Impacteur automatisé pour un modèle de lésion contusive de la moelle épinière chez la souris

Résumé

Voici un nouveau dispositif automatisé de contusion des lésions de la moelle épinière pour les souris, qui peut produire avec précision des modèles de contusion des lésions de la moelle épinière à des degrés divers.

Résumé

Les lésions de la moelle épinière dues à des blessures traumatiques telles que les accidents de voiture et les chutes sont associées à un dysfonctionnement permanent de la moelle épinière. La création de modèles de contusion de lésions de la moelle épinière par impact sur la moelle épinière entraîne des pathologies similaires à la plupart des lésions de la moelle épinière en pratique clinique. Des modèles animaux précis, reproductibles et pratiques de lésions de la moelle épinière sont essentiels pour étudier les lésions de la moelle épinière. Nous présentons un nouveau dispositif automatisé de contusion des lésions de la moelle épinière pour les souris, le système intelligent de lésions de la moelle épinière de l’Université Guangzhou Jinan, qui peut produire des modèles de contusion des lésions de la moelle épinière avec précision, reproductibilité et commodité. Le système produit avec précision des modèles de différents degrés de lésions de la moelle épinière via des capteurs de distance laser combinés à une plate-forme mobile automatisée et à un logiciel avancé. Nous avons utilisé ce système pour créer trois niveaux de modèles de souris atteintes de la moelle épinière, déterminé leurs scores à l’échelle de souris de Basso (BMS) et effectué des tests comportementaux et de coloration pour démontrer sa précision et sa reproductibilité. Nous montrons chaque étape du développement des modèles de blessures à l’aide de ce dispositif, formant une procédure standardisée. Cette méthode produit des modèles reproductibles de souris contusions de lésions de la moelle épinière et réduit les facteurs de manipulation humaine grâce à des procédures de manipulation pratiques. Le modèle animal développé est fiable pour étudier les mécanismes des lésions de la moelle épinière et les approches thérapeutiques associées.

Introduction

La lésion de la moelle épinière entraîne généralement un dysfonctionnement permanent de la moelle épinière sous le segment blessé. Elle est principalement causée par des objets frappant la colonne vertébrale et une hyperextension de la colonne vertébrale, tels que des accidents de la route et des chutes¹. En raison de la disponibilité limitée d’options de traitement efficaces pour les lésions de la moelle épinière, l’élucidation de la pathogenèse des lésions de la moelle épinière à l’aide de modèles animaux sera instructive pour le développement d’approches de traitement appropriées. Le modèle de contusion de lésion de la moelle épinière causée par un impact sur la moelle épinière aboutit au développement de modèles animaux présentant des pathologies similaires à la plupart des cas cliniques de lésion de la moelle épinière ^2,3. Par conséquent, il est important de produire des modèles animaux précis, reproductibles et pratiques pour la contusion de la lésion de la moelle épinière.

Depuis l’invention par Allen du premier modèle animal de lésion de la moelle épinière en 1911, il y a eu des progrès majeurs dans le développement d’instruments permettant d’établir des modèles animaux de lésion de la moelle épinière ^4,5. Sur la base des mécanismes de blessure, les modèles de lésions de la moelle épinière sont classés comme contusion, compression, distraction, luxation, transsection ou chimique⁶. Parmi eux, les modèles de contusion, qui utilisent des forces externes pour déplacer et blesser la moelle épinière, sont les plus proches de l’étiologie clinique de la plupart des patients atteints de lésions de la moelle épinière. Par conséquent, le modèle de contusion a été utilisé par de nombreux chercheurs dans des études sur les lésions de la moelle épinière ^3,7. Différents instruments sont utilisés pour développer des modèles de contusion des lésions de la moelle épinière. L’impacteur multicentrique de l’Université de New York (NYU) produit des contusions par un dispositif de perte de poids⁸. Après plusieurs versions mises à jour, l’impacteur MASCIS est largement utilisé pour développer des modèles animaux de contusion de la moelle épinière⁹. Cependant, lorsque la tige d’impact de MASCIS tombe et heurte la moelle épinière, de multiples blessures peuvent survenir, ce qui affecte le degré de blessure dans les modèles de lésions de la moelle épinière. De plus, il est également difficile d’atteindre la précision mécanique pour assurer la précision de l’instrument et la répétabilité du modèle de fabrication. Les impacteurs à horizon infini provoquent des contusions en contrôlant la force appliquée à la moelle épinière plutôt que des chutes lourdes¹⁰. Il utilise un ordinateur connecté à un capteur pour mesurer directement la force d’impact entre l’impacteur et la moelle épinière. Lorsque le seuil est atteint, l’élément de frappe est immédiatement rétracté, évitant ainsi le rebond du poids et améliorant la précision^10,11. Cependant, l’utilisation de cette modalité de motricité fine pour infliger des dommages peut entraîner des dommages incohérents et des déficits fonctionnels⁶. Le dispositif de l’Université d’État de l’Ohio (OSU) comprime la surface dorsale de la moelle épinière à un rythme transitoire par un pilote électromagnétique^12,13. Ce dispositif est similaire aux impacteurs à horizon infini, car il utilise des compressions à courte distance pour provoquer des lésions de la moelle épinière. Cependant, il présente diverses limites dans la mesure où la détermination initiale du point zéro entraînera des erreurs dues à la présence du liquide céphalo-rachidien ^6,14. En résumé, il existe de nombreux instruments qui peuvent être utilisés pour développer des modèles animaux de contusion de lésion de la moelle épinière, mais ils ont tous certaines limites qui conduisent à une précision et une reproductibilité insuffisantes des modèles animaux. Par conséquent, afin de créer de manière plus précise, pratique et reproductible des modèles de contusion chez la souris de lésion de la moelle épinière, un impacteur automatisé et intelligent pour les lésions de la moelle épinière est nécessaire.

