マウスにおけるノルマザーミック Ex vivo 肝臓機械灌流

要約

マウス肝臓用に正常体温 外生体外 肝灌流(NEVLP)システムが作成されました。このシステムはマイクロサージャリーの経験が必要ですが、再現性のある灌流結果を可能にします。マウスの肝臓を利用することで、分子経路の探索が容易になり、新規灌流液添加物が同定され、臓器修復に重点を置いた実験が可能になります。

要約

このプロトコルは、マウス肝臓を用いた最適化された赤血球フリーNEVLPシステムを提示します。マウス肝臓の 生体外 保存は、改変カニューレおよび従来の市販 のex vivo 灌流装置から適応された技術を採用することによって達成された。このシステムは、12時間の灌流後の保存結果を評価するために利用されました。C57BL/6Jマウスを肝ドナーとし、門脈(PV)と胆管(BD)をカニューレ挿入し、その後、温かい(37°C)ヘパリン化生理食塩水で臓器を洗い流すことによって肝臓を移植しました。次いで、移植した肝臓を灌流チャンバーに移し、正常体温酸素化機械灌流(NEVLP)に供した。流入口および出口灌流液サンプルを、灌流液分析のために3時間間隔で収集した。灌流が完了すると、組織学的分析のために肝臓サンプルが取得され、ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色による修正スズキスコアを使用して形態学的完全性が評価されました。最適化実験の結果、(1)体重が30gを超えるマウスは、胆管(BD)のサイズが大きいため、実験に適していると見なされました。(2) 2 Fr(外径=0.66 mm)ポリウレタンカニューレは, ポリプロピレンカニューレと比較して門脈カニューレ挿入(PV)に適していた.これは、ポリウレタン素材のグリップ力が向上し、体から臓器室への移動中のカテーテルの滑りが減少したことに起因していました。(3)胆管カニューレ挿入術(BD)では,ポリプロピレンUT-03(外径=0.30mm)カニューレに比べて1Fr(外径=0.33mm)ポリウレタンカニューレの方が有効であることがわかった。この最適化されたプロトコルにより、マウスの肝臓は、組織学的構造に大きな影響を与えることなく、12時間の間首尾よく保存されました。ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色により、肝臓のよく保存された形態学的構造が明らかになり、核がはっきりと見える主に生存肝細胞と肝類洞の軽度の拡張が特徴でした。

概要

肝移植は、末期肝疾患のある個人のゴールドスタンダード治療です。残念ながら、ドナー臓器の需要は利用可能な供給を上回り、大幅な不足につながっています。2021年には、約24,936人の患者が肝移植の順番待ちリストに載っていましたが、成功した移植は9,234件だけでした¹。肝移植片の需要と供給の著しい格差は、ドナープールを拡大し、肝移植片のアクセシビリティを高めるための代替戦略を調査する差し迫った必要性を浮き彫りにしています。ドナープールを拡大する1つの方法は、限界ド^ナー2を使用することです。限界ドナーには、高齢、中等度または重度の脂肪症のドナーが含まれます。辺縁臓器の移植は好ましい結果をもたらすかもしれませんが、全体的な結果は最適ではないままです。その結果、限界ドナーの機能を高めることを目的とした治療戦略の開発が現在進行中です^3,4。

戦略の1つは、機械灌流、特に正常体温酸素化機械灌流を使用して、これらの辺縁器官の機能を改善することです⁵。しかし、正常体温酸素化機械灌流(NEVLP)の有益な効果の根底にある分子メカニズムについての理解はまだ限られています。マウスは、遺伝子組み換え株が豊富に利用できるため、分子経路を調べるための貴重なモデルとして機能します。例えば、肝虚血再灌流障害の緩和におけるオートファジー経路の重要性は、ますます認識されています^6,7。肝虚血再灌流障害における重要な分子経路の1つは、miR-20b-5p/ATG7経路⁸です。現在、ATGノックアウトおよび条件付きノックアウトマウス系統が多数入手可能であるが、対応するラット系統は^{存在しない9。}

