Impactador automatizado para el modelo de lesión medular contusiva en ratones

Resumen

Aquí se presenta un novedoso dispositivo automatizado de contusión por lesión de la médula espinal para ratones, que puede producir con precisión modelos de contusión por lesión de la médula espinal con diversos grados.

Resumen

La lesión de la médula espinal (LME) debida a lesiones traumáticas, como accidentes automovilísticos y caídas, se asocia con una disfunción permanente de la médula espinal. La creación de modelos de contusión de lesión medular por impacto en la médula espinal da lugar a patologías similares a la mayoría de las lesiones medulares en la práctica clínica. Los modelos animales precisos, reproducibles y convenientes de lesión de la médula espinal son esenciales para estudiar la lesión de la médula espinal. Presentamos un novedoso dispositivo automatizado de contusión por lesión de la médula espinal para ratones, el sistema inteligente de lesión de la médula espinal de la Universidad de Guangzhou Jinan, que puede producir modelos de contusión por lesión de la médula espinal con precisión, reproducibilidad y comodidad. El sistema produce con precisión modelos de diversos grados de lesión de la médula espinal a través de sensores de distancia láser combinados con una plataforma móvil automatizada y un software avanzado. Utilizamos este sistema para crear tres niveles de modelos de ratones con lesión de la médula espinal, determinamos sus puntuaciones en la escala de ratón de Basso (BMS) y realizamos ensayos de comportamiento y tinción para demostrar su precisión y reproducibilidad. Mostramos cada paso del desarrollo de los modelos de lesión utilizando este dispositivo, formando un procedimiento estandarizado. Este método produce modelos reproducibles de contrusión por lesión de la médula espinal en ratones y reduce los factores de manipulación humana a través de procedimientos de manipulación convenientes. El modelo animal desarrollado es fiable para estudiar los mecanismos de lesión de la médula espinal y los enfoques de tratamiento asociados.

Introducción

La lesión de la médula espinal generalmente resulta en una disfunción permanente de la médula espinal debajo del segmento lesionado. Es causada principalmente por objetos que golpean la columna vertebral y la hiperextensión de la columna vertebral, como accidentes de tráfico y caídas¹. Debido a la limitada disponibilidad de opciones de tratamiento eficaces para la lesión de la médula espinal, la elucidación de la patogénesis de las lesiones de la médula espinal utilizando modelos animales será informativa para el desarrollo de enfoques de tratamiento adecuados. El modelo de contusión de lesión medular causada por impacto en la médula espinal da lugar al desarrollo de modelos animales con patologías similares a la mayoría de los casos clínicos de lesión medular ^2,3. Por lo tanto, es importante producir modelos animales precisos, reproducibles y convenientes para la contusión por lesión de la médula espinal.

Desde la invención por Allen del primer modelo animal de lesión medular en 1911, se han producido importantes avances en el desarrollo de instrumentos para establecer modelos animales de lesión medular ^4,5. Con base en los mecanismos de lesión, los modelos de lesión de la médula espinal se clasifican como contusión, compresión, distracción, dislocación, transección o químico⁶. Entre ellos, los modelos de contusión, que utilizan fuerzas externas para desplazar y lesionar la médula espinal, son los más cercanos a la etiología clínica de la mayoría de los pacientes con lesión medular. Por lo tanto, el modelo de contusión ha sido utilizado por muchos investigadores en estudios de lesión medular ^3,7. Se utilizan varios instrumentos para desarrollar modelos de contusión por lesión de la médula espinal. El impactador multicéntrico de la Universidad de Nueva York (NYU) sobre lesiones medulares en animales (MASCIS) produce contusiones de lesiones medulares mediante un dispositivo de caída de peso⁸. Después de varias versiones actualizadas, el impactador MASCIS es ampliamente utilizado para desarrollar modelos animales de contusión por lesión medular⁹. Sin embargo, cuando la varilla de impacto de MASCIS cae y golpea la médula espinal, pueden producirse múltiples lesiones, lo que afecta al grado de lesión en los modelos de lesión medular. Además, lograr la precisión mecánica para garantizar la exactitud del instrumento y la repetibilidad del modelo de fabricación también es un desafío. Los impactadores de horizonte infinito causan contusiones controlando la fuerza aplicada a la médula espinal en lugar de gotas pesadas¹⁰. Utiliza una computadora conectada a un sensor para medir directamente la fuerza de impacto entre el impactador y la médula espinal. Cuando se alcanza el umbral, el impactador se retrae inmediatamente, evitando así el rebote del peso y mejorando la precisión^10,11. Sin embargo, el uso de esta modalidad de motricidad fina para infligir daño puede resultar en daño inconsistente y déficits funcionales⁶. El dispositivo de la Universidad Estatal de Ohio (OSU) comprime la superficie dorsal de la médula espinal a una velocidad transitoria mediante un controlador electromagnético^12,13. Este dispositivo es similar a los impactadores de horizonte infinito, ya que utiliza compresiones de corta distancia para causar lesiones de la médula espinal. Sin embargo, tiene varias limitaciones, ya que la determinación inicial del punto cero provocará errores debido a la presencia del líquido cefalorraquídeo ^6,14. En resumen, hay muchos instrumentos que se pueden utilizar para desarrollar modelos animales de contusión por lesión medular, pero todos tienen algunas limitaciones que conducen a una precisión y reproducibilidad insuficientes de los modelos animales. Por lo tanto, para crear de forma más precisa, cómoda y reproducible modelos de contusión de ratón de lesión medular, se necesita un impactador de lesión medular automatizado e inteligente.

