen Sie den Interdigitalreflex, um die entsprechende Narkosetiefe zu bestätigen. Fixiere alle vier Gliedmaßen mit Klebeband.
    3. Desinfizieren Sie beide Seiten des Bauches bis zur mittleren Achsellinie mit drei aufeinanderfolgenden Runden Jodalkohol. Verwenden Sie sterilisierte Vliesgaze, um den Bereich um das Operationsfeld herum abzudecken.
    4. Einen 3 cm langen Querschnitt 1 cm unterhalb des Xiphoid im Bauchbereich der Maus mit Metzenbaum Babyschere und OP-Zange machen.
    5. Verlängern Sie den Hautschnitt beidseitig beidseitig bis zur Mittelachsellinie.
    6. Machen Sie vorsichtig einen 2 cm langen Längsschnitt entlang der Linea alba mit einer Federschere.
    7. Durchtrennen Sie die Bauchmuskelschicht mit Elektrokoagulation und Vannas Federschere.
    8. Legen Sie vorsichtig ein Stück nasse Gaze auf, um die Leber vor Elektrokoagulation zu schützen.
    9. Verwenden Sie eine 6 - 0 Seidennaht mit der Rundnadel, um den Xiphoideusfortsatz zurückzuziehen, um das Koronarband besser freizulegen.
    10. Verwenden Sie zwei Rippenhalter, um die Bauchhöhle der Maus vollständig freizulegen.
    11. Bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig mit einem feuchten Wattestäbchen aus der Bauchhöhle, um den Hilus vollständig freizulegen.
  3. Präparation der gemeinsamen Gallengänge
    1. Durchtrennen Sie die falziformen, phrenen und gastrohepatischen Bänder mit einer scharfen Schere.
    2. Befreien Sie den gemeinsamen Gallengang vorsichtig mit einer fein gebogenen Pinzette ohne Zähne.
      HINWEIS: Der gemeinsame Gallengang wird sehr leicht beschädigt und bricht. Sobald es bricht, kann es nicht mehr kanüliert werden. Aufgrund der Richtung der anatomischen Position sind gebogene Pinzetten besser zu verwenden.
    3. Legen Sie zwei 6 - 0 Seidennahtschlaufen über den gemeinsamen Gallengang, um sich auf den nächsten Schritt vorzubereiten.
  4. Kanülierung des Gallengangs
    1. Stechen Sie den Gallengang vorsichtig mit einer 30-G-Nadel ein. Verwenden Sie eine spitze, gebogene Pinzette, um das kleine Loch so zu vergrößern, dass es in die Gallengangskanülierung passt.
    2. Fassen Sie die Gallengangskanüle mit einer Kanülenzange und schieben Sie sie in den Gallengang.
    3. Befestigen Sie die Kanüle doppelt mit den voreingestellten 6 - 0 Nahtschlaufen.
      HINWEIS: Während der Kanülierung ist ein Widerstand der Galle zu spüren. Wenn die Kraft nicht gut kontrolliert wird, wird die Kanüle durch den Druck des Gallenabflusses aus den Gallenwegen gedrückt. Stellen Sie die Tiefe der Kanüle vorsichtig ein. Wenn es zu tief ist, kann es den Gallengang beschädigen, und wenn es nicht tief genug ist, kann es herausrutschen.
    4. Beobachten Sie den Gallenfluss in der Kanüle nach erfolgreicher Kanülierung.
  5. Vorbereitung der Pfortader
    1. Klemmen Sie die Pfortader mit einer flachen Pinzette ab und befreien Sie vorsichtig das Bindegewebe mit einer gebogenen Pinzette. Ziehen Sie nicht zu stark, um einen Riss der Pfortader zu vermeiden. Sobald die Pfortader beschädigt ist, ist es schwierig, die Pfortader wieder zu kanulieren.
    2. Präparieren Sie die PV direkt über der Bifurkation und platzieren Sie die erste Nahtschlaufe mit 6 - 0 Seidennaht auf PV in der Nähe der Konfluenz für die spätere Verwendung.
    3. Platzieren Sie die zweite Nahtschlaufe zur späteren Fixierung des PV so nah wie möglich am Leberhilus.
  6. Pfortader-Kanülierung
    1. Verwenden Sie eine arterielle Klammer, um die distale Pfortader zu verschließen.
    2. Punktieren Sie die Pfortader sehr vorsichtig mit einer der oben genannten Pfortaderkanülen. Der Blutfluss innerhalb der Kanüle ist nach einer erfolgreichen Punktion deutlich zu beobachten.
    3. Befestigen Sie die PV-Kanüle mit der vorplatzierten 6 - 0 Nahtschlaufe.
  7. Leberspülung
    1. Erhöhen Sie den Isoflurangehalt auf 5 % und euthanasieren Sie die Maus mit einer Überdosis Isofluran-Inhalation.
    2. Nehmen Sie vorgewärmte Heparin-Kochsalzlösung aus dem Inkubator. Entfernen Sie alle Luftblasen, die sich in der heparinisierten Kochsalzlösung gebildet haben.
    3. Fixieren Sie die Spritze mit der vorgewärmten heparinisierten Kochsalzlösung in der Spritzenpumpe.
    4. Schließen Sie den Verlängerungsschlauch der Spritzenpumpe an die Kanüle der Pfortader an, stellen Sie die Geschwindigkeit auf 2 ml/min ein und starten Sie die Leberspülung.
    5. Beobachten Sie die Farbe der Leber am Ende des Spülvorgangs. Schneiden Sie die Leber heraus, sobald die Farbe ein homogenes Gelb annimmt.
    6. Durchtrennen Sie das Zwerchfell, die suprahepatische untere Hohlvene, die infrahepatische Hohlvene, die Leberarterie, die distale Pfortader und das verbleibende Bindegewebe.
    7. Legen Sie die Leber in die Petrischale.

