Automatisierter Impaktor für das Modell einer kontusiven Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Zusammenfassung

Hier wird ein neuartiges automatisiertes Gerät zur Quetschung von Rückenmarksverletzungen für Mäuse vorgestellt, das Modelle für Rückenmarksverletzungen mit unterschiedlichem Grad genau herstellen kann.

Zusammenfassung

Rückenmarksverletzungen (SCI) aufgrund traumatischer Verletzungen wie Autounfälle und Stürze sind mit einer dauerhaften Rückenmarksfunktionsstörung verbunden. Die Erstellung von Kontusionsmodellen für Rückenmarksverletzungen durch Aufprall auf das Rückenmark führt zu ähnlichen Pathologien wie die meisten Rückenmarksverletzungen in der klinischen Praxis. Genaue, reproduzierbare und praktische Tiermodelle von Rückenmarksverletzungen sind für die Untersuchung von Rückenmarksverletzungen unerlässlich. Wir präsentieren ein neuartiges automatisiertes Gerät zur Quetschung von Rückenmarksverletzungen für Mäuse, das intelligente Rückenmarksverletzungssystem der Guangzhou Jinan University, das Modelle für Rückenmarksverletzungen mit Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Komfort erstellen kann. Das System erstellt präzise Modelle unterschiedlicher Grade von Rückenmarksverletzungen über Laser-Abstandssensoren in Kombination mit einer automatisierten mobilen Plattform und fortschrittlicher Software. Wir verwendeten dieses System, um drei Ebenen von Mäusemodellen für Rückenmarksverletzungen zu erstellen, ihre Basso-Mausskala (BMS)-Werte zu bestimmen und Verhaltens- und Färbetests durchzuführen, um ihre Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu demonstrieren. Wir zeigen jeden Schritt der Entwicklung der Verletzungsmodelle mit diesem Gerät und bilden ein standardisiertes Verfahren. Diese Methode erzeugt reproduzierbare Mausmodelle für Rückenmarksverletzungen und reduziert menschliche Manipulationsfaktoren durch bequeme Handhabungsverfahren. Das entwickelte Tiermodell ist zuverlässig für die Untersuchung von Mechanismen der Rückenmarksverletzung und der damit verbundenen Behandlungsansätze.

Einleitung

Eine Rückenmarksverletzung führt in der Regel zu einer dauerhaften Dysfunktion des Rückenmarks unterhalb des verletzten Segments. Es wird hauptsächlich durch Gegenstände verursacht, die auf die Wirbelsäule treffen, und durch Überstreckung der Wirbelsäule, wie Verkehrsunfälle und Stürze¹. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit wirksamer Behandlungsmöglichkeiten für Querschnittlähmungsverletzungen wird die Aufklärung der Pathogenese von Querschnittlähmungen im Tiermodell für die Entwicklung geeigneter Behandlungsansätze aufschlussreich sein. Das Kontusionsmodell der Rückenmarksverletzung, die durch einen Aufprall auf das Rückenmark verursacht wird, führt zur Entwicklung von Tiermodellen mit ähnlichen Pathologien wie die meisten klinischen Fälle von Rückenmarksverletzungen ^2,3. Daher ist es wichtig, genaue, reproduzierbare und praktische Tiermodelle für Rückenmarksverletzungen herzustellen.