このような背景から、マウス肝移植片用の小型NEVLPプラットフォームを作製することを目的としていました。このプラットフォームは、ドナーの肝臓の機能を改善することを目的とした潜在的な遺伝子組み換え戦略の調査と評価を容易にします。さらに、システムが長期灌流に適していることが不可欠であり、一般に「臓器修復」と呼ばれる肝臓の 生体外 治療を可能にしました。

マウス肝灌流に関する関連する in vitro データの入手可能性が限られていることを考慮して、文献レビューはラットで実施された研究に焦点を当てた。2010年から2022年までの文献を「正常熱肝灌流」「ex vivo または in vitro」「ラット」などのキーワードを用いて系統的検索を行った。この検索は、げっ歯類の最適条件を特定することを目的としており、最も適切なアプローチを決定することができました。

灌流システムは、密閉されたウォータージャケット付きガラスバッファーリザーバー、ペリスタルティックローラーポンプ、酸素発生器、バブルトラップ、熱交換器、臓器室、およびクローズドサイクリングチューブシステムで構成されています(図1)。このシステムは、専用のサーモスタットマシンを使用して、37°Cの一定の灌流温度を正確に維持します。蠕動ローラーポンプは、回路全体の灌流液の流れを駆動します。灌流回路は、絶縁されたウォータージャケットリザーバーで開始されます。続いて、灌流液は酸素発生器を通って導かれ、酸素発生器は専用のガスボトルから95%の酸素と5%の二酸化炭素のガス混合物を受け取る。酸素化に続いて、灌流液はバブルトラップを通過し、そこで閉じ込められた気泡は蠕動ポンプによってリザーバーにリダイレクトされます。残りの灌流液は熱交換器を通って流れ、臓器室に入り、そこからリザーバーに戻ります。

本稿では、マウス肝臓のNEVLPを確立した経験を報告し、酸素キャリアを含まない酸素化培地を用いて行ったパイロット実験の有望な結果を共有します。

プロトコル

動物実験は、動物福祉に関する現在のドイツの規制とガイドライン、および動物研究の報告に関するARRIVEガイドラインに従って実施されました。動物実験プロトコルは、ドイツ、テューリンゲン州のテューリンガー州議会によって承認されました(承認番号:UKJ - 17 - 106)。

注:体重34 ± 4 g(平均[SEM]の平均±標準誤差)の雄C57BL / 6Jマウスを肝臓ドナーとして使用しました。それらは、制御された環境条件(湿度50%、18〜23°C)で維持され、標準的なマウス固形飼料と水に自由にアクセスできました。手術中、60呼吸/分を超える呼吸数を維持し、体温を34°C以上に保ちました。