3. Leber- und Kammerverbindung

  1. Leberübertragung
    1. Übertragen Sie die Leber vorsichtig mit einer Petrischale in die Organkammer.
    2. Bewahren Sie eine kleine Menge Kochsalzlösung in der Petrischale auf, um ein Austrocknen der Leber zu verhindern.
      HINWEIS: Pfortader und Gallengang können während dieses Eingriffs leicht verdreht werden, was die Leberdurchblutung und die Gallensammlung beeinträchtigen kann.
  2. Pfortaderkanülenverbindung
    1. Infundieren Sie mit einer Spritze langsam normale Kochsalzlösung in die Pfortaderkanüle, um die Luftblasen in der Kanüle zu entfernen.
    2. Verbinden Sie die Pfortaderkanüle mit dem Perfusat-Abflussschlauch in der Orgelkammer.
  3. Gallengang-Kanülenanschluss
    1. Führen Sie die Gallengangskanüle der Maus durch das Ventil einer Gummikappe, die mit der Organkammer verbunden ist.
    2. Führen Sie die Gallengangskanüle in ein vorbereitetes 0,5-ml-Mikroröhrchen mit einem kleinen Loch im Deckel ein.
    3. Legen Sie das Mikroröhrchen außerhalb des Orgelraums auf Ton.

4. Passen Sie die Durchflussmenge entsprechend dem PV-Druck an

  1. Schalten Sie die Peristaltikpumpe ab 1 ml/min ein.
  2. Überprüfen Sie den Pfortaderdruck, um die Durchflussrate anzupassen.
  3. Halten Sie den Pfortaderdruck im physiologischen Bereich zwischen 7 - 10 mmHg, indem Sie die Flussrate anpassen.
    Anmerkungen: Der Nenndurchfluss kann je nach Verwendung und Positionierung der Rohre leicht variieren.

5. Probenentnahme

  1. Entnahme von Einlass-Perfusat-Proben aus dem Pfortader-Einströmrohr und Auslass-Perfusat-Proben aus der Orgelkammer in 3-Stunden-Intervallen.
  2. Entnahme von Proben aus allen Leberlappen zur histologischen Analyse am Ende der Perfusionszeit von 12 h.

Ergebnisse

Etablierung des chirurgischen Verfahrens
Insgesamt wurden 17 Tiere für dieses Experiment verwendet: 14 Mäuse wurden zur Optimierung des Organbeschaffungsprozesses einschließlich der Kanülierung der Pfortader (PV) und des Gallengangs (BD) eingesetzt, während 3 Mäuse zur Validierung des Verfahrens verwendet wurden (Tabelle 1). Die histologischen Ergebnisse (Abbildung 3) wurden verglichen, um die Identifizierung der optimalen Perfusionsbedingungen zu e...