Seit Allens Erfindung des ersten Tiermodells für Rückenmarksverletzungen im Jahr 1911 gab es große Fortschritte bei der Entwicklung von Instrumenten zur Erstellung von Tiermodellen für Rückenmarksverletzungen ^4,5. Basierend auf Verletzungsmechanismen werden Rückenmarksverletzungsmodelle als Prellung, Kompression, Distraktion, Luxation, Durchtrennung oder chemisch^{klassifiziert 6}. Unter ihnen kommen die Kontusionsmodelle, die äußere Kräfte verwenden, um das Rückenmark zu verschieben und zu verletzen, der klinischen Ätiologie der meisten Patienten mit Rückenmarksverletzungen am nächsten. Daher wurde das Prellungsmodell von vielen Forschern in Studien zu Rückenmarksverletzungen verwendet ^3,7. Verschiedene Instrumente werden verwendet, um Modelle für Rückenmarksverletzungen zu entwickeln. Der multizentrische MASCIS-Impaktor (Animal Spinal Cord Injury Studies) der New York University (NYU) erzeugt Rückenmarksverletzungen mit einem Gewichtsabfallgerät⁸. Nach mehreren aktualisierten Versionen wird der MASCIS Impaktor häufig zur Entwicklung von Tiermodellen für Rückenmarksverletzungen verwendet⁹. Wenn der Aufprallstab von MASCIS jedoch fällt und auf das Rückenmark trifft, können mehrere Verletzungen auftreten, was sich auf den Verletzungsgrad bei Rückenmarksverletzungsmodellen auswirkt. Darüber hinaus ist es auch eine Herausforderung, mechanische Präzision zu erreichen, um die Genauigkeit des Instruments und die Wiederholbarkeit des Fertigungsmodells zu gewährleisten. Die Stößel mit unendlichem Horizont verursachen Prellungen, indem sie die auf das Rückenmark ausgeübte Kraft kontrollieren und nicht schwere Stürze¹⁰. Es verwendet einen Computer, der mit einem Sensor verbunden ist, um die Aufprallkraft zwischen dem Schlagkörper und dem Rückenmark direkt zu messen. Wenn der Schwellenwert erreicht ist, wird der Schlagkörper sofort eingefahren, wodurch ein Rückprall des Gewichts vermieden und die Genauigkeit verbessert^{wird 10,11}. Die Verwendung dieser feinmotorischen Modalität zur Verursachung von Schäden kann jedoch zu inkonsistenten Schäden und funktionellen Defiziten führen⁶. Das Gerät der Ohio State University (OSU) komprimiert die dorsale Oberfläche des Rückenmarks mit einer transienten Rate durch einen elektromagnetischen Treiber^12,13. Dieses Gerät ähnelt den Stößen mit unendlichem Horizont, da es Kompressionen über kurze Entfernungen verwendet, um Rückenmarksverletzungen zu verursachen. Es hat jedoch verschiedene Einschränkungen, da die anfängliche Bestimmung des Nullpunkts aufgrund des Vorhandenseins der Zerebrospinalflüssigkeit zu Fehlern führt ^6,14. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es viele Instrumente gibt, die zur Entwicklung von Tiermodellen für Rückenmarksverletzungen verwendet werden können, aber sie alle haben einige Einschränkungen, die zu einer unzureichenden Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Tiermodellen führen. Um genauere, bequemere und reproduzierbarere Modelle von Maus-Kontusionsmodellen für Rückenmarksverletzungen zu erstellen, wird daher ein automatisierter und intelligenter Schlagkörper für Rückenmarksverletzungen benötigt.

Wir präsentieren einen neuartigen Impaktor für Rückenmarksverletzungen, das intelligente Rückenmarksverletzungssystem der Guangzhou Jinan University (G smart SCI-System; Abbildung 1) zur Erstellung von Modellen für Rückenmarksverletzungen verwendet wurden. Das Gerät verwendet einen Laser-Entfernungsmesser als Positionierungsgerät, kombiniert mit einer automatisierten mobilen Plattform, um Schläge gemäß den eingestellten Schlagparametern zu automatisieren, einschließlich Schlaggeschwindigkeit, Schlagtiefe und Verweilzeit. Der automatisierte Betrieb reduziert menschliche Faktoren und verbessert die Genauigkeit sowie Reproduzierbarkeit von Tiermodellen.

Protokoll

Die Studien mit Tieren wurden von der Ethikkommission der Universität Jinan geprüft und genehmigt.

1. Betäubung von Tieren und T10-Laminektomie

1. Verwenden Sie für diese Studie 8 Wochen alte weibliche junge erwachsene C57/6J-Mäuse. Betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg) und Diazepam (5 mg/kg). Überprüfen Sie, ob eine erfolgreiche Anästhesie durch den Verlust des Schmerzreflexes angezeigt wird. Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
2. Rasieren Sie die Haare auf dem Rücken der Mäuse mit einem Rasierer, um die Haut freizulegen. Desinfizieren Sie die Haut mit drei abwechselnden Runden Jodophor und Alkohol.
3. Machen Sie mit einem Skalpell einen 2,5 cm langen Schnitt in der Rückenhaut und legen Sie die Wirbelsäule mit einer Pinzette auf Höhe T9-T11 frei.
4. Bindseitige Fixierung von T10-Facetten mit einem Wirbelsäulenfixateur. Stellen Sie sicher, dass die Wirbelsäule stabil fixiert ist. Stellen Sie sicher, dass die paravertebralen Muskeln abgestreift sind, und entfernen Sie den Dornfortsatz sowie die Laminae mit einem Mikroschleifbohrer, um das Rückenmark des T10-Segments freizulegen.

2. Prellung des T10-Rückenmarks mit dem G smart SCI-System

1. Schalten Sie den Schalter ein und warten Sie, bis das Gerät automatisch in seinen ursprünglichen Zustand zurückkehrt. Setzen Sie den Wirbelsäulenfixateur in das G smart SCI-System ein und befestigen Sie ihn mit Schrauben.
2. Stellen Sie über den Touchscreen (Abbildung 2A) Schadensparameter ein, einschließlich Aufprallgeschwindigkeit (1 m/s), Aufpralltiefe (0,5 mm, 0,8 mm und 1,1 mm für drei verschiedene Mäusesätze) und Verweilzeit (500 ms)¹⁵.
3. Richten Sie den Laser-Entfernungsmesser in der Mitte des freiliegenden Rückenmarks aus, indem Sie die Plattform bewegen. (Abbildung 2B)
4. Klicken Sie auf dem Touchscreen auf die Schaltfläche Ready (Bereit) (Abbildung 2C). Der Schlagkopf passt sich basierend auf den Einstellparametern automatisch an eine bestimmte Höhe an. Der Trägertisch bewegt automatisch die Aufprallstelle des Rückenmarks unter den Aufprallkopf.
5. Drücken Sie manuell auf den Aufprallkopf, um die Aufprallstelle weiter zu bestimmen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , der Aufprallkopf trifft basierend auf den eingestellten Parametern auf das Rückenmark.
6. Nehmen Sie die Mäuse aus dem Gerät und beobachten Sie sie unter einem Stereomikroskop (20x), um eine Rückenmarksverletzung festzustellen (Abbildung 3). Um den Erfolg der Modellentwicklung zu bestimmen, beobachten Sie lokale Stauungen, Kollaps und Wirbelsäulenmembranrupturen.
7. Vernähen Sie Muskeln, Faszien und Haut Schicht für Schicht mit 3-0-Nähten. Legen Sie die Mäuse in eine warme Box und warten Sie, bis sie sich erholt haben.