Presentamos un nuevo impactador de lesiones de la médula espinal, el sistema inteligente de lesiones de la médula espinal de la Universidad de Guangzhou Jinan (sistema G smart SCI; Figura 1), para producir modelos de contusión por lesión medular. El dispositivo utiliza un telémetro láser como dispositivo de posicionamiento, combinado con una plataforma móvil automatizada para automatizar los golpes de acuerdo con los parámetros de impacto establecidos, incluida la velocidad de golpeo, la profundidad del golpe y el tiempo de permanencia. La operación automatizada reduce los factores humanos y mejora la precisión y la reproducibilidad de los modelos animales.

Protocolo

Los estudios con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Jinan.

1. Anestesia de animales y laminectomía espinal T10

1. Para este estudio, se utilizaron ratones C57/6J adultos jóvenes hembras de 8 semanas de edad. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg) y diazepam (5 mg/kg). Comprobar si la anestesia es exitosa indicada por la pérdida del reflejo del dolor. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.
2. Afeita el vello de la espalda de los ratones con una afeitadora para revelar la piel. Desinfectar la piel con tres rondas alternas de yodoforo y alcohol.
3. Realizar una incisión longitudinal medial de 2,5 cm en la piel dorsal con un bisturí y exponer la columna vertebral a nivel T9-T11 con unas pinzas.
4. Fijar bilateralmente las facetas T10 con un fijador espinal. Asegúrese de que la columna vertebral esté fijada de manera estable. Asegúrese de que los músculos paravertebrales estén despojados y elimine la apófisis espinosa, así como las láminas, utilizando un taladro de micromolienda para exponer la médula espinal del segmento T10.

2. Contusión de la médula espinal T10 con el sistema G smart SCI

1. Encienda el interruptor y espere a que el dispositivo vuelva automáticamente a su estado original. Coloque el fijador espinal en el sistema G smart SCI y asegúrelo con tornillos.
2. Con la pantalla táctil de operación (Figura 2A), establezca los parámetros de daño, incluida la velocidad de impacto (1 m/s), la profundidad de impacto (0,5 mm, 0,8 mm y 1,1 mm para tres conjuntos diferentes de ratones) y el tiempo de permanencia (500 ms)¹⁵.
3. Alinee el telémetro láser en el centro de la médula espinal expuesta moviendo la plataforma. (Figura 2B)
4. Haga clic en el botón Listo en la pantalla táctil (Figura 2C). El cabezal de impacto se ajustará automáticamente a una altura específica en función de los parámetros de configuración. La mesa portadora mueve automáticamente el sitio de impacto de la médula espinal por debajo de la cabeza de impacto.
5. Presione manualmente el cabezal de impacto para determinar aún más el sitio del impacto. Haga clic en el botón Inicio , la cabeza de impacto golpeará la médula espinal según los parámetros establecidos.
6. Retire a los ratones del dispositivo y observe bajo un microscopio estereoscópico (20x) para determinar la lesión de la médula espinal (Figura 3). Para determinar el éxito del desarrollo del modelo, observe la congestión local, el colapso y la ruptura de la membrana espinal.
7. Suturar el músculo, la fascia y la piel capa por capa utilizando suturas 3-0. Coloque los ratones en una caja tibia y espere su recuperación.