Nous présentons un nouvel impacteur de lésions de la moelle épinière, le système intelligent de lésions de la moelle épinière de l’Université Guangzhou Jinan (système G smart SCI ; Figure 1), pour produire des modèles de contusion des lésions de la moelle épinière. L’appareil utilise un télémètre laser comme dispositif de positionnement, combiné à une plate-forme mobile automatisée pour automatiser les frappes en fonction des paramètres de frappe définis, y compris la vitesse de frappe, la profondeur de frappe et le temps de séjour. Le fonctionnement automatisé réduit les facteurs humains et améliore la précision ainsi que la reproductibilité des modèles animaux.

Protocole

Les études impliquant des animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique de l’Université de Jinan.

1. Anesthésie des animaux et laminectomie spinale T10

1. Utilisez des souris C57/6J femelles jeunes adultes âgées de 8 semaines pour cette étude. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg) et de diazépam (5 mg/kg). Vérifiez si l’anesthésie est réussie et indiquée par une perte du réflexe de douleur. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
2. Rasez les poils sur le dos des souris à l’aide d’un rasoir pour révéler la peau. Désinfectez la peau avec trois cycles alternés d’iodophore et d’alcool.
3. Faites une incision longitudinale médiale de 2,5 cm dans la peau dorsale à l’aide d’un scalpel et exposez la colonne vertébrale au niveau T9-T11 à l’aide d’une pince à épiler.
4. Fixez bilatéralement les facettes T10 à l’aide d’un fixateur vertébral. Assurez-vous que la colonne vertébrale est fixée de manière stable. Assurez-vous que les muscles paravertébraux sont dénudés et retirez l’apophyse épineuse ainsi que les lames à l’aide d’une perceuse à micro-meulage pour exposer la moelle épinière du segment T10.

2. Contusion de la moelle épinière T10 à l’aide du système G smart SCI

1. Allumez le commutateur et attendez que l’appareil revienne automatiquement à son état d’origine. Placez le fixateur vertébral dans le système G smart SCI et fixez-le à l’aide de vis.
2. À l’aide de l’écran tactile de fonctionnement (Figure 2A), définissez les paramètres de dommage, y compris la vitesse d’impact (1 m/s), la profondeur d’impact (0,5 mm, 0,8 mm et 1,1 mm pour trois ensembles de souris différents) et le temps d’arrêt (500 ms)¹⁵.
3. Alignez le télémètre laser au centre de la moelle épinière exposée en déplaçant la plate-forme. (Figure 2B)
4. Cliquez sur le bouton Prêt sur l’écran tactile (Figure 2C). La tête d’impact s’ajustera automatiquement à une hauteur spécifique en fonction des paramètres de réglage. La table de support déplace automatiquement le site d’impact de la moelle épinière sous la tête d’impact.
5. Appuyez manuellement sur la tête d’impact pour déterminer davantage le site d’impact. Cliquez sur le bouton Démarrer , la tête d’impact frappera la moelle épinière en fonction des paramètres définis.
6. Retirez les souris de l’appareil et observez-les sous un stéréomicroscope (20x) pour déterminer les lésions de la moelle épinière (Figure 3). Pour déterminer le succès du développement du modèle, observez la congestion locale, l’effondrement et la rupture de la membrane vertébrale.
7. Suturez le muscle, le fascia et la peau couche par couche à l’aide de sutures 3-0. Placez les souris dans une boîte chaude et attendez leur récupération.

