Perfusão de máquina hepática normotérmica ex vivo em camundongos

Resumo

Um sistema normotérmico ex vivo de perfusão hepática (NEVLP) foi criado para fígados de camundongos. Este sistema requer experiência em microcirurgia, mas permite resultados reprodutíveis de perfusão. A capacidade de utilizar fígados de camundongos facilita a investigação de vias moleculares para identificar novos aditivos de perfusato e permite a execução de experimentos focados no reparo de órgãos.

Resumo

Este protocolo apresenta um sistema NEVLP livre de eritrócitos otimizado usando fígados de camundongos. A preservação ex vivo de fígados de camundongos foi obtida empregando-se cânulas modificadas e técnicas adaptadas de equipamentos comerciais convencionais de perfusão ex vivo . O sistema foi utilizado para avaliar os resultados de preservação após 12 h de perfusão. Camundongos C57BL/6J serviram como doadores de fígado, e os fígados foram explantados canulando a veia porta (VP) e o ducto biliar (BD) e, posteriormente, lavando o órgão com solução salina heparinizada aquecida (37 °C). Em seguida, os fígados explantados foram transferidos para a câmara de perfusão e submetidos à máquina de perfusão oxigenada normotérmica (NEVLP). Amostras de perfusato de entrada e saída foram coletadas em intervalos de 3 h para análise do perfusato. Ao término da perfusão, amostras de fígado foram obtidas para análise histológica, com integridade morfológica avaliada pelo Suzuki-Score modificado através da coloração pela Hematoxilina-Eosina (HE). Os experimentos de otimização produziram os seguintes achados: (1) camundongos pesando mais de 30 g foram considerados mais adequados para o experimento devido ao maior tamanho de seu ducto biliar (BD). (2) uma cânula de poliuretano 2 Fr (diâmetro externo = 0,66 mm) foi mais adequada para canulação da veia porta (VP) quando comparada a uma cânula de polipropileno. Isso foi atribuído à maior aderência do material de poliuretano, resultando em menor deslizamento do cateter durante a transferência do corpo para a câmara do órgão. (3) para a canulação do ducto biliar (BD), uma cânula de poliuretano 1 Fr (diâmetro externo = 0,33 mm) mostrou-se mais eficaz em comparação com a cânula de polipropileno UT - 03 (diâmetro externo = 0,30 mm). Com este protocolo otimizado, fígados de camundongos foram preservados com sucesso por uma duração de 12 h sem impacto significativo na estrutura histológica. A coloração pela hematoxilina-eosina (HE) revelou uma arquitetura morfológica do fígado bem preservada, caracterizada por hepatócitos predominantemente viáveis com núcleos claramente visíveis e discreta dilatação dos sinusóides hepáticos.

Introdução

O transplante hepático representa o tratamento padrão-ouro para indivíduos com doença hepática terminal. Lamentavelmente, a demanda por órgãos de doadores supera a oferta disponível, levando a uma escassez significativa. Em 2021, aproximadamente 24.936 pacientes estavam na lista de espera por um enxerto de fígado, enquanto apenas 9.234 transplantes foram realizados com sucesso¹. A significativa disparidade entre a oferta e a demanda de enxertos hepáticos destaca a necessidade premente de investigar estratégias alternativas para ampliar o pool de doadores e melhorar a acessibilidade dos enxertos hepáticos. Uma forma de ampliar o pool de doadores é utilizar doadores marginais². Os doadores marginais incluem aqueles com idade avançada, esteatose moderada ou grave. Embora o transplante de órgãos marginais possa produzir resultados favoráveis, os resultados gerais permanecem subótimos. Como resultado, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visem melhorar a função de doadores marginais está atualmente em andamento ^3,4.

Uma das estratégias é utilizar a máquina de perfusão, especialmente a máquina de oxigenação normotérmica, para melhorar a função desses órgãos marginais⁵. No entanto, ainda há uma compreensão limitada dos mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos benéficos da perfusão de máquina oxigenada normotérmica (NEVLP). Camundongos, com sua abundante disponibilidade de cepas geneticamente modificadas, servem como modelos valiosos para a investigação de vias moleculares. Por exemplo, a importância das vias de autofagia na atenuação da lesão de isquemia-reperfusão hepática tem sido cada vez mais^{reconhecida6,7}. Uma importante via molecular na lesão de isquemia-reperfusão hepática é^{a via} miR-20b-5p/ATG78. Atualmente, há uma série de linhagens de camundongos knockout e knock-out condicional disponíveis para ATG, mas nenhuma cepa de rato correspondente⁹.