3. Cuidados postoperatorios

1. Inyectar meloxicam (5 mg/kg) por vía subcutánea diariamente durante 7 días después de la cirugía. Vacíe manualmente la vejiga cada 8 h hasta que se restablezcan las funciones de la vejiga.
2. A los 14 días después de la operación, retire los hilos de sutura.

4. Pruebas de los efectos de la lesión medular

1. Calcular las puntuaciones de BMS en ratones desde el primer día postoperatorio^16,17.
2. En el^30º día postoperatorio, realizar experimentos de comportamiento animal, incluyendo pasarela, falla del pie y rotarod^16,17. Pasarela: Distancia récord de 45 cm; Duración máxima de la ejecución 8 s; Ganancia de cámara 28.02; Umbral de intensidad 0,01. Fallo del pie: Registre 60 pasos para cada ratón. Rotarod: Velocidad 20 rpm. Registre el tiempo de caída del ratón y grábelo como 120 s durante más de 120 s.
3. En el 31º día postoperatorio, anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg) y diazepam (5 mg/kg) y luego sacrificar a los ratones por perfusión utilizando PFA al 4%. Retire la médula espinal con cuidado e intercepte 5 mm por encima y por debajo del sitio de la lesión para la inclusión en parafina. Realizar una sección de 5 μm del centro de la lesión medular del ratón y realizar la tinción de hematoxilina y eosina¹⁷.
4. Para el análisis estadístico utilice software comercial. Expresar los datos como media ± error estándar de la media (SEM) y compararlos utilizando ANOVA de un factor; p < 0,05 se consideró significativo.

Resultados

La laminectomía se realizó en 24 ratones hembra (8 semanas de edad) como se describió anteriormente. Los ratones del grupo simulado (n = 6) no fueron sometidos a lesión de la médula espinal, mientras que el resto de los ratones, incluidos el grupo de 0,5 mm (n = 6), el grupo de 0,8 mm (n = 6) y el grupo de 1,1 mm (n = 6) fueron sometidos a diferentes profundidades de pinzamiento de la médula espinal. Las puntuaciones de BMS se registraron regularmente hasta 1 mes después de la operación (Figu...

Discusión

La lesión de la médula espinal puede provocar déficits sensoriales y motores, lo que puede provocar graves deficiencias físicas y mentales. En China, la incidencia de lesiones de la médula espinal en diferentes provincias varía de 14,6 a 60,6 por millón¹⁸. El aumento de la prevalencia de la LME ejercerá más presión sobre el sistema sanitario. En la actualidad, existen pocas opciones de tratamiento eficaces para la lesión medular, las lesiones debido a que sus mecanismos patológicos y p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01M PBS (powder, pH7.2-7.4)	Solarbio Life Sciences	P1010
2,2,2-Tribromoethanol	Macklin	75-80-9
4% paraformaldehyde tissue fixative	Biosharp life science	BL539A
Biomicroscope	Leica	LCC50 HD
CatWalk	Noldus Information Technology	CatWalk XT 9.1
Cover glass	CITOTEST Scientific	10212432C
Embedding machine	Changzhou Zhongwei Electronic Instrument	BMJ-A
Ethanol absolute	DAMAO	64-17-5
FootFaultScan	Clever Sys Inc.	-
Glass slide	CITOTEST Scientific	80302-2104
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
micro-grinding drill	FEIYUBIO	19-7010
Mouse spinal fixator	RWD Life Science	68094
Paraffin microtome	Thermo	shandon finesse 325
RotaRod for Mice	Ugo Basile	47600
Stereomicroscope	KUY NICE	SZM-7045
Tert-Amyl alcohol	Macklin	75-85-4
Xylene	China National Pharmaceutical	#10023418