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll
Die beiden entscheidenden Schritte bei der Leberexplantation sind die Kanülierung der Pfortader (PV) und die anschließende Kanülierung des Gallengangs (BD). Diese Schritte sind von größter Bedeutung, um eine erfolgreiche Organentnahme und anschließende Perfusions- oder Transplantationsverfahren zu gewährleisten.

Herausforderungen und Lösungen
Die PV-Kanülierung stellt drei Herausforderungen dar: Verletzung der Gef...

Offenlegungen

Es bestehen keine finanziellen Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Während des Schreibens dieses Artikels habe ich viel Unterstützung und Hilfe erhalten. Besonders bedanken möchte ich mich bei meinem Teamkollegen XinPei Chen für die wunderbare Zusammenarbeit und die geduldige Unterstützung während meiner Operation.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 ml Micro Tube PPSarstedt72699
1 Fr Rubber CannulaVygonSample Cannula
10 µL Micro SyringeHamilton701N
2 Fr Rubber CannulaVygonSample Cannula
24 G Butterfly CannulaTerumoSR+OF2419
26 G Butterfly CannulaTerumoSR+DU2619WX
30 G Hypodermic NeedleSterican100246
50 ml Syringe PumpBraun110356
6-0 Perma-Hand SeideEthicon639H
Arterial ClipBraunBH014R
Autoclavable Moist ChamberHugo Sachs Elektronik73-4733
Big Cotton Applicator NOBA Verbandmittel Danz GmbH974018
Bubble TrapHugo-Sachs-ElektronikV83163
Buprenovet (0.3 mg / ml)Elanco/
CIDEX OPA solution (2 L)Cilag GmbH20391
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 CERBE/
Fetal Bovine Serum(500 ml) Sigma-AldrichF7524-500ML
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide)House Supply/
Heating Circulating BathsHarvard-Apparatus75-0310
Heparin 5000 (I.E. /5 ml)Braun1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)Pfizer15427276
Insulin(100 IE / ml)SigmaI0516-5ML
Iris Scissors Fine Science Instruments15000-03
Isofluran (250 ml)Cp-Pharma1214
Membrane OxygenatorHugo Sachs ElektronikT18728
Microsurgery Microscope LeicaM60
Mouse Retractor Set Carfil Quality180000056
NanoZoomer 2.0 HTHamamatsu/
Non-Woven Sponges Kompressen866110
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) C.C.ProZ-13-M
Perfusion Extension Tube (30 cm)Braun4256000
Peristaltic PumpHarvard-ApparatusP-70
Petri Dishc 100x15 mmVWR®391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)Livisto799-416
Pressure Transducer SimulatorUTAH Medical Products650-950
Reusable Blood Pressure TransducersAD InstrumentsMLT-0380/D
S & T Vessel Cannulation ForcepsFine Science Instruments00608-11
Small Cotton ApplicatorNOBA Verbandmittel Danz GmbH974116
Straight Forceps 10 cm Fine Science Instruments00632-11
Suture Tying ForcepsFine Science Instruments11063-07
Syringe 50ml Original PerfusorBraun8728810F-06
UT - 03 CannulaUnique Medical, Japan/
Vannas Spring ScissorsFine Science Instruments15018-10
Veterinary Saline (500 ml)WDT18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 LHarvard-Apparatus73-3441
William's E Medium (500 ML)Thermofischer ScientificA1217601

Referenzen

  1. Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
  2. Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
  3. Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
  4. Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
  5. Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
  6. Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B. Autophagy in hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Discovery. 9 (1), 115 (2023).
  7. Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
  8. Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
  9. Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 13 (10), 1619-1628 (2017).
  10. van der, V. a. l. k. . J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
  11. Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
  12. Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
  13. Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
  14. Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
  15. Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
  16. Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
  17. Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
  18. Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
  19. Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
  20. Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
  21. Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
  22. Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
  23. Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
  24. Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
  25. Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
  26. Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
  27. Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
  28. Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) - farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
  29. Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
  30. Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
  31. Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
  32. Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
  33. Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
  34. Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
  35. Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
  36. Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
  37. Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
  38. Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
  39. Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
  40. Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
  41. Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
  42. Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
  43. Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
  44. Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
  45. Von, C., Horn, H., Zlatev, J., Pletz, B., Lüer, T., Minor, Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
  46. Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William's E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
  47. Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
  48. Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
  49. Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
  50. Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
  51. Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
  52. Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
  53. Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
  54. Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
  55. van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).

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