Com base nesse contexto, o objetivo foi gerar uma plataforma NEVLP miniaturizada para enxertos hepáticos de camundongos. Essa plataforma facilitaria a exploração e avaliação de potenciais estratégias geneticamente modificadas destinadas a melhorar a funcionalidade do fígado do doador. Além disso, era essencial que o sistema fosse adequado para perfusão a longo prazo, possibilitando o tratamento ex vivo do fígado, comumente referido como "reparo de órgãos".

Considerando a disponibilidade limitada de dados in vitro relevantes sobre a perfusão hepática em camundongos, a revisão da literatura concentrou-se em estudos realizados em ratos. Uma busca sistemática da literatura de 2010 a 2022 foi realizada usando palavras-chave como "normothermic liver perfusion", "ex vivo or in vitro" e "rats". Esta pesquisa teve como objetivo identificar condições ótimas em roedores, permitindo determinar a abordagem mais adequada.

O sistema de perfusão consiste de um reservatório tampão de vidro vedado com camisa d'água, uma bomba de rolos peristálticos, um oxigenador, um coletor de bolhas, um trocador de calor, uma câmara de órgãos e um sistema fechado de tubos de ciclagem (Figura 1). O sistema garante a manutenção precisa de uma temperatura de perfusão constante de 37 °C usando uma máquina termostática dedicada. A bomba de rolos peristálticos conduz o fluxo do perfusato por todo o circuito. O circuito de perfusão inicia-se no reservatório isolado encamisado de água. Posteriormente, o perfusato é direcionado através do oxigenador, que recebe uma mistura gasosa de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono de uma garrafa de gás dedicada. Após a oxigenação, o perfusato passa através da armadilha de bolhas, na qual quaisquer bolhas aprisionadas são redirecionadas de volta para o reservatório pela bomba peristáltica. O perfusato remanescente flui através do trocador de calor e entra na câmara do órgão, de onde retorna ao reservatório.

Aqui, relatamos nossas experiências no estabelecimento de uma NEVLP para fígados de camundongos e compartilhamos os resultados promissores de um experimento piloto realizado usando o meio oxigenado sem carreadores de oxigênio.

Protocolo

Os experimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos e diretrizes alemães atuais para o bem-estar animal e as diretrizes ARRIVE para relatar pesquisas com animais. O protocolo de experimentação animal foi aprovado pelo Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turíngia, Alemanha (Número de aprovação: UKJ - 17 - 106).

NOTA: Camundongos machos C57BL/6J pesando 34 ± 4 g (média ± erro padrão da média [EPM]) foram utilizados como doadores de fígado. Eles foram mantidos sob condições ambientais controladas (50% de umidade e 18 - 23 °C) com livre acesso à ração padrão e água. Durante todo o procedimento cirúrgico, manteve-se a frequência respiratória superior a 60 ciclos/min e a temperatura corporal foi mantida acima de 34 °C.

