Impactor Automatizado para Modelo de Lesão Medular Contusão em Camundongos

Resumo

Apresentamos aqui um novo dispositivo de contusão de lesão medular automatizada para camundongos, que pode produzir com precisão modelos de contusão de lesão medular com diferentes graus.

Resumo

A lesão medular (LM) decorrente de lesões traumáticas, como acidentes automobilísticos e quedas, está associada à disfunção permanente da medula espinhal. A criação de modelos de contusão de lesão medular por impacto na medula espinhal resulta em patologias semelhantes à maioria das lesões medulares na prática clínica. Modelos animais precisos, reprodutíveis e convenientes de lesão medular são essenciais para o estudo da lesão medular. Apresentamos um novo dispositivo automatizado de contusão de lesão medular para camundongos, o sistema inteligente de lesão medular da Universidade de Guangzhou Jinan, que pode produzir modelos de contusão de lesão medular com precisão, reprodutibilidade e conveniência. O sistema produz com precisão modelos de diferentes graus de lesão medular por meio de sensores de distância a laser combinados com uma plataforma móvel automatizada e software avançado. Usamos esse sistema para criar três níveis de modelos de camundongos com lesão medular, determinamos seus escores na escala Basso de camundongos (BMS) e realizamos ensaios comportamentais e de coloração para demonstrar sua precisão e reprodutibilidade. Mostramos cada etapa do desenvolvimento dos modelos de lesão utilizando este dispositivo, formando um procedimento padronizado. Este método produz modelos reprodutíveis de contusão de lesão medular em camundongos e reduz os fatores de manipulação humana por meio de procedimentos convenientes de manuseio. O modelo animal desenvolvido é confiável para estudar os mecanismos de lesão medular e as abordagens de tratamento associadas.

Introdução

A lesão medular geralmente resulta em disfunção permanente da medula espinhal abaixo do segmento lesado. É causada principalmente por objetos que atingem a coluna vertebral e hiperextensão da coluna vertebral, como acidentes de trânsito e quedas¹. Devido à disponibilidade limitada de opções de tratamento eficazes para a lesão medular, a elucidação da patogênese das lesões medulares usando modelos animais será informativa para o desenvolvimento de abordagens de tratamento adequadas. O modelo de contusão da lesão medular causada por impacto na medula espinhal resulta no desenvolvimento de modelos animais com patologias semelhantes à maioria^{dos casos clínicos} de lesão medular2,3. Portanto, é importante produzir modelos animais precisos, reprodutíveis e convenientes para a contusão da lesão medular.

Desde a invenção de Allen do primeiro modelo animal de lesão medular em 1911, houve grandes avanços no desenvolvimento de instrumentos para o estabelecimento de modelos animais de lesão medular ^4,5. Com base nos mecanismos de lesão, os modelos de lesão medular são classificados em contusão, compressão, distração, luxação, transecção ou^química6. Dentre eles, os modelos de contusão, que utilizam forças externas para deslocar e lesar a medula espinhal, estão mais próximos da etiologia clínica da maioria dos pacientes com lesão medular. Portanto, o modelo de contusão tem sido utilizado por muitos investigadores^{em estudos de} lesão medular3,7. Vários instrumentos são utilizados para desenvolver modelos de contusão de lesão medular. O impactor MASCIS (Spinal Cord Injury Studies) multicêntrico da New York University (NYU) produz contusões de lesão medular por dispositivo de queda de peso⁸. Após várias versões atualizadas, o impactor MASCIS é amplamente utilizado no desenvolvimento^{de modelos animais} de contusão de lesão medular9. No entanto, quando a haste de impacto do MASCIS cai e atinge a medula espinhal, podem ocorrer múltiplas lesões, o que afeta o grau de lesão em modelos de lesão medular. Além disso, alcançar a precisão mecânica para garantir a precisão do instrumento e a repetibilidade do modelo de fabricação também é um desafio. Os impactores de horizonte infinito causam contusões controlando a força aplicada à medula espinhal ao invés de quedas pesadas¹⁰. Ele usa um computador conectado a um sensor para medir diretamente a força de impacto entre o pêndulo e a medula espinhal. Quando o limiar é atingido, o pêndulo é imediatamente retraído, evitando o rebote do peso e melhorando a acurácia^10,11. No entanto, o uso dessa modalidade motora fina para causar danos pode resultar em danos inconsistentes e déficits funcionais⁶. O dispositivo da Ohio State University (OSU) comprime a superfície dorsal da medula espinhal a uma taxa transitória por um driver eletromagnético^12,13. Este dispositivo é semelhante aos impactores de horizonte infinito, pois utiliza compressões de curta distância para causar lesões medulares. No entanto, apresenta várias limitações, pois a determinação inicial do ponto zero causará erros devido à presença do líquido cefalorraquidiano6,14. Em resumo, existem muitos instrumentos que podem ser usados para desenvolver modelos animais de contusão de lesão medular, mas todos eles têm algumas limitações que levam à acurácia e reprodutibilidade insuficientes dos modelos animais. Portanto, para criar modelos de contusão medular em camundongos de forma mais precisa, conveniente e reprodutível, é necessário um impactor de lesão medular automatizado e inteligente.