3. Nachsorge

1. Injizieren Sie Meloxicam (5 mg/kg) 7 Tage nach der Operation täglich subkutan. Entleeren Sie die Blase alle 8 Stunden manuell, bis die Blasenfunktionen wiederhergestellt sind.
2. Entfernen Sie 14 Tage nach der Operation die Nahtfäden.

4. Testen der Auswirkungen von Wirbelsäulenverletzungen

1. Berechnen Sie die BMS-Werte für Mäuse ab dem ersten postoperativen Tag ^16,17.
2. Führen Sie am 30^. postoperativen Tag Tierverhaltensexperimente durch, einschließlich Laufsteg, Fußfehler und Rotarod^16,17. Laufsteg: Rekordabstand von 45 cm; Maximale Laufzeit 8 s; Kameragewinn 28,02; Intensitätsschwelle 0,01. Fußfehler: Zeichnen Sie 60 Schritte für jede Maus auf. Rotarod: Drehzahl 20 U/min. Notieren Sie die Zeit, bis die Maus fällt, und zeichnen Sie sie als 120 s für mehr als 120 s auf.
3. Am 31. postoperativen Tag werden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg) und Diazepam (5 mg/kg) betäubt und anschließend durch Perfusion mit 4% PFA eingeschläfert. Entfernen Sie das Rückenmark vorsichtig und fangen Sie 5 mm über und unter der Verletzungsstelle ab, um Paraffin einzubetten. Machen Sie einen 5-μm-Schnitt in der Mitte der Rückenmarksverletzung der Maus und führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung^{durch 17}.
4. Verwenden Sie für statistische Analysen kommerzielle Software. Expressieren Sie die Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) und vergleichen Sie sie mit einer unidirektionalen ANOVA; p < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Ergebnisse

Die Laminektomie wurde an 24 weiblichen Mäusen (8 Wochen alt) wie oben beschrieben durchgeführt. Mäuse in der Scheingruppe (n = 6) wurden keiner Rückenmarksverletzung unterzogen, während der Rest der Mäuse, einschließlich der 0,5-mm-Gruppe (n = 6), der 0,8-mm-Gruppe (n = 6) und der 1,1-mm-Gruppe (n = 6), unterschiedlichen Tiefen des Rückenmarksimpingements ausgesetzt war. Die BMS-Werte wurden regelmäßig bis 1 Monat postoperativ aufgezeichnet (Abbildung 4). Es gab signifikante Unter...

Diskussion

Eine Querschnittlähmung kann zu sensorischen und motorischen Defiziten führen, die schwere körperliche und geistige Beeinträchtigungen zur Folge haben können. In China schwankt die Inzidenz von Rückenmarksverletzungen in verschiedenen Provinzen zwischen 14,6 und 60,6 pro Million¹⁸. Die Zunahme der Prävalenz von Querschnittlähmung wird das Gesundheitssystem stärker unter Druck setzen. Derzeit gibt es nur begrenzte wirksame Behandlungsmöglichkeiten für Rückenmarksverletzungen und Verletz...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01M PBS (powder, pH7.2-7.4)	Solarbio Life Sciences	P1010
2,2,2-Tribromoethanol	Macklin	75-80-9
4% paraformaldehyde tissue fixative	Biosharp life science	BL539A
Biomicroscope	Leica	LCC50 HD
CatWalk	Noldus Information Technology	CatWalk XT 9.1
Cover glass	CITOTEST Scientific	10212432C
Embedding machine	Changzhou Zhongwei Electronic Instrument	BMJ-A
Ethanol absolute	DAMAO	64-17-5
FootFaultScan	Clever Sys Inc.	-
Glass slide	CITOTEST Scientific	80302-2104
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
micro-grinding drill	FEIYUBIO	19-7010
Mouse spinal fixator	RWD Life Science	68094
Paraffin microtome	Thermo	shandon finesse 325
RotaRod for Mice	Ugo Basile	47600
Stereomicroscope	KUY NICE	SZM-7045
Tert-Amyl alcohol	Macklin	75-85-4
Xylene	China National Pharmaceutical	#10023418