1. Preparo

1. Configurando a tabela de operações
   1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e consumíveis para fins de esterilização.
   2. Ligue todos os equipamentos, incluindo a placa de aquecimento e eletrocoagulação.
   3. Colocar uma seringa de 50 mL com 25 mL de solução salina heparinizada (2.500 U/L) em estufa aquecida (37 °C).
   4. Colocar os instrumentais cirúrgicos, a sutura de seda 6 - 0, aplicador pequeno de algodão estéril, soro fisiológico veterinário (500 mL) e compressas de gaze não tecida (10 cm x 10 cm) sobre a mesa de operação adequadamente.
   5. Coloque uma agulha 26 G na mesa de operação para criar um pequeno orifício na tampa do tubo de microcentrífuga de 0,5 mL para receber o tubo biliar para coleta de bile.
   6. Colocar a cânula (cânula de poliuretano 1 Fr ou cânula de polietileno UT - 03) e um tubo de microcentrífuga esterilizado de 0,5 mL para coleta de bile na mesa de operação.
2. Cânula autoconfeccionada da veia porta
   1. Segurar a cânula de 2 Fr com pinça e puncionar a parede com uma agulha de 30 G a uma distância de 1 cm da extremidade da cânula. Empurre a agulha através da cânula até que a ponta da agulha fique visível.
   2. Corte a ponta da cânula resultando em um triângulo afiado.
3. Preparo de solução salina heparinizada
   1. Preparar 25 mL de solução salina heparinizada com concentração final de 2.500 UI/mL.
   2. Retire todas as bolhas de ar e coloque a seringa na incubadora a 40 °C.
4. Demonstração do sistema de perfusão
   1. Veja a Figura 1 para os principais componentes do sistema de perfusão da máquina.
5. Instalação da câmara de órgãos
   1. Veja a Figura 2 para o layout da câmara de órgãos.
6. Configuração do sistema de perfusão
   1. Ative o programa de gráfico de laboratório para monitoramento de pressão.
   2. Conecte o calibrador de pressão e o sensor de pressão no nível da câmara do órgão.
   3. Ajuste o calibrador de pressão para ler 0 mmHg e verifique o valor correspondente no software de controle de pressão.
   4. Ajuste o calibrador de pressão para ler 20 mmHg e verifique novamente o valor correspondente no software de controle de pressão.
   5. Ligue o banho-maria e pré-aqueça a câmara de órgãos a 40 °C.
   6. Lave todo o sistema de encanamento duas vezes com água destilada deionizada por 30 min cada, garantindo a remoção completa da solução sanitizante.
   7. Inicie a circulação da solução de desinfecção por todo o sistema por uma duração de 20 minutos para garantir a desinfecção completa.
   8. Ligue a mistura de gases (95% de oxigênio (O 2) e 5% de dióxido de carbono (CO₂).
7. Enchimento com perfusato
   1. Suplemento de 250 mL de meio Williams' E com 50 mL de soro fetal bovino, 3 mL de penicilina/estreptomicina (1 mg/mL), 0,17 mL de insulina (100 IE/mL), 0,34 mL de heparina (5000 U/mL) e 0,07 mL de hidrocortisona (100 mg/2 mL) para preparar o meio E completo de Williams.
   2. Adicionar volumes iguais (150 mL) de perfusato ao reservatório e à câmara orgânica para preparar o sistema.
      OBS: Atenção especial deve ser dada à manutenção da esterilidade durante o processo de enchimento. O perfusato é constantemente bombeado através desses dois componentes-chave da perfusão da máquina recirculante fechada.
   3. Ligar a bomba peristáltica em velocidade média (15 mL/min) para iniciar o sistema de perfusão com o meio oxigenado.