1. 事前準備

1. 操作テーブルの設定
   1. 滅菌用のすべての手術器具および消耗品をオートクレーブします。
   2. 加温ボードや電気凝固を含むすべての機器の電源を入れます。
   3. 25 mLヘパリン処理(2,500 U/L)生理食塩水を入れた50 mLシリンジ1本を温かいインキュベーター(37°C)に入れます。
   4. 手術器具、6-0シルク縫合糸、滅菌小型綿アプリケーター、獣医生理食塩水(500 mL)、および不織布ガーゼスポンジ(10 cm x 10 cm)を手術台に適切に置きます。
   5. 手術台に26 Gの針を置き、0.5 mLマイクロ遠心チューブの蓋に小さな穴を開けて、胆汁採取用の胆管を受け入れます。
   6. カニューレ(1 FrポリウレタンカニューレまたはUT-03ポリエチレンカニューレ)と胆汁収集用の滅菌済み0.5 mLマイクロ遠心チューブを操作テーブルに置きます。
2. 自作門脈カニューレ
   1. 2 Frカニューレを鉗子で持ち、カニューレの端から1 cmの距離で30 Gの針で壁に穴を開けます。針の先端が見えるようになるまで、針をカニューレに通します。
   2. カニューレの先端をトリミングして、鋭い三角形にします。
3. ヘパリン化生理食塩水の調製
   1. 最終濃度2,500 IU/mLのヘパリン化生理食塩水を25 mL調製します。
   2. 気泡をすべて取り除き、シリンジを40°Cのインキュベーターに入れます。
4. 灌流システムのデモンストレーション
   1. 機械灌流システムの主要コンポーネントについては、 図1 を参照してください。
5. 臓器室の設置
   1. 臓器室のレイアウトについては、 図2 を参照してください。
6. 灌流システムのセットアップ
   1. 圧力監視用のラボチャートプログラムをオンにします。
   2. 圧力校正器と圧力センサーを臓器室レベルで接続します。
   3. 圧力校正器を調整して0 mmHgと読み取り、圧力制御ソフトウェアで対応する値を確認します。
   4. 圧力校正器を20 mmHgを読み取るように調整し、圧力制御ソフトウェアで対応する値を再度確認します。
   5. 水浴をオンにし、臓器室を40°Cに予熱します。
   6. 配管システム全体を蒸留脱イオン水でそれぞれ30分間2回洗い流し、消毒液を完全に除去します。
   7. システム全体で消毒液の循環を20分間開始し、徹底的な消毒を確実にします。
   8. 混合ガス(95%酸素(O 2)と5%二酸化炭素(CO₂))をオンにします。
7. 灌流液充填
   1. ウィリアムズE培地250 mLにウシ胎児血清50 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン3 mL(1 mg/mL)、インスリン0.17 mL(100 IE/mL)、ヘパリン0.34 mL(5000 U/mL)、ヒドロコルチゾン0.07 mL(100 mg/2 mL)を補充して、ウィリアムズE培地を完成させます。
   2. 等量(150 mL)の灌流液をリザーバーと臓器室に追加して、システムをプライミングします。
      注意: 充填プロセス中に無菌性を維持するために特別な注意を払う必要があります。灌流液は、閉じた再循環機灌流のこれら2つの主要コンポーネントを介して絶えずポンプで送られます。
   3. ペリスタルティックポンプを中速(15 mL/min)でオンにして、灌流システムに酸素化媒体をプライミングします。