Apresentamos um novo impacto de lesão medular, o sistema inteligente de lesão medular da Universidade de Guangzhou Jinan (sistema de SCI inteligente G; Figura 1), para a produção de modelos de contusão de lesão medular. O dispositivo usa um telêmetro a laser como um dispositivo de posicionamento, combinado com uma plataforma móvel automatizada para automatizar golpes de acordo com parâmetros de ataque definidos, incluindo velocidade de ataque, profundidade de ataque e tempo de permanência. A operação automatizada reduz os fatores humanos e melhora a precisão e a reprodutibilidade dos modelos animais.

Protocolo

Os estudos envolvendo animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Jinan.

1. Anestesiização dos animais e laminectomia espinhal T10

1. Use camundongos C57/6J fêmeas adultas jovens de 8 semanas de idade para este estudo. Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg) e diazepam (5 mg/kg). Verifique se há sucesso na anestesia indicada pela perda do reflexo da dor. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento sob anestesia.
2. Raspe o cabelo na parte de trás dos ratos usando um barbeador para revelar a pele. Desinfete a pele com três rodadas alternadas de iodóforo e álcool.
3. Realizar incisão longitudinal medial de 2,5 cm no dorso da pele com bisturi e expor a coluna vertebral no nível de T9-T11 com pinça.
4. Fixar bilateralmente as facetas de T10 com fixador espinhal. Certifique-se de que a coluna esteja fixada de forma estável. Certifique-se de que os músculos paravertebrais sejam despojados e remova o processo espinhoso, bem como as lâminas usando broca de micro-retificação para expor a medula espinhal do segmento T10.

2. Contusão da medula espinhal T10 utilizando o sistema G smart SCI

1. Ligue o interruptor e aguarde até que o dispositivo retorne automaticamente ao seu estado original. Coloque o fixador espinhal no sistema G smart SCI e fixe-o usando parafusos.
2. Usando a tela sensível ao toque de operação (Figura 2A), defina parâmetros de dano, incluindo velocidade de impacto (1 m/s), profundidade de impacto (0,5 mm, 0,8 mm e 1,1 mm para três diferentes conjuntos de camundongos) e tempo de permanência (500 ms)¹⁵.
3. Alinhe o telêmetro a laser no centro da medula espinhal exposta movendo a plataforma. (Figura 2B)
4. Clique no botão Ready na tela sensível ao toque (Figura 2C). A cabeça de impacto se ajusta automaticamente a uma altura específica com base nos parâmetros de configuração. A mesa transportadora move automaticamente o local do impacto da medula espinhal abaixo da cabeça do impacto.
5. Pressione manualmente a cabeça de impacto para determinar melhor o local do impacto. Clique no botão Iniciar , a cabeça de impacto atingirá a medula espinhal com base nos parâmetros definidos.
6. Retirar os camundongos do aparelho e observar sob estereomicroscópio (20x) para determinar a lesão medular (Figura 3). Para determinar o sucesso do desenvolvimento do modelo, observe a congestão local, o colapso e a ruptura da membrana espinhal.
7. Sutura do músculo, fáscia e pele camada por camada com pontos 3-0. Coloque os ratos em uma caixa quente e aguarde sua recuperação.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Injetar meloxicam (5 mg/kg) por via subcutânea diariamente durante 7 dias após a cirurgia. Esvazie manualmente a bexiga a cada 8 h até que as funções da bexiga sejam restauradas.
2. Aos 14 dias após a operação, retirar os fios de sutura.