2. Explante hepático

1. Preparo pré-operatório
   1. Pese o animal. Preparar o analgésico buprenorfina (0,3 mg/mL) (0,05 mg/kg de peso corporal).
   2. Conecte a câmara de indução com o soquete de parede. Vire o oxigênio para 0,5 L/min. Vire isoflurano para 3%.
   3. Colocar o animal na câmara até que se atinja a anestesia profunda (reflexo de retificação positivo).
   4. Use uma microseringa para aplicar dose de analgesia adaptada ao peso corporal por via subcutânea.
   5. Use um barbeador elétrico para aparar o pelo na pele abdominal.
   6. Transfira o mouse para a mesa de operação e ligue o vaporizador de isoflurano a 2,5% para manter a anestesia. Confirme a profundidade da anestesia testando o reflexo interdigital do dedo.
2. Preparação do abdome do rato
   1. Coloque o rato em decúbito dorsal.
   2. Teste o reflexo interdigital para confirmar a profundidade adequada da anestesia. Fixe os quatro membros com fita adesiva.
   3. Desinfetar ambos os lados do abdome até a linha axilar média usando três rodadas consecutivas de iodo-álcool. Use gaze esterilizada não tecida para cobrir a área ao redor do campo cirúrgico.
   4. Faça uma incisão transversal de 3 cm 1 cm abaixo do xifoide na área abdominal do camundongo usando tesoura de bebê Metzenbaum e pinça cirúrgica.
   5. Estender a incisão da pele bilateralmente à linha axilar média em ambos os lados.
   6. Faça cuidadosamente uma incisão longitudinal de 2 cm ao longo da linha alba usando uma tesoura de mola.
   7. Corte a camada muscular abdominal com eletrocoagulação e tesoura de mola Vannas.
   8. Coloque cuidadosamente um pedaço de gaze úmida para proteger o fígado da eletrocoagulação.
   9. Use uma sutura de seda 6 - 0 com a agulha redonda para retrair o processo xifoide para melhor exposição do ligamento coronariano.
   10. Use dois afastadores de costela para expor totalmente a cavidade abdominal do mouse.
   11. Mova cuidadosamente o intestino delgado para fora da cavidade abdominal com um cotonete molhado para expor totalmente o hilo.
3. Preparação do ducto biliar comum
   1. Transeccionar os ligamentos falciformes, frênicos e gastro-hepáticos com tesouras afiadas.
   2. Liberte cuidadosamente o ducto biliar comum usando pinças curvas finas sem dentes.
      NOTA: O ducto biliar comum é muito facilmente danificado e quebra. Uma vez que quebra, não pode ser canulado. Devido à direção da posição anatômica, pinças curvas são melhores para serem utilizadas.
   3. Coloque duas alças de sutura de seda 6 - 0 sobre o ducto biliar comum em preparação para o próximo passo.
4. Canulação do ducto biliar comum
   1. Puncione cuidadosamente o ducto biliar com uma agulha de 30 G. Use pinças curvas pontiagudas para ampliar o pequeno orifício para encaixar a canulação do ducto biliar.
   2. Use pinça de canulação do vaso para agarrar a cânula do ducto biliar e empurrá-la para dentro do ducto biliar.
   3. Dupla fixação da cânula com alças de sutura predefinidas 6 - 0.
      NOTA: Durante a canulação, a resistência pela bile é sentida. Se a força não for bem controlada, a cânula será empurrada para fora do trato biliar pela pressão de saída da bile. Ajuste cuidadosamente a profundidade da cânula. Se for muito profundo, pode danificar o ducto biliar e, se não for profundo o suficiente, pode escapar.
   4. Observe o fluxo biliar na cânula após a canulação bem-sucedida.
5. Preparo da veia porta
   1. Aperte a veia porta com pinça plana e libere cuidadosamente o tecido conjuntivo com pinça curva. Não puxe com força para evitar causar ruptura da veia porta. Uma vez que a veia porta é lesada, é difícil recanular a veia porta.
   2. Dissecar o VP logo superior à bifurcação e colocar a primeira alça de sutura com fio de seda 6 - 0 no PV próximo à confluência para uso posterior.
   3. Colocar a segunda alça de sutura para posterior fixação das VVPP o mais próximo possível do hilo hepático.
6. Canulação da veia porta
   1. Use um clipe arterial para fechar a veia porta distal.
   2. Com muito cuidado, puncione a veia porta com uma das cânulas da veia porta acima. O fluxo sanguíneo pode ser claramente observado dentro da cânula após uma punção bem-sucedida.
   3. Fixar a cânula PV com a alça de sutura 6 - 0 pré-colocada.
7. Rubor hepático
   1. Aumentar o isoflurano para 5% e eutanasiar o rato com uma sobredose de inalação de isoflurano.
   2. Tome solução salina de heparina pré-aquecida da incubadora. Remova todas as bolhas de ar formadas no interior do soro fisiológico heparinizado.
   3. Fixe a seringa com soro fisiológico heparinizado pré-aquecido na bomba da seringa.
   4. Conecte o tubo de extensão da bomba de seringa à cânula da veia porta, ajuste a velocidade para 2 mL/min e inicie a lavagem hepática.
   5. Observe a cor do fígado no final do procedimento de lavagem. Excise o fígado uma vez que a cor se transforma em um amarelo homogêneo.
   6. Transeccionar o diafragma, a veia cava inferior supra-hepática, a veia cava infra-hepática, a artéria hepática, a veia porta distal e qualquer tecido conjuntivo remanescente.
   7. Coloque o fígado na placa de Petri.

3. Conexão do fígado e da câmara

1. Transferência hepática
   1. Transfira cuidadosamente o fígado para a câmara do órgão usando uma placa de Petri.
   2. Mantenha uma pequena quantidade de soro fisiológico na placa de Petri para evitar que o fígado seque.
      NOTA: A veia porta e o ducto biliar podem ser facilmente torcidos durante este procedimento, o que pode afetar a perfusão hepática e a coleção biliar.
2. Conexão da cânula da veia porta
   1. Infundir lentamente soro fisiológico normal na cânula da veia porta com uma seringa para evacuar as bolhas de ar na cânula.
   2. Conecte a cânula da veia porta ao tubo de saída do perfusato na câmara do órgão.
3. Conexão da cânula do ducto biliar
   1. Guie a cânula do ducto biliar do rato através da válvula de uma tampa de borracha que está conectada à câmara do órgão.
   2. Insira a cânula do ducto biliar em um microtubo pré-preparado de 0,5 mL com um pequeno orifício na tampa.
   3. Coloque o microtubo na argila fora da câmara do órgão.