2.肝摘出

1. 手術前の準備
   1. 動物の体重を量ります。鎮痛剤ブプレノルフィン(0.3 mg / mL)(0.05 mg / kg体重)を準備します。.
   2. 誘導室を壁のコンセントに接続します。酸素を0.5リットル/分にします。イソフルランを3%にします。
   3. 深い麻酔(右反射陽性)に達するまで動物をチャンバーに入れます。
   4. マイクロシリンジを使用して、体重に適合した用量の鎮痛を皮下に適用する。
   5. 電気かみそりを使用して、腹部の皮膚の毛皮を整えます。
   6. マウスを操作テーブルに移し、イソフルラン気化器を2.5%までオンにして麻酔を維持します。指間足指反射をテストして麻酔の深さを確認します。
2. マウス腹部の準備
   1. マウスを仰臥位に置きます。
   2. 指間反射をテストして、適切な麻酔の深さを二重に確認します。四肢すべてをテープで固定します。
   3. 腹部の両側を3回連続したヨウ素アルコールを使用して腋窩線中部まで消毒します。手術野の周囲を覆うために不織布滅菌ガーゼを使用してください。
   4. メッツェンバウムベビーハサミと外科用鉗子を使用して、マウスの腹部の剣状突起から1 cm下に3 cmの横切開を行います。
   5. 皮膚切開部を両側の中央腋窩線まで両側に伸ばします。
   6. スプリングハサミを使用して、リネアアルバに沿って2 cmの縦方向の切開を慎重に行います。
   7. 電気凝固とVannasスプリングはさみで腹筋層を切り取ります。
   8. 肝臓を電気凝固から保護するために、湿ったガーゼを慎重に置きます。
   9. 冠状靭帯のより良い露出のために剣状突起を引っ込めるために丸い針で6 - 0の絹縫合糸を使用してください。
   10. 2つの肋骨開創器を使用して、マウスの腹腔を完全に露出させます。
   11. 湿った綿棒で小腸を腹腔から慎重に移動させ、丘を完全に露出させます。
3. 総胆管の準備
   1. 鋭いハサミで鷹状、横隔膜、および胃肝靭帯を横断します。
   2. 歯のない細かい湾曲した鉗子を使用して、総胆管を慎重に解放します。
      注意: 一般的な胆管は非常に簡単に損傷し、壊れます。一度壊れると、カニューレ挿入することはできません。解剖学的位置の方向のために、湾曲した鉗子が使用されるのがより良い。
   3. 次のステップに備えて、2つの6-0シルク縫合ループを総胆管の上に置きます。
4. 総胆管カニュレーション
   1. 30 Gの針で胆管を慎重に穿刺します。先のとがった湾曲した鉗子を使用して、胆管カニューレ挿入に合うように小さな穴を拡大します。
   2. 血管カニューレ鉗子を使用して胆管カニューレをつかみ、胆管に押し込みます。
   3. プリセットされた6-0縫合ループでカニューレを二重に固定します。
      注:カニュレーション中、胆汁による抵抗が感じられます。力が十分に制御されていない場合、カニューレは胆汁流出の圧力によって胆道から押し出されます。カニューレの深さを慎重に調整します。深すぎると胆管を傷つけたり、深すぎると抜け落ちたりすることがあります。
   4. カニューレ挿入が成功した後、カニューレ内の胆汁の流れを観察します。
5. 門脈の準備
   1. 平らな鉗子で門脈を固定し、湾曲した鉗子で結合組織を慎重に解放します。門脈の裂傷を避けるために強く引っ張らないでください。門脈が損傷すると、門脈を再カニューレすることは困難です。
   2. 分岐部よりもちょうど良いPVを解剖し、後で使用するために合流点近くのPVに6-0シルク縫合糸を使用して最初の縫合ループを配置します。
   3. PVを後で肝丘にできるだけ近づけるために、2番目の縫合ループを配置します。
6. 門脈カニュレーション
   1. 動脈クリップを使用して遠位門脈を閉じます。
   2. 非常に慎重に、上記の門脈カニューレのいずれかで門脈を穿刺します。穿刺が成功した後、カニューレ内の血流がはっきりと観察できます。
   3. PVカニューレをあらかじめ配置された6-0縫合ループで固定します。
7. 肝臓の紅潮
   1. イソフルランを5%に増やし、過剰量のイソフルラン吸入でマウスを安楽死させる。
   2. インキュベーターから予熱したヘパリン食塩水を取ります。ヘパリン化生理食塩水中に形成された気泡をすべて取り除きます。
   3. 予熱したヘパリン化生理食塩水でシリンジをシリンジポンプに固定します。
   4. シリンジポンプの延長チューブを門脈のカニューレに接続し、速度を2 mL / minに調整して、肝臓の紅潮を開始します。
   5. 紅潮手順の最後に肝臓の色を観察します。色が均一な黄色に変わったら、肝臓を切除します。
   6. 横隔膜、肝上下大静脈、下肝大静脈、肝動脈、遠位門脈、および残りの結合組織を横断する。
   7. 肝臓をペトリ皿に入れます。

3.肝臓とチャンバーの接続

1. 肝移植
   1. ペトリ皿を使用して肝臓を臓器室に慎重に移します。
   2. 肝臓が乾燥するのを防ぐために、ペトリ皿に少量の生理食塩水を保管してください。
      注意: この手順では、門脈と胆管が簡単にねじれる可能性があり、肝灌流と胆汁収集に影響を与える可能性があります。
2. 門脈カニューレ接続
   1. 通常の生理食塩水を注射器で門脈カニューレにゆっくりと注入し、カニューレ内の気泡を排出します。
   2. 門脈カニューレを臓器室の灌流液流出チューブに接続します。
3. 胆管カニューレ接続
   1. マウス胆管カニューレを臓器室に接続されているゴム製キャップのバルブに通します。
   2. 胆管カニューレを、蓋に小さな穴のある事前に準備された0.5mLマイクロチューブに挿入します。
   3. マイクロチューブを臓器室の外側の粘土の上に置きます。