4. Testar os efeitos da lesão medular

1. Calcular os escores de SNF para camundongos a partir do primeiro dia de pós-operatório^16,17.
2. No 30º^{dia de} pós-operatório, realizar experimentos comportamentais com animais, incluindo passarela, foot fault e rotarod ^16,17. Passarela: Distância recorde de 45 cm; Duração máxima da corrida 8 s; Ganho de câmera 28,02; Limiar de intensidade 0,01. Falha no pé: Grave 60 passos para cada mouse. Rotarod: Velocidade 20 rpm. Registre o tempo para o mouse cair e registre-o como 120 s por mais de 120 s.
3. No 31º dia de pós-operatório, anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg) e diazepam (5 mg/kg) e, em seguida, sacrificar os camundongos por perfusão com PFA a 4%. Remova a medula espinhal cuidadosamente e intercepte 5 mm acima e abaixo do local da lesão para inclusão em parafina. Realizar corte de 5 μm do centro da lesão medular em camundongo e coloração por hematoxilina e eosina¹⁷.
4. Para análise estatística utilizar software comercial. Expresse os dados como média ± erro padrão da média (EPM) e compare usando ANOVA one-way; Considerou-se significativo < 0,05.

Resultados

A laminectomia foi realizada em 24 camundongos fêmeas (8 semanas de idade), conforme descrito acima. Os camundongos do grupo sham (n=6) não foram submetidos à lesão medular, enquanto o restante dos camundongos, incluindo os grupos 0,5 mm (n=6), 0,8 mm (n=6) e 1,1 mm (n=6), foram submetidos a diferentes profundidades de impacto medular. Os escores da SNF foram registrados regularmente até 1 mês de pós-operatório (Figura 4). Houve diferenças significativas nos escores pós-operatório...

Discussão

A lesão medular pode levar a déficits sensoriais e motores, que podem resultar em deficiências físicas e mentais graves. Na China, a incidência de lesões medulares em diferentes províncias varia de 14,6 a 60,6 por milhão¹⁸. O aumento da prevalência da LM colocará mais pressão sobre o sistema de saúde. Atualmente, existem limitadas opções de tratamento efetivo para a lesão medular, pois seus patomecanismos e processos de reparo ainda não estão totalmente^{esclarecid...}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01M PBS (powder, pH7.2-7.4)	Solarbio Life Sciences	P1010
2,2,2-Tribromoethanol	Macklin	75-80-9
4% paraformaldehyde tissue fixative	Biosharp life science	BL539A
Biomicroscope	Leica	LCC50 HD
CatWalk	Noldus Information Technology	CatWalk XT 9.1
Cover glass	CITOTEST Scientific	10212432C
Embedding machine	Changzhou Zhongwei Electronic Instrument	BMJ-A
Ethanol absolute	DAMAO	64-17-5
FootFaultScan	Clever Sys Inc.	-
Glass slide	CITOTEST Scientific	80302-2104
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
micro-grinding drill	FEIYUBIO	19-7010
Mouse spinal fixator	RWD Life Science	68094
Paraffin microtome	Thermo	shandon finesse 325
RotaRod for Mice	Ugo Basile	47600
Stereomicroscope	KUY NICE	SZM-7045
Tert-Amyl alcohol	Macklin	75-85-4
Xylene	China National Pharmaceutical	#10023418