4. Ajuste a taxa de fluxo de acordo com a pressão PV

1. Ligue a bomba peristáltica a partir de 1 mL/min.
2. Verifique a leitura da pressão da veia porta para ajustar a vazão.
3. Manter a pressão da veia porta na faixa fisiológica entre 7 - 10 mmHg ajustando o fluxo.
   NOTA: A vazão nominal pode variar ligeiramente dependendo do uso e posicionamento dos tubos.

5. Coleta de amostras

1. Obter amostras de perfusato de entrada do tubo de entrada da veia porta e amostras de perfusato de saída da câmara de órgãos em intervalos de 3h.
2. Coletar amostras de todos os lobos hepáticos para análise histológica ao final do período de perfusão de 12 h.

Resultados

Estabelecimento do procedimento cirúrgico
Um total de 17 animais foi utilizado para este experimento: 14 camundongos foram empregados para otimizar o processo de captação de órgãos, incluindo a canulação da veia porta (PV) e do ducto biliar (BD), enquanto 3 camundongos foram usados para validar o procedimento (Tabela 1). Os resultados histológicos (Figura 3) foram comparados para facilitar a identificação da condição ótima de perfusão.

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Discussão

Etapas críticas do protocolo
As duas etapas cruciais no explante hepático são a canulação da veia porta (VP) e a subsequente canulação do ducto biliar (BD). Essas etapas são de suma importância para garantir o sucesso da recuperação de órgãos e subsequentes procedimentos de perfusão ou transplante.

Desafios e soluções
A canulação das VVPP apresenta três desafios: lesão da parede do vaso, deslocamento do cateter e praticabilidade do pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 ml Micro Tube PP	Sarstedt	72699
1 Fr Rubber Cannula	Vygon	Sample Cannula
10 µL Micro Syringe	Hamilton	701N
2 Fr Rubber Cannula	Vygon	Sample Cannula
24 G Butterfly Cannula	Terumo	SR+OF2419
26 G Butterfly Cannula	Terumo	SR+DU2619WX
30 G Hypodermic Needle	Sterican	100246
50 ml Syringe Pump	Braun	110356
6-0 Perma-Hand Seide	Ethicon	639H
Arterial Clip	Braun	BH014R
Autoclavable Moist Chamber	Hugo Sachs Elektronik	73-4733
Big Cotton Applicator	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974018
Bubble Trap	Hugo-Sachs-Elektronik	V83163
Buprenovet (0.3 mg / ml)	Elanco	/
CIDEX OPA solution (2 L)	Cilag GmbH	20391
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C	ERBE	/
Fetal Bovine Serum(500 ml)	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide)	House Supply	/
Heating Circulating Baths	Harvard-Apparatus	75-0310
Heparin 5000 (I.E. /5 ml)	Braun	1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)	Pfizer	15427276
Insulin(100 IE / ml)	Sigma	I0516-5ML
Iris Scissors	Fine Science Instruments	15000-03
Isofluran (250 ml)	Cp-Pharma	1214
Membrane Oxygenator	Hugo Sachs Elektronik	T18728
Microsurgery Microscope	Leica	M60
Mouse Retractor Set	Carfil Quality	180000056
NanoZoomer 2.0 HT	Hamamatsu	/
Non-Woven Sponges	Kompressen	866110
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)	C.C.Pro	Z-13-M
Perfusion Extension Tube (30 cm)	Braun	4256000
Peristaltic Pump	Harvard-Apparatus	P-70
Petri Dishc 100x15 mm	VWR®	391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)	Livisto	799-416
Pressure Transducer Simulator	UTAH Medical Products	650-950
Reusable Blood Pressure Transducers	AD Instruments	MLT-0380/D
S & T Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Instruments	00608-11
Small Cotton Applicator	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974116
Straight Forceps 10 cm	Fine Science Instruments	00632-11
Suture Tying Forceps	Fine Science Instruments	11063-07
Syringe 50ml Original Perfusor	Braun	8728810F-06
UT - 03 Cannula	Unique Medical, Japan	/
Vannas Spring Scissors	Fine Science Instruments	15018-10
Veterinary Saline (500 ml)	WDT	18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 L	Harvard-Apparatus	73-3441
William's E Medium (500 ML)	Thermofischer Scientific	A1217601