4. PV圧力に応じて流量を調整します

1. ペリスタルティックポンプを1mL/minからオンにします。
2. 門脈圧の読み取り値をチェックして、流量を調整します。
3. 流量を調整することにより、門脈圧を7〜10mmHgの生理学的範囲に維持します。
   注意: 公称流量は、チューブの使用法と位置によってわずかに異なる場合があります。

5.サンプル収集

1. 門脈流入管からの入口灌流液サンプルと臓器室からの出口灌流液サンプルを3時間間隔で取得します。
2. 12時間の灌流期間の終わりに組織学的分析のためにすべての肝葉からサンプルを収集します。

結果

手術手技の確立
合計17匹の動物がこの実験に利用されました:門脈(PV)と胆管(BD)のカニューレ挿入を含む臓器調達プロセスを最適化するために14匹のマウスが使用され、3匹のマウスが手順を検証するために使用されました(表1)。組織学的結果(図3)を、最適な灌流条件の同定を容易にするために比較した。

灌流液の選?...

ディスカッション

プロトコルの重要なステップ
肝移植における2つの重要なステップは、門脈のカニューレ挿入(PV)とそれに続く胆管のカニューレ挿入(BD)です。これらのステップは、臓器摘出とその後の灌流または移植手順を成功させる上で最も重要です。

課題と解決策
PVカニュレーションには、血管壁の損傷、カテーテルの変位、挿入プロセスの実用性の3?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 ml Micro Tube PP	Sarstedt	72699
1 Fr Rubber Cannula	Vygon	Sample Cannula
10 µL Micro Syringe	Hamilton	701N
2 Fr Rubber Cannula	Vygon	Sample Cannula
24 G Butterfly Cannula	Terumo	SR+OF2419
26 G Butterfly Cannula	Terumo	SR+DU2619WX
30 G Hypodermic Needle	Sterican	100246
50 ml Syringe Pump	Braun	110356
6-0 Perma-Hand Seide	Ethicon	639H
Arterial Clip	Braun	BH014R
Autoclavable Moist Chamber	Hugo Sachs Elektronik	73-4733
Big Cotton Applicator	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974018
Bubble Trap	Hugo-Sachs-Elektronik	V83163
Buprenovet (0.3 mg / ml)	Elanco	/
CIDEX OPA solution (2 L)	Cilag GmbH	20391
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C	ERBE	/
Fetal Bovine Serum(500 ml)	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide)	House Supply	/
Heating Circulating Baths	Harvard-Apparatus	75-0310
Heparin 5000 (I.E. /5 ml)	Braun	1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)	Pfizer	15427276
Insulin(100 IE / ml)	Sigma	I0516-5ML
Iris Scissors	Fine Science Instruments	15000-03
Isofluran (250 ml)	Cp-Pharma	1214
Membrane Oxygenator	Hugo Sachs Elektronik	T18728
Microsurgery Microscope	Leica	M60
Mouse Retractor Set	Carfil Quality	180000056
NanoZoomer 2.0 HT	Hamamatsu	/
Non-Woven Sponges	Kompressen	866110
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)	C.C.Pro	Z-13-M
Perfusion Extension Tube (30 cm)	Braun	4256000
Peristaltic Pump	Harvard-Apparatus	P-70
Petri Dishc 100x15 mm	VWR®	391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)	Livisto	799-416
Pressure Transducer Simulator	UTAH Medical Products	650-950
Reusable Blood Pressure Transducers	AD Instruments	MLT-0380/D
S & T Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Instruments	00608-11
Small Cotton Applicator	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974116
Straight Forceps 10 cm	Fine Science Instruments	00632-11
Suture Tying Forceps	Fine Science Instruments	11063-07
Syringe 50ml Original Perfusor	Braun	8728810F-06
UT - 03 Cannula	Unique Medical, Japan	/
Vannas Spring Scissors	Fine Science Instruments	15018-10
Veterinary Saline (500 ml)	WDT	18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 L	Harvard-Apparatus	73-3441
William's E Medium (500 ML)	Thermofischer Scientific	A1217601