3. Soins postopératoires

1. Injecter quotidiennement du méloxicam (5 mg/kg) par voie sous-cutanée pendant 7 jours après la chirurgie. Videz manuellement la vessie toutes les 8 h jusqu’à ce que les fonctions de la vessie soient rétablies.
2. 14 jours après l’opération, retirez les fils de suture.

4. Tester les effets d’une lésion de la colonne vertébrale

1. Calculez les scores BMS pour les souris à partir du premier jour postopératoire ^16,17.
2. Le 30^e jour postopératoire, effectuez des expériences comportementales sur les animaux, y compris les passerelles, les fautes de pied et le rotarod^16,17. Passerelle : Distance record de 45 cm ; Durée maximale de fonctionnement 8 s ; Gain de la caméra 28,02 ; Seuil d’intensité 0,01. Faute de pied : Enregistrez 60 pas pour chaque souris. Rotation : Vitesse 20 tr/min. Enregistrez le temps de chute de la souris et enregistrez-le à 120 s pendant plus de 120 s.
3. Le 31e jour postopératoire, anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg) et de diazépam (5 mg/kg), puis euthanasier les souris par perfusion avec 4 % de PFA. Retirez soigneusement la moelle épinière et interceptez 5 mm au-dessus et au-dessous du site de la blessure pour l’enrobage de paraffine. Faites une coupe de 5 μm du centre de la lésion de la moelle épinière de la souris et effectuez une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine¹⁷.
4. Pour l’analyse statistique, utilisez un logiciel commercial. Exprimer les données sous forme de moyenne ± d’erreur-type de la moyenne (MEB) et comparer à l’aide d’une ANOVA à un facteur ; P < 0,05 a été considéré comme significatif.

Résultats

La laminectomie a été réalisée sur 24 souris femelles (âgées de 8 semaines) comme décrit ci-dessus. Les souris du groupe placebo (n = 6) n’ont pas été soumises à des lésions de la moelle épinière, tandis que le reste des souris, y compris le groupe de 0,5 mm (n = 6), le groupe de 0,8 mm (n = 6) et le groupe de 1,1 mm (n = 6) ont été soumis à différentes profondeurs de conflit de la moelle épinière. Les scores BMS ont été régulièrement enregistrés jusqu’à 1 mois postopératoire (

Discussion

Les lésions de la moelle épinière peuvent entraîner des déficits sensoriels et moteurs, ce qui peut entraîner de graves déficiences physiques et mentales. En Chine, l’incidence des lésions de la moelle épinière dans les différentes provinces varie de 14,6 à 60,6 par million¹⁸. L’augmentation de la prévalence des lésions médullaires exercera une pression accrue sur le système de santé. Actuellement, il existe peu d’options de traitement efficaces pour les lésions de la moell...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01M PBS (powder, pH7.2-7.4)	Solarbio Life Sciences	P1010
2,2,2-Tribromoethanol	Macklin	75-80-9
4% paraformaldehyde tissue fixative	Biosharp life science	BL539A
Biomicroscope	Leica	LCC50 HD
CatWalk	Noldus Information Technology	CatWalk XT 9.1
Cover glass	CITOTEST Scientific	10212432C
Embedding machine	Changzhou Zhongwei Electronic Instrument	BMJ-A
Ethanol absolute	DAMAO	64-17-5
FootFaultScan	Clever Sys Inc.	-
Glass slide	CITOTEST Scientific	80302-2104
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
micro-grinding drill	FEIYUBIO	19-7010
Mouse spinal fixator	RWD Life Science	68094
Paraffin microtome	Thermo	shandon finesse 325
RotaRod for Mice	Ugo Basile	47600
Stereomicroscope	KUY NICE	SZM-7045
Tert-Amyl alcohol	Macklin	75-85-4
Xylene	China National Pharmaceutical	#10023418